Name: Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Öğrenin, hasta kaynaklı primer kanser hücrelerinden 3D tümör sferoidleri oluşturmayı ve ilaç duyarlılığını değerlendirmeyi. Bu yöntem, kişiselleştirilmiş kanser tedavisi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Primer tümör hücre kültürleri için kullanılan insan tümör örneklerinin toplanması, Rabin Tıp Merkezi'nde kurumsal inceleme kurulu (IRB) onaylı protokollere göre, hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınarak gerçekleştirildi. Çalışmaya katılmaya uygun hastalar arasında metastatik olmayan meme, kolon, karaciğer, akciğer, nöroendokrin, yumurtalık veya pankreas kanseri, herhangi bir pediatrik kanser veya herhangi bir metastatik kanseri olan erkek ve kadın yetişkin ve pediatrik kanser hastaları vardı. Tek dışlama kriteri, bilgilendirilmiş onam sağlama kapasitesinin olmamasıydı.
1. Sferoidlerin üretimi ve toplanması
NOT: Primer tümör hücrelerinin izolasyonu Kodak ve ark.8 tarafından tarif edildiği gibi gerçekleştirilebilir. Önemli olarak, sferoidleri üretmek için kullanılan primer tümör hücreleri, doğrudan biyopsi, rezeksiyon vb. ile elde edilen hasta örneklerinden veya Moskovits ve ark.9 tarafından tanımlandığı gibi, hasta kaynaklı ksenograft (PDX) modellerinden tümör örnekleri kullanılarak dolaylı olarak türetilebilir.
<ol><li>Tek hücreli yapışkan primer hücre kültürüne sahip küçük bir şişe (T25) alarak, hücre kültürü ortamını çıkararak, PBS ile yıkayarak ve daha sonra 37 ° C'de 3 dakika boyunca 1 mL 1x Accutase (bir hücre ayırma çözeltisi) ekleyerek ( Malzeme Tablosuna bakınız) %75-%100 birleşimli yapışkan primer tümör hücre kültürlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlayın.</li>
	<li>5 mL hücre kültürü ortamı ekleyerek Accutase çözeltisini nötralize edin (% 10 FBS, 1:100 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamı; Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Hücreleri 10 mL'lik bir serolojik pipetle aspire edin ve 15 mL'lik bir konik tüpte biriktirin. Tüpü 800 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını çıkarın, hücre peletinin üzerine 5 mL taze hücre kültürü ortamı ekleyin ve yavaşça karıştırın.</li>
	<li>Canlı hücreleri bir hemositometre10 ile sayın. Bunu yapmak için, hücre süspansiyonunun 50 μL'lik bir alikotunu alın ve 50 μL tripan mavisi ile karıştırın. Canlı hücreleri (mavi renk için negatif olan hücreler) sayın ve süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısını hesaplayın.</li>
	<li>Bir "3D kültür ortamı" hazırlayın (% 5 bazal membran matrisi ile desteklenmiş bir hücre kültürü ortamı; Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: "3D kültür ortamı" oda sıcaklığında sıvı gibidir. 37 ° C'de, tutarlılık daha jel benzeri hale gelir (böylece hücreler birlikte kalır), ancak yine de pipetlenebilir (sadece% 5 bazal membran matrisi içerdiğinden).</li>
	<li>Tahlil için gereken hücre sayısını ve gereken toplam hacmi hesaplayın; her bir kuyucuk 200 μL ortamda 2.000-8.000 hücre içermelidir.</li>
	<li>"3B kültür ortamının" 200 μL'sinde istenen sayıda hücreye (örneğin, 4.000 hücre) sahip bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve homojen bir dağılım sağlamak için pipetle hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Süspansiyonu bir pipetleme haznesine aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, ultra düşük 96 delikli bir bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin (bkz. Hücrelerin her toplanmasından önce, süspansiyonu iyice karıştırın.</li>
	<li>Hücrelerin kümelenmesini zorlamak için plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin, böylece hücre agregasyonunu iyileştirin ve plakayı% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Her 2-3 günde bir, "3D kültür ortamını" yenileyin. Plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin, ortamın %50'sini (100 μL) nazikçe çıkarın ve atın ve mevcut çözeltiyi değiştirmek için 100 μL taze "3D kültür ortamı" ekleyin. 1.11. adımı tekrarlayın ve plakayı 37 ° C, % 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin. NOT: Ortamın çıkarılması, plaka 45°'de tutulduğunda yapılmalı ve hücrelerin toplanmasını önlemek için ortam sadece üst kısımdan toplanmalıdır. Vakum emme sistemi kullanılmamalıdır. Taze ortam, oluşmaya başlamış olan sferoidleri bozmamak için yavaş ve nazikçe eklenmelidir.</li>
	<li>Sferoid oluşumu izlemek için hücreleri her 1-2 günde bir mikroskop altında inceleyin. Görüntüleme yazılımındaki "ölçek" aracı kullanılarak oluşturulan kürelerin çapını ölçün ( Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Mikroskobik inceleme öncelikle zaman ilerledikçe küresel bir şekil alan düzensiz yuvarlak-oval cisimleri ortaya çıkarmalıdır11,12.<ol><li>Küresel çap 100-200 μm'ye ulaştığında, ilaç etkinlik deneylerini gerçekleştirin. NOT: İlaç etkinliği deneyleri, sferoidler bu çapa ulaştığında gerçekleştirilir, çünkü o sırada hücrelerin çoğunluğu çoğalır, bu da tedaviye yanıtı değerlendirmeye elverişlidir. Daha büyük çaplı sferoidler nekrotik bir çekirdek ve sessiz bir tabaka11,12 içerir, bu da tedaviye yanıt veren çoğalan hücrelerin daha küçük bir oranı ile sonuçlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Sferoid toplama için, her bir kuyucuktan küreleri toplamak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanın ve bunları 15 mL'lik bir konik tüpe koyun. NOT: Sferoidler doğası gereği kırılgandır ve nazik kullanım gerektirir. Ortamı sferoidlerle birlikte konik tüpe aktarırken, tüpü 45 ° C'de tutun ve tüpün duvarında yavaşça pipet yapın. Sferoidler gözle görülebilir.</li>
	<li>Konik tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamının 0.5 mL'sini ekleyin ve peleti iyi ama nazikçe yeniden askıya alın. Kabarcık yapmaktan kaçının.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek küresel sayım gerçekleştirin.<ol><li>96 delikli bir plaka kullanın ve kuyuyu kadranlara bölmek için kuyunun alt tarafına bir artı işareti çizin (sayımı izlemeye yardımcı olmak için).</li>
		<li>Kuyuya 50 μL süspansiyon ekleyin ve sferoidleri mikroskop altında manuel olarak sayın (10x objektif lens kullanarak).</li>
		<li>Her kadrandaki sferoidleri sayın, iki kez saymamaya dikkat edin ve kuyudaki toplam sferoid sayısını hesaplayın. NOT: Sayımın doğruluğu için, bir kuyuda en az 50 sferoid sayın. 50'den az sferoid varsa, homojen dağılımı sağlamak için süspansiyonu yavaşça karıştırın ve yeni bir kuyucuğa eklenen süspansiyonun daha büyük bir hacmini kullanarak tekrar sayın. Alternatif olarak, bir kuyuda 50'den az sferoid varsa, sferoidler santrifüj edilebilir ve <0,5 mL'lik bir hacimde yavaşça yeniden askıya alınabilir. 100'den fazla sferoid varsa, sferoid süspansiyona hücre kültürü ortamı ekleyin, yavaşça karıştırın ve anlatın.</li>
		<li>Küresel konsantrasyonu hesaplayın (küresel sayım/sayma hacmi [μL]) ve ardından süspansiyondaki toplam sferoid sayısını hesaplayın (küresel konsantrasyon × toplam hacim).</li>
	</ol></li>
</ol>2. İlaç etkinliği testi (MTT testi)
NOT: Ayrıntılar için lütfen van Meerloo et al.13'e bakınız. Ayrıca, MTT testi için, "3D kültür ortamı" değil, yalnızca hücre kültürü ortamı kullanılmalıdır (bazal membran matrisinin eklenmesi gerekli değildir ve MTT testine potansiyel olarak müdahale edebilir).
<ol><li>Yeni bir tüpte, 200 μL hücre kültürü ortamı başına 200 sferoid konsantrasyonunda bir sferoid süspansiyonu hazırlayın (% 10 FBS, 1:100 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamı).<ol><li>Her ilaç tedavisi için, 15 mL'lik bir tüpte bir sferoid stoğu hazırlayın. Her ilaç için gereken miktarı, tekrarlar için gereken kuyucuk sayısına göre hesaplayın: (5-8) × 200 μL. İlacı, tüpe gereken son konsantrasyona ekleyin. NOT: Bu çalışmada kullanılan ilaçlar ve dozajları ile ilgili temsili sonuçlar bölümüne bakınız. Ayrıca, ilaçların ticari detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>Küresel süspansiyonun 200 μL'sini ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarın ve plakayı% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Tahlil için 96 delikli plakanın dış sıralarını ve sütunlarını kullanmayın, çünkü bu kuyucuklar, tekrarlanan deneyler arasında artan değişkenliğe yol açabilecek artan buharlaşma ile karakterize edilir; bunun yerine, bu kuyulara PBS ekleyin. NOT: Sferoidlerin kültürünün, kültür 96 delikli plakaya aktarılmadan önce homojen olması önemlidir. Ayrıca, her deneye bir kontrol koşulu (yani, işlenmemiş sferoidler) dahil edilmelidir.</li>
	<li>Sferoidleri 24-72 saat boyunca çalışma ilacı ile inkübe ettikten sonra, plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve hücre kültürü ortamının 170 μL'sini yavaşça çıkarın, kuyunun dibinde 30 μL (sferoidleri içerir) bırakın. NOT: 170 μL hücre kültürü ortamının çıkarılması, sferoidlerin çıkarılmaması için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Plakayı 45°'de tutun ve bir elinizi (kontrast için koyu renkli bir eldiven giyerek) kuyucukların altına yerleştirin, böylece sferoidler görünür hale gelir (beyaz noktalar).</li>
	<li>MTT çözeltisini hazırlayın (fenol içermeyen RPMI'da 0.714 mg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Her bir kuyucuğa, kuyu başına 100 μL'lik son bir hacme 70 μL MTT çözeltisi ekleyin (kuyudaki son MTT konsantrasyonu, 100 μL başına 0.05 mg olacaktır). Ek olarak, hücresiz MTT çözeltisi ile "Boş" kuyular hazırlayın. NOT: MTT ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, davlumbazdaki ışık kapatılmalı ve MTT çözeltisini içeren tüp alüminyum folyo ile kaplanmalıdır.</li>
	<li>Kuyucuklardaki çözeltinin renginde bir değişiklik gözlenene kadar plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 3-4 saat boyunca inkübe edin (mor renk canlı hücreleri temsil eder).</li>
	<li>Bir değişiklik gözlendiğinde, her bir kuyucuğa 100 μL durdurma çözeltisi (izopropanolde 0.1N HCl) ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan kuyucukların içeriğini hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Plakanın bir Florometre-ELISA okuyucusunda ( Malzeme Tablosuna bakınız) 570 nm dalga boyunda ve 630-690 nM arka plan dalga boyunda emilimini okuyun. NOT: Mevcut Florometre-ELISA okuyucu ultra düşük bağlantı 96 delikli plakayı okuyamıyorsa, her bir kuyucuğun içeriğini karşılık gelen düz tabanlı 96 delikli plakaya aktarın.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek hücre canlılığını hesaplayın.<ol><li>Her kuyucuk için "spesifik sinyali" hesaplayın ("spesifik sinyal" = 570 nm'deki sinyal - 630-690 nm'deki sinyal). Ardından, "Boş" kuyuların ortalama değerini hesaplayın ve bu değeri her kuyudan çıkarın.</li>
		<li>Çalışma ilacı ("AV-SS-unt") ile tedavi edilmeyen hücreleri içeren kontrol kuyucuğundaki "spesifik sinyallerin" ortalamasını hesaplayın.</li>
		<li>Her bir kuyucuktaki hücrelerin canlılığını (yüzdesini) tedavi edilmemiş hücrelere sahip kuyucuklara göre hesaplayın. NOT: Canlılık = (her kuyucukta spesifik sinyal/"AV-SS-unt") × 100</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sferoidlerdeki morfolojik değişikliklerin izlenmesi ve analiz edilmesi
NOT: MTT testine gelince, bu değerlendirmede "3D kültür ortamı" değil, sadece hücre kültürü ortamı kullanılmalıdır (bazal membran matrisinin eklenmesi gerekli değildir ve analize potansiyel olarak müdahale edebilir).
<ol><li>Sferoidleri saydıktan sonra, hücre kültürü ortamındaki süspansiyonu (% 10 FBS, 1:100 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamı) 20 μL başına yaklaşık 1-2 sferoide seyreltin.</li>
	<li>Ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın kuyucuklarına 80 μL hücre kültürü ortamı koyun ve ardından kuyucuklara 20 μL küresel süspansiyon ekleyin. NOT: Bu nedenle, kuyular 100 μL'lik bir hacimde 1-2 sferoid içerecektir.</li>
	<li>Mikroskop altındaki kuyucukları dikkatlice kontrol edin ve bu analiz için kullanılacakları için bir küre içeren kuyucukları işaretleyin.</li>
	<li>Çalışma ilacını, ilgi konsantrasyonunun iki katı olan bir konsantrasyonda hazırlayın. İlgili kuyucuklara 100 μL ilaç çözeltisi ekleyin (kuyudaki toplam konsantrasyon daha sonra 1x olacaktır).</li>
	<li>0. Günde (çalışma ilacını eklemeden önce) her bir kuyucuğun görüntüsünü yakalayın ve sferoidlerin çaplarını belirlemek için görüntüleme yazılımındaki "ölçek" aracını kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Plakayı% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin ve morfolojiyi inceleyin ve ilaç etkisinin ne zaman gözlemlendiğine bağlı olarak 3-7 gün boyunca günlük olarak sferoidlerin çapını ("ölçek" aracını kullanarak) ölçün (örneğin, hücre yayılımı, istilacı baklalar, yapı yıkımı, vb.).</li>
	<li>Deneyin sonunda, zaman içinde küresel çaplardaki (0. Güne göre) değişiklikleri çizin. NOT: Değişim (yüzde) = (belirli bir gündeki küresel çap / 0. Gündeki kürenin çapı) × 100</li>
</ol>

<ol><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+tumor+models%3A+Advantages%2C+disadvantages%2C+variables%2C+and+selecting+the+right+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4(2020).</li>
<li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior%3A+What+is+the+impact+for+novel+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381(2021).</li>
<li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+de+Investigacio%CC%81n+Cli%CC%81nica%22%5BJournal%5D)">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).</li>
<li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284(2022).</li>
<li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+goes+three-dimensional%3A+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li>
<li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li>
<li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665(2022).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).</li>
<li>Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Periodicum+Biologorum%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li>
<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152(2021).</li>
<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+The+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Mevcut protokol, insan tümör örneklerinden türetilen 3D birincil hücre kültürleri (sferoidler) üretmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Bu sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını ve ilaç kombinasyonlarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak da dahil olmak üzere çeşitli analizler için kullanılabilir. Protokol, doğrudan hasta örneklerinden türetilen primer tümör hücrelerini veya hasta örnekleri kullanılarak kurulabilen PDX modell...

İn vitro ve in vivo çalışmalar, kanser tedavilerinin geliştirilmesinde tamamlayıcı yaklaşımları temsil etmektedir. İn vitro modeller çoğu deneysel değişkenin kontrolüne izin verir ve nicel analizleri kolaylaştırır. Genellikle düşük maliyetli tarama platformları olarak hizmet ederler ve mekanik çalışmalar için de kullanılabilirler1. Bununla birlikte, biyolojik alaka düzeyleri doğal olarak sınırlıdır, çünkü bu tür modeller tümör mikroçevresini sadece kısmen yansıtır1. Buna karşılık, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) gibi in vivo modeller, tümör mikroçevresinin karmaşıklığını yakalar ve translasyonel çalışmalar ve hastalarda bireyselleştirici tedavi için daha uygundur (yani, bireysel bir hastadan türetilen bir modelde ilaçlara verilen yanıtı araştırmak)1. Bununla birlikte, in vivo modeller, deneysel parametreler in vitro modeller kadar sıkı bir şekilde kontrol edilemediğinden ve gelişimleri zaman alıcı, emek yoğun ve maliyetli olduğundan ilaç taraması için yüksek verimli yaklaşımlara elverişli değildir 1,2.
İn vitro modeller 100 yılı aşkın bir süredir mevcuttur ve hücre hatları 70 yılı aşkın bir süredir mevcuttur3. Bununla birlikte, son birkaç on yılda, solid tümörlerin mevcut in vitro modellerinin karmaşıklığı çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu karmaşıklık, tümör kaynaklı yerleşik hücre hatları veya birincil hücre hatları olan 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar), 3 boyutlu (3B) modelleri içeren daha yeni yaklaşımlara kadar uzanır1. 2B modellerde, kurulan ve birincil hücre çizgileri4 arasında önemli bir ayrım vardır. Kurulan hücre hatları ölümsüzleştirilir; Bu nedenle, aynı hücre hattı, tarihsel bir perspektiften bakıldığında, işbirliğini, veri birikimini ve birçok tedavi stratejisinin geliştirilmesini kolaylaştıran uzun yıllar boyunca küresel olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarındaki genetik anormallikler her geçişte birikir ve böylece biyolojik alaka düzeylerini tehlikeye atar. Ayrıca, mevcut hücre hatlarının sınırlı sayısı, 4,5 hastalarında tümörlerin heterojenliğini yansıtmamaktadır. Primer kanser hücre hatları doğrudan biyopsiler, plevral efüzyonlar veya rezeksiyonlar yoluyla elde edilen rezeke tümör örneklerinden elde edilir. Bu nedenle, birincil kanser hücre hatları, tümör mikroçevresinin unsurlarını ve hücreler arası davranışlar (örneğin, sağlıklı ve kanserli hücreler arasındaki çapraz konuşma) ve kanser hücrelerinin kök benzeri fenotipleri gibi tümör özelliklerini korudukları için biyolojik olarak daha önemlidir. Bununla birlikte, birincil hücre hatlarının replikatif kapasitesi sınırlıdır, bu da dar bir kültür süresine yol açar ve analizler için kullanılabilecek tümör hücrelerinin sayısını sınırlar 4,5.
3D kültürleri kullanan modeller, in vivo koşullar korunduğundan 2D kültür modellerinden biyolojik olarak daha önemlidir. Böylece, 3D kültür modelleri doğal hücre şeklini ve büyümesini korur ve hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltır. Kanser araştırmalarında en yaygın kullanılan 3D modeller arasında çok hücreli sferoidler, iskele tabanlı yapılar ve matrise gömülü kültürlerbulunur 4,6,7.
Mevcut protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) üretmekte ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmektedir: hücre canlılığı testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Burada sunulan temsili sonuçlar meme ve kolon kanserinden; Bununla birlikte, bu protokol diğer katı tümör tiplerine (örneğin, kolanjiyokarsinom, gastrik, akciğer ve pankreas kanseri) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında özel ekipmana dayanmadan tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Bu yaklaşım kullanılarak üretilen çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.
Bu protokol üç bölüme ayrılmıştır: (1) ilaç etkinliğini test etmek için bir model olarak kullanılmalarına hazırlık olarak sferoidlerin oluşturulması, toplanması ve sayılması; (2) Sferoidler üzerindeki ilaç etkinliğini değerlendirmek için MTT testi; ve (3) ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde başka bir yaklaşım olarak sferoidlerin ilaçlarla tedavisini takiben morfolojik değişikliklerin mikroskobik olarak değerlendirilmesi (Şekil 1).

<table><tbody><tr><td>5 Fluorourasil</td><td>TEVA İsrail</td><td>lot 16c22NA</td><td>Fluorouracil, Adrucil</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutase Hücre Dissosiyasyonu</td></tr><tr><td>Sisplatin</td><td>TEVA İsrail</td><td>20B06LA</td><td>Abiplatin,&nbsp;</td></tr><tr><td>Kültrex&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>3632-010-02</td><td>Bodrum membran matrisi, tip 3</td></tr><tr><td>DMSO (dimetil sülfoksit)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2391595</td><td></td></tr><tr><td>Flurometre&nbsp; ELISA okuyucu</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td>Gen5 3.11</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>durdurma</td><td>çözümü için</td>320331</tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD&</td><td>nbsp; Sürüm 1.52a</td><td>Açık kaynaklı yazılım ImageJ</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Gadot</td><td>P180008215</td><td>durdurma çözeltisi</td></tr><tr><td>için L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>1843977</td><td></td></tr><tr><td>MTT&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td>3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler ve nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Palbociclib&nbsp; &nbsp;</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 571190-30-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)*Kalsiyum ve Magnezyum Penisilin İçermez</td></tr><tr><td>&ndash; streptomisin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2119399</td><td></td></tr><tr><td>Fenol içermeyen RPMI 1640</td><td>Biyolojik endüstriler, İsrail</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Pippeting rezervuarı</td><td>Alexred</td><td>RED LTT012025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 kültür ortamı&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Sunitinib</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 341031-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab</td><td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td><td>10172154 IL</td><td>Herceptin</td></tr><tr><td>Tripan mavisi% 0.5 çözelti</td><td>Biyolojik endüstriler, İsrail</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Ultra düşük bağlantı 96 kuyulu plaka</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Vinorelbine</td><td>Ebewe</td><td>11733027-03</td><td>Göbek</td></tr></tbody></table>

hasta kaynaklı tümör Örneklerinden 3 boyutlu sferoidlerin oluşturulması ve İlaçlara duyarlılıklarının değerlendirilmesi

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Tümör biyolojisini anlamadaki kayda değer ilerlemelere rağmen, klinik çalışmalara giren onkoloji ilaç adaylarının büyük çoğunluğu, genellikle klinik etkinlik eksikliği nedeniyle başarısız olmaktadır. Bu yüksek başarısızlık oranı, mevcut preklinik modellerin, esas olarak tümör heterojenliğini ve tümör mikroçevresini yansıtmadaki yetersizlikleri nedeniyle klinik etkinliği tahmin edememelerini aydınlatmaktadır. Bu sınırlamalar, bireysel hastalardan elde edilen insan tümör örneklerinden oluşturulan 3 boyutlu (3D) kültür modelleri (sferoidler) ile ele alınabilir. Bu 3D kültürler, gerçek dünya biyolojisini, tümör heterojenliğini yansıtmayan yerleşik hücre çizgilerinden daha iyi temsil eder. Ayrıca, 3B kültürler 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar) daha iyidir, çünkü hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltırlar ve doğal hücre şeklini ve büyümesini korurlar. Bu çalışmada, 3D olan ve çok hücreli sferoidlerde büyüyen bireysel hastalardan kanser hücrelerinin primer kültürlerinin hazırlanması için bir yöntem geliştirilmiştir. Hücreler doğrudan hasta tümörlerinden veya hasta kaynaklı ksenogreftlerden türetilebilir. Yöntem, katı tümörlere (örneğin, kolon, meme ve akciğer) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda özel ekipmanlara güvenmeden tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Burada, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) oluşturmak ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmek için bir protokol sunulmuştur: bir hücre canlılık testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Bu çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.

Bu protokol, primer tümör hücrelerinden homojen bir sferoid kültürü oluşturmak, sferoid kültür (MTT testi) üzerindeki ilaç etkinliğini kantitatif olarak değerlendirmek ve çalışma ilaçlarının sferoid morfoloji üzerindeki etkisini belirlemek için prosedürler sunmaktadır. Kolon ve meme kanseri hücre kültürlerinden üretilen sferoidlerdeki temsili deneylerden elde edilen veriler sunulmuştur. Benzer deneyler, kolanjiyokarsinom, gastrik, akciğer ve pankreas kanseri dahil olmak üzere diğer tümör tipleri kullanılarak gerçekleştir...

Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Protokolümüz önemlidir, çünkü birincil kanser hücrelerinden bir nesil 3D tümör kültürü modelini tanımlar ve bu model gerçek dünyadaki tümör biyolojisini hücre hatlarından daha iyi temsil eder. Bu yaklaşım çeşitli solid tümörlere uygulanabilir. Ayrıca, tipik bir hücre biyolojisi laboratuvarında baştan sona gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir.Bu yaklaşım kullanılarak üretilen 3D tümör modelleri, tümörlerin anti-kanser tedavilerine veya tedavilerin bir kombinasyonuna duyarlılığı ve direnci üzerine yapılan araştırmaları desteklemektedir. Bu yaklaşım, birincil kanser hücrelerinden 3D modeller üretir. Bu nedenle, belirli bir hasta için hangi tedavinin etkili olabileceğini belirleyebilir ve böylece tedavisini kişiselleştirmeye yardımcı olabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Ella Itzhaki olacak. Başlamak için, tek hücreli yapışkan birincil hücre kültürüne sahip küçük bir T25 şişesi alın ve hücre kültürü ortamını çıkarın. Hücreleri PBS ile yıkayın ve% 75 ila% 100 birleşimli yapışkan primer tümör hücre kültürlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için 37 santigrat derecede üç dakika boyunca bir mililitre 1x Accutase ekleyin.Beş mililitre hücre kültürü ortamı ekleyerek Accutase çözeltisini nötralize edin. Hücreleri 10 mililitrelik bir serolojik pipetle aspire edin ve 15 mililitrelik bir konik tüpte biriktirin. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800g'de santrifüjleyin.Hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücre peletinin üzerine sekiz mililitre taze hücre kültürü ortamı ekleyin, ardından yavaşça karıştırın. Canlı hücreleri bir hemositometre ile saymak için, hücre süspansiyonunun 50 mikrolitrelik bir alikotunu alın ve 50 mikrolitre tripan mavisi ile karıştırın. Ardından canlı hücreleri sayın ve süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısını hesaplayın.Ardından, 3B kültür ortamını hazırlayın. Tahlil için gereken hücre sayısını ve gereken toplam hacmi hesapladıktan sonra, 3D kültür ortamının 200 mikrolitresinde istenen sayıda hücre ile hücre süspansiyonunu hazırlayın. Homojen bir dağılım sağlamak için pipetle nazikçe karıştırın.Süspansiyonu bir pipetleme haznesine aktarın ve çok kanallı pipetli ultra düşük bağlantı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin kümelenmesini zorlamak için plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300g'de santrifüj edin, böylece hücre agregasyonunu iyileştirin ve plakayı% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'da tekrar santrifüj yaptıktan sonra, ortamın %50'sini nazikçe çıkarın ve atın ve mevcut çözeltiyi değiştirmek için 100 mikrolitre taze 3D kültür ortamı ekleyin.Bu adımı tekrarlayın ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin. Sferoid oluşumu izlemek için hücreleri her bir ila iki günde bir mikroskop altında inceleyin. Görüntüleme yazılımındaki ölçek aracı kullanılarak oluşturulan sferoidlerin çapını ölçün.Küresel çap 100 ila 200 mikrometreye ulaştığında, ilaç etkinliği deneylerini gerçekleştirin. Küre toplama için, her bir kuyucuktan küreleri toplamak için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve bunları 15 mililitrelik bir konik tüpe koyun. Konik tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 g'da santrifüj edin ve bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın.Hücre kültürü ortamının 0.5 mililitresini ekleyin ve peleti iyi ama nazikçe askıya alın. Küresel sayım yapmak için, 96 delikli bir plaka kullanın ve kuyuyu kadranlara bölmek için kuyunun alt tarafına bir artı işareti çizin. Kuyuya 50 mikrolitre süspansiyon ekleyin.Ve 10x objektif lensle, sferoidleri mikroskop altında manuel olarak sayın. Her kadrandaki sferoidleri sayın ve kuyudaki toplam sferoid sayısını hesaplayın. Ardından, hacmi sayarak küresel sayıyı iki katına çıkararak küresel konsantrasyonu hesaplayın ve süspansiyondaki toplam sferoid sayısını hesaplayın.Yeni bir tüpte, 200 mikrolitre hücre kültürü ortamı başına 200 sferoid konsantrasyonunda sferoid süspansiyon hazırlayın. Her ilaç tedavisi için, sferoid stoğunu farklı bir tüpte hazırlayın. Her ilaç için gereken toplam miktarı, tekrarlar için gereken kuyucuk sayısına göre hesaplayın ve ilacı tüpe gereken son konsantrasyona ekleyin.Küresel süspansiyonun 200 mikrolitresini ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarın ve plakayı% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Sferoidleri çalışma ilacı ile 24 ila 72 saat boyunca inkübe ettikten sonra, plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300g'de santrifüj edin ve hücre kültürü ortamının 170 mikrolitresini yavaşça çıkarın ve kuyunun dibinde 30 mikrolitre bırakın. MTT çözeltisini hazırlayın ve her bir kuyucuğa 70 mikrolitre çözelti ekleyin ve kuyu başına 100 mikrolitrelik son bir hacme getirin.Kuyudaki son MTT konsantrasyonu, 100 mikrolitre başına 0.05 miligram olacaktır. Ek olarak, hücresiz MTT çözeltisi ile boş kuyucuklar hazırlayın. Kuyucuklardaki çözeltinin renginde bir değişiklik gözlenene kadar% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.Bir değişiklik gözlendiğinde, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre Stop çözeltisi ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan kuyucukların içeriğini hafifçe karıştırın. Plakanın absorbansını 570 nanometre dalga boyunda ve 630 ila 690 nanometre arka plan dalga boyunda bir parametre ELISA okuyucusunda okuyun. Hücre canlılığını hesaplamak için, her bir kuyucuk için spesifik sinyali hesaplayın.Ardından boş kuyucukların ortalama değerini hesaplayın ve bu değeri her kuyudan çıkarın. Çalışma ilacı ile tedavi edilmeyen hücreleri içeren kontrol kuyularındaki spesifik sinyallerin ortalamasını hesaplayın. Son olarak, her bir kuyucuktaki hücrelerin, işlenmemiş hücrelere sahip kuyucuklara göre yaşayabilirliğini hesaplayın.Birincil kolon kanseri hücre kültüründen zamanla başlangıçta tohumlanan hücrelerin sayısı ile sferoidlerin oluşumu burada gösterilmiştir. Bu şekilden, üretilen sferoidlerin sayısının, başlangıçta her bir kuyucukta tohumlanan hücrelerin sayısına bağlı olduğu görülebilir. Kültürde 10 gün sonra birincil kolon kanseri hücrelerinden gelen sferoidler, kuyu başına 2.000 ilk hücre tohumlaması ile burada gösterilmiştir.Kolon kanseri sferoidlerinin uzun süreli kültürü üzerine, birbirlerine yapışmaya başladılar ve homojen bir kültürü önleyen ve böylece MTT tahlillerinde sferoidlerin kullanımını yasaklayan sferoidler ve üzüm benzeri yapılar kümeleri oluşturdular. Palbociclib, sunitinib ve bunların kombinasyonlarının kolon ve meme kanseri de dahil olmak üzere primer tümör hücrelerinden sferoidler üzerindeki etkileri burada gösterilmiştir. Kolon ve meme kanseri hücrelerinden türetilen sferoidler üzerinde bir MTT testi yapıldı.MTT sinyalleri, DMSO ile tedavi edilen hücrelerden gelen değerlere normalleştirildi. Değerler, dört ila sekiz çoğaltma arasındaki araçları temsil eder. Çeşitli tedavilerin hücre büyümesi üzerindeki etkileri de sıfır günde ve kolon kanseri ve meme kanseri hücrelerinden türetilen sferoidlerin üç günlük tedavisinden sonra mikroskobik olarak değerlendirildi.Trastuzumab artı vinorelbin ve 5 florourasil artı sisplatinin zamanla meme kanserinden türeyen sferoidler üzerindeki etkileri bu şekilde sunulmuştur. Sferoidlerin çapının tedavi süresine göre sıfır gününe göre değişimi burada gösterilmiştir. Her tedavi grubu, her bir kuyucukta bir küre bulunan dört ila altı kuyu içeriyordu.Ortalama değişim burada sunulmaktadır. Sferoidler, anti-kanser tedavisine yanıtın ötesinde birçok çalışma için önemli araçlardır. Bu çalışmalar, örneğin, ilaç dağıtımını ve hatta hücre-hücre etkileşimleri gibi temel biyoloji sorularını ele almaktadır.Tek hücreli bir süspansiyonla küresel üretim sürecini başlatmak çok önemlidir. Ayrıca,% 5 bazik membran metrikleri içeren bir ortama sahip ultra düşük bağlantı plakalarının kullanılması da kritik öneme sahiptir.

establishing-3-dimensional-spheroids-from-patient-derived-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Glioblastoma multiforme'nin hasta kaynaklı ksenogreftleri, 3D insan biyojel kültür sistemi kullanılarak canlı mikrotümörlere minyatürleştirilebilir. Bu in vivo benzeri 3D tümör testi, kinom analizi de dahil olmak üzere ilaç yanıt testi ve moleküler profilleme için uygundur.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

Terapi değerlendirilmesi amaçlayan deneysel tedavi rejimleri hücre hatları, baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için geçerli standart test etmemizi sağlayan bir küresel tabanlı, üç boyutlu vitro modeli evrimi tarif duyarlılık ve direnci Primer hücre insan örnekler üzerinden üzerinde içinde belgili tanımlık gelecek.

Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Hastalık göstergeler çok çeşitli, daha fizyolojik ilgili modelleri gelişmiş ve içine uygulanan ilaç bulma programları davranıyorsun. Burada açıklanan yeni modeli sistemi pulcuklarının kültürlü ve yeni Onkoloji uyuşturucu aramak için bir yüksek üretilen iş 1536-şey plaka tabanlı sistem festivalde nasıl üç boyutlu tümör göstermektedir.

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Burada, 2D kültürden çok daha iyi in vivo tümörlerin fiziko-kimyasal degradelerini taklit eden 3D kanser hücresi kürelerinin içinde canlanıyor ve ölümü değerlendirmek için birkaç basit yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, küroid modeli, kanser ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için gelişmiş çeviri ile in vivo koşullara izin verir.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Bu makalede, üç boyutlu tümör sferoidlerinin oluşturulması için standartlaştırılmış bir yöntem gösterilmektedir. Otomatik bir görüntüleme sistemi kullanarak küresel gözlem ve görüntü tabanlı derin öğrenme analizi için bir strateji de açıklanmaktadır.

İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Burada, üç boyutlu (3D) glioma sferoidlerini ve hücre dışı akı analizi yoluyla görüntülemeye dayalı normalizasyonu entegre eden bir metabolik profilleme platformu oluşturuyoruz. Bu yaklaşım, ilaç tedavilerine tümör metabolik yanıtlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlar ve potansiyel direnç mekanizmaları hakkında bilgi sağlar.

İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

Öğrenin, hasta kaynaklı primer kanser hücrelerinden 3D tümör sferoidleri oluşturmayı ve ilaç duyarlılığını değerlendirmeyi. Bu yöntem, kişiselleştirilmiş kanser tedavisi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet