Name: Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Öğrenin farelerde hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu, ileri kolorektal kanser metastazını ve yeni tedavi ilaçlarının değerlendirilmesini. Bu model akciğer ve karaciğer metastazlarının klinik senaryosunu taklit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cellex Vakfı'na, CIBERONC ağına ve Instituto de Salud Carlos III'e destekleri için teşekkür ederiz. Ayrıca, deneylerin yapıldığı Vall d'Hebron Araştırma Enstitüsü'ndeki (VHIR) klinik öncesi görüntüleme platformuna da teşekkür ediyoruz.

Tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Proje, Barselona, İspanya'daki Vall d'Hebron Üniversite Hastanesi Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (onay kimliği: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). İnsan kolon dokusu örnekleri, tümör rezeksiyonu yapılan kolon ve rektum kanserli hastalara karşılık gelen primer adenokarsinomların veya karaciğer metastazlarının nekrotik olmayan alanlarından alınan biyopsilerden oluşuyordu. Deneyler, Avrupa Birliği'nin hayvan bakımı direktifine (86/609/EEC) uygun olarak gerçekleştirilmiş ve VHIR-Vall d'Hebron Araştırma Enstitüsü Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA ve 12/18 CEEA) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Dişi NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid / NcrCrl) 8 haftalık fareler Charles River Laboratuvarlarından satın alındı.
1. Hasta hücrelerinin türetilmesi
<ol><li>Tümör ekstraksiyonu NOT: Aşağıdaki prosedür, hayvan tesisinde oda sıcaklığında (RT) biyolojik bir kabinde gerçekleştirilir.<ol><li>Hastaların ameliyatlarından veya biyopsilerinden ve farelerde deri altından büyüyen PDX'lerden tümör örnekleri alın.</li>
		<li>Ortotopik enjeksiyon için, doğrudan hastalardan elde edilen doku yerine yerleşik deri altı PDX tümör modellerinden tümör hücrelerini hazırlayın9.</li>
		<li>NOD-SCIDfarelerinin 2 yan tarafında deri altından Matrigel matrisi (50 μL) ile karıştırılmış fosfat tamponlu salin (PBS) (50 μL) içinde 1 x 105 tümör hücresinin bir süspansiyonunu aşılayarak PDX tümörleri oluşturun.<ol><li>Her gün bir kumpas kullanarak tümör büyümesini ölçün. NOT: Daha da önemlisi, laboratuvarımız 350'den fazla PDX modelinden oluşan bir biyobanka oluşturmuştur. Protokolde kullanılan CRC-PDX tümör modelleri, farelerde üçten fazla pasajdan daha fazla amplifiye edilmiş ve dahil etme/dışlama kriterlerini pozitif sonuçla geçmiş laboratuvarda yerleşik PDX modelleridir (Tablo 1).</li>
		</ol></li>
		<li>Deri altı tümörler CEEA tarafından belirlenen maksimum boyuta (1 cm çap) ulaştığında veya hayvanlar son nokta kriterlerine ulaştığında fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın.</li>
		<li>Tümörü çıkarın ve makas ve forseps kullanarak deriden ve çevresindeki tümör olmayan dokudan dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Hasat edilen tümörleri bir sonraki adıma kadar PBS'de 4 °C'de saklayın. NOT: Hücre süspansiyonundaki tümörleri, farelerde hastaların lezyonlarında veya deri altı ksenogreftlerinde orijinal konumlarından çıkarıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede ayırın. Doku çıkarıldıktan 24 saat sonra hücre canlılığı önemli ölçüde azalır ve bu da alıcı farelerde verimsiz bir implantasyona neden olur.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre hazırlığı NOT: Aşağıdaki prosedür, doku kültürü odasında oda sıcaklığında (RT) biyolojik bir kabinde gerçekleştirilir.<ol><li>10 cm'lik bir kültür plakasında 1 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı (Tablo 2) içeren bir bıçak kullanarak tümörleri ayırın (kıymayı kolaylaştırmak için). Homojen ayrışmış numuneyi 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.</li>
		<li>5 mL'lik bir son hacme tam CoCSCM 6Ab ortamı ekleyin (aynı tüpte 3 mL'den fazla ayrışmış numune kullanmayın). NOT: Hastalardan alınan primer KRK'ler doğal olarak bakteri ve mantar ile kontamine olur. Orijinal hasta örneğinde bulunan patojenlerin altı antibiyotikten (penisilin, streptomisin, mantar zonu, kanamisin, gentamisin ve nistatin) oluşan bir kokteyl kullanılarak uzaklaştırılması esastır. İmmün yetmezliği olan farelerde bakterilerle kontamine olmuş tümör hücrelerinin enjeksiyonu hayvan ölümüne neden olabilir.</li>
		<li>50 μL DNaz I (0.08 kU/mL) ve 50 μL kollajenaz (1.5 mg/mL) (sindirim ortamı; Tablo 2) bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat boyunca, 45 ° pozisyonda. İnkübasyondan önce çözeltiyi her 15 dakikada bir 5 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın. NOT: Tümör dokusunu ayırın ve tek bir hücre çözeltisi elde etmek için birkaç kez pipetleyerek sindirin. Bu, alıcı farelere enjekte edilmeden önce hücrelerin sayılması ve dolayısıyla tümör hücrelerinin homojen bir implantasyonunun elde edilmesi için gereklidir.</li>
		<li>5 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı ekleyin ve 5 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın.</li>
		<li>Çözeltiyi 100 μm'lik bir hücre süzgeci ile yeni bir steril 50 mL tüp kullanarak sıralayın.</li>
		<li>Sıralanan hücreleri RT'de 8 dakika boyunca 500 x g'de döndürün.</li>
		<li>Süpernatanı aspire edin.</li>
		<li>Peletin 3 mL 1x RBC lizis tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edilmesi.</li>
		<li>RT'de 10 dakika inkübe edin.</li>
		<li>3 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı ekleyin, numuneyi pipetleyin ve RT'de 10 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.</li>
		<li>Peletleri 5-10 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı ile yeniden süspanse edin ve toplam hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayacı kullanın.</li>
		<li>Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün ve 10 mL PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
		<li>20 x 106 hücre/mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için peleti yeniden süspanse edin ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyice karıştırın.</li>
		<li>Doku kültüründe çekum enjeksiyonu için 29 G şırınga (0,5 mL U 100 iğne, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) hazırlayın (bir şırınga/fare). Şırıngaya 50 μL tümör hücresi süspansiyonu (1 x 106 hücre/enjeksiyon) yükleyin ve buz üzerinde tutun. Hücre süspansiyonundan hava kabarcıklarının çıkarıldığından emin olun. NOT: Tümör hücreleri şırıngaya yüklendiğinde hava kabarcıklarının ortadan kaldırılması, çekum duvarına doku yırtılmasına ve numune kaybına neden olabilecek aşırı hacim enjeksiyonunu önlemek için önemlidir. Aynı deneyde fareler arasında eşit olmayan tümör boyutundan kaçınmak için şırıngayı yüklerken hücre süspansiyonunu iyice karıştırmak zorunludur.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Çekumda ortotopik enjeksiyon
NOT: Aşağıdaki prosedür, hayvan tesisindeki belirli bir patojen içermeyen (SPF) odada bir tezgah üzerinde gerçekleştirilir. Kullanılan ekipman önceden temizlenir ve sterilize edilir. Ek olarak, hayvan tesisindeki bireyler veya bölgeler arasında portatif bir sterilizatörde tekrar sterilize edilir.
<ol><li>Ameliyat bölgesini dezenfekte edici deterjan püskürterek ve silerek temizleyin.</li>
	<li>Bir fare epilasyon makinesi kullanarak farelerin karnını epilasyon yapın.</li>
	<li>Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Hayvanı uyuşturmak için% 2 izofluran kullanın. Ekstremiteyi hafifçe sıkıştırarak ve stimülasyon yokluğunu gözlemleyerek anestezinin etkisini onaylayın.</li>
	<li>Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için gözlere 50-100 μL damla veteriner merhemi (3 mg/g Lacryvisc) damlatın.</li>
	<li>Dairesel hareketlerle birkaç kez klorheksidin veya povidon-iyot ile ovalayarak fare karnını dezenfekte edin.</li>
	<li>Ameliyat makası kullanarak alt karın üzerinde 1 cm uzunlamasına bir kesi yapın. Derinin altındaki peritonu sunmak için cildi her bölgeye dikkatlice ayırın.</li>
	<li>Periton zarında çekumu dışlayacak kadar büyük 0,5-1 cm'lik bir kesi yapın. NOT: İç organları aşırı derecede manipüle etmeden çekumu dıştan çıkarın, bu da prosedürün ölümcüllüğünü önemli ölçüde artırabilir.</li>
	<li>Önceden kesilmiş, steril bir gazlı bez kullanarak çekumu fareden dikkatlice izole edin.</li>
	<li>Tüm prosedür boyunca çekumu tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.</li>
	<li>Cecumu forseps ile dikkatlice tutarak hareketsiz hale getirin ve iğneyi yüzeysel olarak çekum duvarına sokun. Enjeksiyon bölgesindeki kılcal damarlardan ve damarlardan kaçının. Hücre süspansiyonundaki kabarcıkları çıkarın.</li>
	<li>50μL tümör hücresi süspansiyonunun tamamını yavaşça enjekte edin. Genellikle uygulanması yaklaşık 10 saniye sürer. Çekum lümenini iğne ile delmekten kaçının, çünkü bu, tümör hücresi süspansiyonunun bağırsak peristaltizmi yoluyla vücuttan atılmasıyla sonuçlanır. NOT: Tümör hücresi süspansiyonunun farelerin çekumuna enjekte edilmesi, tüm prosedürün en zorlu adımıdır. Protokolün bu bölümünde enjeksiyon bölgesine odaklanmış parlak bir ışık ve büyüteç kullanılmalıdır. İğneyi çekum yüzeyine paralel olarak yerleştirin. Çekum çok kırılgan bir dokudur; Bu nedenle, çekumun immobilizasyonu cerrahi forseps kullanılarak ve kanama ile sonuçlanan doku yırtılmasını önlemek için hafif basınç uygulanarak yapılmalıdır. Başarılı implantasyon, çekum duvarında beyaz bir kabarcık (hücre peleti) ile sonuçlanır. Kabarcık görselleştirilemiyorsa, çekumun delindiğini ve hücrelerin çekum lümeninde sona erdiğini ve bağırsak yolu tarafından temizlenmelerine neden olduğunu gösterebilir.</li>
	<li>Enjeksiyondan sonra, tümör hücrelerinin kaçmasını önlemek ve hafif kanamayı azaltmak için iğneyi çekumdan yavaşça çıkarın ve enjeksiyon bölgesine pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif bir baskı uygulayın.</li>
	<li>Kalıntıları gidermek için çekumu tuzlu su çözeltisiyle temizleyin.</li>
	<li>Çekumu hayvanın karnına geri koyun.</li>
	<li>5/0 sütür kullanarak peritonu kapatın.</li>
	<li>Karın derisini 5/0 dikişlerle kapatın.</li>
	<li>Ameliyat sonrası antibiyotikler (100 mg/kg amoksisilin veya 20 mg/kg enrofloksasin) ve analjezikler (5 mg/mL metacam/meloksikam) subkutan enjeksiyonla uygulanır. Fareleri bir ısıtma yastığına yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar orada tutun. Ardından, onları diğer hayvanlarla birlikte kafese geri koyun.</li>
</ol>3. μCT taraması kullanılarak ortotopik tümör büyümesinin değerlendirilmesi
NOT: Aşağıdaki prosedür, hayvan tesisinden klinik öncesi görüntüleme platformunda (PIP) gerçekleştirilir.
<ol><li>Tüm hayvan işlemlerini kurumsal etik kurul düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirir.</li>
	<li>Hücre enjeksiyonundan 2 hafta sonra ve daha sonra her hafta μCT ile tümör hacmini izlemeye başlayın.</li>
	<li>Kontrast madde iopamiro'yu (300 mg / mL) salin çözeltisi içinde, her iki doz için de 3: 1 oranında taze olarak seyreltin. Oral gavaj ile 300 mL iopamiro uygulayın. NOT: μCT'nin zayıf yumuşak doku kontrastı nedeniyle, tekniğin hassasiyetini artırmak için bir kontrast madde önerilir. Protokol, intraluminal tümör yükünü sınırlamak için iyot bazlı bir ajanın (iopamiro) oral uygulamasını ve bağırsağın viseral yüzündeki tümör yükünü tanımlamak için aynı ajanın ikincil intraperitoneal uygulamasını içerir. Kontrast maddenin eliminasyonundan önce farelerin çekumuna ulaşması gereken tam zamanı belirlemek için daha önce pilot deneyler yapılmıştır. Iopamiro durumunda, yaklaşık 2 saattir.</li>
	<li>2 saat sonra, 300 mL önceden seyreltilmiş iopamiro intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın. Uygulama, parietal yüzdeki tümör sınırlarını tanımlamaya yardımcı olur.</li>
	<li>% 2 izofluran kullanarak hayvanları uyuşturun.</li>
	<li>Farenin ayağını sıkıştırarak hayvanın doğru şekilde uyuşturulduğunu onayladıktan sonra, hayvanı μCT'nin tarama yatağına yerleştirin. En iyi pozisyon sırtüstüdür (yüzü yukarı).</li>
	<li>Kontrol yazılımında, karın bölgesini tarayıcının görüş alanına (FOV) yerleştirmek için canlı modu (floroskopi modu) başlatın. Bunu yapmak için, istenen pozisyon elde edilene kadar yatağı ileri, geri ve yanal olarak hareket ettirin. X-ışını tüpünü ve dedektörü 90° döndürün ve hayvanı tamamen ortalamak için tarama yatağını y ekseninde hareket ettirin.</li>
	<li>Bir FX μCT görüntüleme sistemi kullanarak μCT tarama görüntüleri için aşağıdaki parametreleri kullanın: 30 mm FOV, 26 sn çekim süresi, 90 kV akım voltajı ve 200 μA akım amperajı.</li>
	<li>Tarama bittiğinde hayvanları iyileşmek için kafeslerine geri koyun. Termal destek sağlayın ve barınağa dönmeden önce anesteziden kurtulana kadar hayvanları izleyin.</li>
	<li>μCT alımı, her tarama için 250 Mb boyutunda bir dosya verir. Oluşturulan veri dosyaları bir VOX formatına sahiptir. Herhangi bir görüntüleme analiz yazılımı için erişilebilir hale getirmek için, μCT'nin veritabanı yönetim yazılımını kullanarak dosyaları DICOM formatına dönüştürün. Oluşturulan dosya grubunu, mevcut görüntüleme yazılımına sahip herhangi bir bilgisayarı kullanarak analiz etmek için taşınabilir bir sabit diskte saklayın. NOT: Görüntü analizi sırasında çekum, sıklıkla kaudal karnın sol tarafında, radyoyoğun içeriğe (iopamiro) sahip genişlemiş bir bağırsak olarak lokalizedir. Çekumun visseral fleksurunda, komşu bağırsak bölgelerine göre bir duvar kalınlaşması gözlenir. Kalınlaşma, tümör büyümesine karşılık gelir.</li>
	<li>Tümör lokalize olduktan sonra, farklı görünümlerde (aksiyal, koronal ve sagital) en yüksek çapı bulun. Bu üç ekseni ölçün ve elipsoid formülünü izleyerek tümör hacmini hesaplayın: hacim = 4/3π x (x-yarı eksenli x y-yarı eksenli x z-yarı eksen)10.</li>
</ol>4. Ortotopik tümör taşıyan farelerde terapötik müdahale
<ol><li>Ortotopik tümörleri taşıyan fareleri haftalık olarak izleyin.</li>
	<li>Farelerin çoğunda bir tümör μCT tarama sinyali tespit edildiğinde, tümörün varlığını doğrulamak için ertesi hafta başka bir μCT taraması yapın. NOT: Tedaviye başlama süresi kullanılan PDX modeline bağlıdır ve çekumda tümör hücresi inokülasyonundan 3-12 hafta sonra değişir.</li>
	<li>Fareleri dört gruba randomize edin: bir araç grubu (n = 10-15 fare), bir test ilaç grubu (n = 10-15 fare), standart bir bakım kemoterapi grubu (n = 10-15 fare) ve bir kombinasyon tedavi grubu (n = 10-15 fare).</li>
	<li>Fareleri intraperitoneal olarak salin (araç grubu), test ilacı (20 mg / kg) (test ilaç grubu), irinotekan (50 mg / kg) (standart bakım grubu) veya test ilacı (20 mg / kg) irinotekan (50 mg / kg) (kombinasyon tedavi grubu). Deneyin sonuna kadar uygulamayı haftada bir kez gerçekleştirin.</li>
	<li>Deney boyunca μCT taraması ile tümör büyümesini haftalık olarak izleyin.</li>
	<li>Deneyin sonunda, fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın ve karaciğerleri, akciğerleri ve diğer organlardaki diğer olası lezyonları toplayın.</li>
	<li>Doku örneklerini kasetlere dahil edin ve gece boyunca% 4 formalin içinde inkübe edin. Kontrol olarak çekumda tümör olmayan bir fareden alınan bağırsak dokusunu kullanın.</li>
	<li>Kasetleri formalinden çıkarın ve en az 3 saat% 70 etanol ile inkübe edin.</li>
	<li>Histopatoloji tesisi standart protokollerini kullanarak kasetleri parafin ile gömün.</li>
	<li>Histopatoloji tesisi standart protokollerini kullanarak çekum, karaciğer ve akciğerden hematoksilen ve eozin (H & E) boyaması gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Cancer+Statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Puig, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+preclinical+model+to+evaluate+the+metastatic+potential+of+patient-derived+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells.</a> Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li>
<li>Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer%3A+Metastases+to+a+single+organ%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer: Metastases to a single organ.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+micro-CT+colonography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small animal micro-CT colonography.</a> Methods. 50 (1), 36-41 (2010).</li>
<li>Boll, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-contrast+micro-CT+colonoscopy+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Colorectal+Disease%22%5BJournal%5D)">Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice.</a> International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+volume+in+subcutaneous+mouse+xenografts+measured+by+microCT+is+more+accurate+and+reproducible+than+determined+by+18F-FDG-microPET+or+external+caliper%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper.</a> BMC Medical Imaging. 8, 16(2008).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+x+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+colorectal+cancer+orthotopic+patient-derived+xenograft+models+for+cancer+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research.</a> Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).</li>
</ol>

Son birkaç on yılda, kolorektal kanser (KRK) dahil olmak üzere farklı tümör tiplerine sahip hastalarda birçok yeni anti-kanser tedavisi geliştirilmiş ve test edilmiştir. Birçok vakada klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar gözlenmesine rağmen, ileri metastatik KRK'li hastalarda terapötik etkinlik sıklıkla sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, klinik olarak anlamlı bir metastatik senaryoda yeni terapötik ilaçların etkinliğinin test edilmesine izin veren klinik öncesi modellere acil bir ihtiyaç vardır.
<p class="jove_c...

Kolorektal kanser (KRK), dünya çapında kanser ölümlerinin ikinci önde gelen nedenidir1. Bireysel hasta tümör hücrelerinden türetilen in vitro veya in vivo tümör modelleri üretme yeteneği, onkolojide gelişmiş hassas tıbba sahiptir. Son on yılda, hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) veya ksenogreftler (PDX'ler) dünya çapında birçok araştırma grubu tarafından kullanılmıştır2. PDO'lar, orijinal tümör dokusunun özelliklerine benzeyen, kendi kendini organize edebilen ve yenileyebilen çok hücreli in vitro yapılardır3. Bu umut verici in vitro modeller, ilaç taraması ve translasyonel araştırmaları kolaylaştırmak için başarıyla kullanılabilir. Öte yandan, PDX modelleri, orijinal CRC'yi histolojiden moleküler özelliklere ve ilaç yanıtınakadar ilgili tüm seviyelerde aslına uygun olarak özetlemektedir 2,4.
İn vivo PDX modelleri çoğunlukla immün yetmezliği olan farelerde deri altı tümörler olarak büyütülür. Bu yaklaşımı kullanarak, PDX'ler, özellikle ilaç duyarlılığını veya direncini incelemek için kanser araştırmalarında altın standart haline gelmiştir. Bununla birlikte, KRK ile ilişkili ölümler çoğunlukla karaciğer, akciğer veya periton boşluğunda metastatik lezyonların varlığı ile ilişkilidir ve iki yaklaşımın hiçbiri (PDO veya PDX) ileri klinik ortamı özetleyemez. Ek olarak, spesifik tümör büyüme bölgesinin, ilaç etkinliği ve hastalık prognozu üzerinde etkisi olan önemli biyolojik özellikleri belirlediği gösterilmiştir2. Bu nedenle, klinik olarak anlamlı bir metastatik ortamda antikanser ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek klinik öncesi modellerin oluşturulmasına acil bir ihtiyaç vardır6.
Mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) tarayıcıları, kanser hastalarının BT görüntüleriyle orantılı ölçekli bir görüntü çözünürlüğünde farelerde primer tümör ve metastaz görüntülemesi sağlayan küçültülmüş klinik BT tarayıcıları olarak işlev görebilir7. μCT tekniğinin zayıf yumuşak doku kontrastına karşı koymak için, kontrastı iyileştirmek ve tümör yükünü değerlendirmek için radyolojik iyotlu kontrast ajanlar kullanılabilir. İkili kontrast yaklaşımı kullanılarak, oral ve intraperitoneal iyot farklı zamanlamalarda uygulanır. Ağızdan uygulanan kontrast, bağırsak içindeki tümör dokusu ve çekum içeriği arasındaki sınırları tanımlamaya yardımcı olur.  Öte yandan, intraperitoneal olarak uygulanan kontrast, sıklıkla büyüyen ve peritonu invaze eden tümör kitlesinin dış sınırlarının belirlenmesine olanak tanır8.
Makale, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu gerçekleştirmek için bir protokolü ve μCT taraması kullanarak bağırsak tümörü büyümesini izleme metodolojisini açıklamaktadır. Bu makale, modelin PDO veya PDXO modelleri kullanılarak çalışılamayan KRK hastalarında ileri intestinal tümörler ve metastatik hastalıkların klinik senaryosunu özetlediğini göstermektedir. KRK'nin ortotopik PDX modelleri, KRK hastalarının klinik senaryosunu özetlediğinden, ileri intestinal tümörlerde ve metastatik hastalıkta anti-tümöral ilaçların etkinliğini test etmek için bugüne kadarki en iyi modeller oldukları sonucuna vardık.

<table><tbody><tr><td><güçlü >REAKTİF< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Apo-Transferrin</td><td>MERCK YAŞAM BİLİMLERİ SLU</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ek Yaşam</td><td>Teknolojileri SA (İspanya)</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Klorheksidin Sulu Çözelti% 2</td> <td>DH MALZEME M & Akut; DICO, Sl</td><td></td><td></td>1111696250</tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>MERCK YAŞAM BİLİMLERİ SLU</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 ve nbsp;</td><td>YAŞAM TEKNOLOJİLERİ A.Ş.</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp; &nbsp;</td><td>MERCK YAŞAM BILIMLERI S.L.U.</td><td>D4263-5VL</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PEPRO TECH EC LTD.</td><td>AF-100-15-500 ve mikro; g</td><td></td></tr><tr><td>FGF temel</td><td>PEPRO TEKNİK EC LTD.</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Yaşam Teknolojileri S.A (İspanya)</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>YAŞAM TEKNOLOJİLERİ A.Ş.</td><td></td><td></td>15750037</tr><tr><td>Heparin Sodyum Tuzu</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>H4784-250MG</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>MERCK YAŞAM BİLİMLERİ SLU</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iopamiro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzofluran&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>YAŞAM TEKNOLOJİLERİ A.Ş.</td><td></td><td></td>15160047</tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>YAŞAM TEKNOLOJİLERİ A.Ş.</td><td></td><td></td>25030032</tr><tr><td>Matrigel Matrisi</td><td>CULTEK, S.L.U.</td><td>356235/356234/354234</td><td></td></tr><tr><td>Metacam, 5 mg/mL</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>YAŞAM TEKNOLOJİLERİ A.Ş.</td><td></td><td></td>11140035</tr><tr><td>Nystatin</td><td>MERCK YAŞAM BİLİMLERİ SLU</td><td>N4014-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies S.A (İspanya)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), steril</td><td>Labclinics S.A</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>MERCK YAŞAM BİLİMLERİ SLU</td><td>P0130-25G</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>MERCK YAŞAM BİLİMLERİ SLU</td><td>P5780-5G</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lizis Tamponu&nbsp;</td><td>Labclinics S.A</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>YAŞAM TEKNOLOJİLERİ A.Ş.</td><td></td><td></td>11360039</tr><tr><td>Sodyum Selenit</td><td>MERCK LIFE SCIENCES S.L.U.</td><td>S5261-25G</td><td></td></tr><tr><td><GÜÇLÜ>TEMEL MALZEMELER</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 haftalık NOD. CB17-Prkdcscid / NcrCrl fareler</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 iğne 0.33 mm (29G) x 12.7 mm & nbsp;</td><td>BECTON DICKINSON, S.A.U.</td><td></td><td></td>320926</tr><tr><td>Bıçağı #24</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hücreli Süzgeç 100 ve mikro; m</td><td>Cultek, SLU</td><td>45352360</td><td></td></tr><tr><td>Forseps ve Cerrahi makas</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Isıtma yastığı</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Lacryvisc, 3 mg / g, oftalmik jel</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Surfasafe</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Suture PROLENE 5-0 &nbsp;</td><td>JOHNSON& JOHNSON S, A.</td><td>8720H</td><td></td></tr><tr><td>EKİPMAN / YAZILIM </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantum FX & mikro; Bilgisayarlı tomografi görüntüleme sistemi</td><td>Perkin Elmer Perkin</td><td>Elmer</td><td>http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083</td></tr></tbody></table>

farelerde hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik İmplantasyonu, İleri kolorektal kanseri Özetliyor

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Son on yılda, hasta kaynaklı kanser hücreleri ve 3D tümöroidler kullanılarak daha karmaşık klinik öncesi kolorektal kanser (KRK) modelleri oluşturulmuştur. Hasta kaynaklı tümör organoidleri orijinal tümörün özelliklerini koruyabildiğinden, bu güvenilir preklinik modeller kanser ilacı taramasını ve ilaç direnç mekanizmalarının incelenmesini sağlar. Bununla birlikte, hastalarda KRK'ye bağlı ölüm çoğunlukla metastatik hastalık varlığı ile ilişkilidir. Bu nedenle, anti-kanser tedavilerinin etkinliğini, insan kanseri metastazının temel moleküler özelliklerini gerçekten özetleyen ilgili in vivo modellerde değerlendirmek önemlidir. CRC hastadan türetilen kanser hücrelerinin doğrudan farelerin çekum duvarına enjekte edilmesine dayanan bir ortotopik model oluşturduk. Bu tümör hücreleri, çekumda karaciğer ve akciğerlere metastaz yapan primer tümörler geliştirir ve bu durum ilerlemiş KRK'li hastalarda sıklıkla görülür. Bu CRC fare modeli, hastalarda primer tümörleri veya metastazları kolayca tanımlayabilen, klinik olarak anlamlı küçük ölçekli bir görüntüleme yöntemi olan mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) ile izlenen ilaç yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerini implante etmek için cerrahi prosedürü ve gerekli metodolojiyi açıklıyoruz.

Hastadan türetilen kanser hücreleri ile ortotopik olarak implante edilen fareler, μCT taraması ile haftalık olarak izlendi. Deneyin sonunda hayvanlara ötenazi uygulandı. Bağırsaklar, çeka (Şekil 1A,B), karaciğerler, akciğerler ve diğer olası lezyonlar toplandı, bir kasete dahil edildi ve gece boyunca %4 formalin ile tespit edildi. Çekumda tümör saptanmayan bir fareden alınan bağırsak dokusu kontrol olarak kullanıldı (Şekil 1C). Son olarak, kaset...

Bu protokol, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu açıklar. Model, ilerlemiş kolorektal kanser metastatik hastalığını özetler ve klinik olarak anlamlı bir akciğer ve karaciğer metastazı senaryosunda yeni terapötik ilaçların değerlendirilmesine izin verir.

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Bu protokol, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu açıklar. Bu model, ilerlemiş kolorektal kanser metastatik hastalığını özetlemektedir. Burada sunulan ortotopik kolorektal kanser modeli, kolorektal kanser hastalarında ileri bağırsak tümörleri ve metastatik hastalığın klinik senaryosunu özetlemektedir ve hasta kaynaklı organoidler veya hasta kaynaklı ksenogreft modelleri kullanılarak çalışılamamaktadır.Ötenazi uygulanmış bir fareden, makas ve forseps kullanarak tümörü deriden ve çevresindeki tümör olmayan dokudan dikkatlice çıkararak çıkarın. Hasat edilen tümörleri dört santigrat derecede PBS'ye yerleştirin. Bir bıçak kullanarak, tümörleri bir milimetre ortam içeren 10 santimetrelik bir kültür plakasında ayırın.Homojen ayrışmış numuneyi 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Ardından, ortamı beş mililitrelik son hacme ekleyin. Ardından, sindirim ortamını tüpe ekleyin.Tüpü, 37 santigrat derecede bir saat boyunca bir hücre kültürü inkübatörünün içine 45 derecelik bir konuma yerleştirin. Bir saatlik inkübasyon sırasında, çözeltiyi her 15 dakikada bir beş mililitrelik bir pipetle karıştırın. İnkübasyondan sonra,

orthotopic-implantation-patient-derived-cancer-cells-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Çekum üzerine bir kanser hücre süspansiyonu çekal duvar subkutan tümörün bir parçasının veya transplantasyon içine enjeksiyon: İki teknikleri bu modeli kurmak için kullanılan olabilir. Bu model, kolorektal kanseri doğal bir ilerleme eğitim ve kolorektal kansere karşı yeni tedavi ajanları test için yararlıdır.

Kolorektal Kanser Ortotopik Fare Modeli

Video, bir fare modelinde meme kanseri ortotopik aşılama tekniğini göstermektedir. Bu teknik, deri altı veya cerrahi olmayan enjeksiyona kıyasla tümör boyutu ve şeklinde daha az değişkenlik ile yüksek bir tümör oluşumu oranı üretir.

Ortotopik Enjeksiyon: Dokuya Özgü Kanser Hücrelerinin Yetişkin Bir Fareye İmplante Edilmesi

Bu videoda, kolorektal kanser hastadan türetilmiş ksenogreftlerin veya PDX'lerin spontan metastaz fare modelini oluşturmak için kullanılan protokol açıklanmaktadır. Bu ksenogreft modelleri, insan karsinomlarının özelliklerini kısmen taklit eder ve invazyon ve metastaz dahil olmak üzere insan malignitelerinin kritik yönlerini anlar.

Spontan Metastaz Fare Modelleri: Ortototopik Olarak Enjekte Edilen Kolorektal Kanser Hücrelerinin Metastatik Potansiyelini İncelemek İçin Bir Platform

Videoda, yüksek derecede homojen tümörlere sahip ortotopik bir fare modeli geliştirmek için kanserli hücrelerin intracekal enjeksiyonu tekniği açıklanmaktadır. Bu nedenle, ortotopik fare modeli, metastazın gerçekçi simülasyonuna izin vererek, tümör büyümesi ve yayılması sırasındaki fenotip değişikliklerini incelemek için değerli bir araç sağlar.

İntracekal Tümör Hücresi Enjeksiyonu: Ortotopik Kolorektal Kanser Fare Modeli Oluşturmak için Kanser Hücreleri Verme Tekniği

Metastatik klonların uzak bölgeleri kolonize etme yeteneği, çoğalma kapasitelerine ve/veya önemli bir çoğalma olmaksızın konakçı mikro ortamda hayatta kalma yeteneklerine bağlıdır. Burada, metastatik klonlar tarafından her iki tip karaciğer kolonizasyonunun kantitatif olarak görselleştirilmesine izin veren bir hayvan modeli sunuyoruz.

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Segmental adeno-cre enfeksiyonu ile genetik olarak tasarlanmış kolorektal kanserli fare modeli kurulması ve yüksek çözünürlüklü kolonoskopi ile gözlemlenmesi için bir protokol sunulmuştur.

Sporadik Kolorektal Kanserin Genetik Olarak Geliştirilmiş Fare Modeli

Biz son derece hassas yayılmasından insan kolorektal kanseri tespiti (CRC) hücre dokuları kolonileşmesi izin vermek için burada PDX kaynaklı CRC organoid hücrelere yeşil flüoresan protein (GFP) lentiviral parçacıkların verimli iletim için bir protokol göster stereo-floresan mikroskobik gözlem ile alıcı fareler içine onların enjeksiyon önce.

Bir hasta kaynaklı kolon tümöründen kültürlü GFP Lentivirus transduced Organoids tarafından oluşturulan Micrometastases yüksek-duyarlı tespiti

Burada, biz meme kanseri hücrelerinin basit, daha az invaziv ve ele kolay bir şekilde meme yağ yastığı içine implant için bir protokol mevcut ve bu fare orthotopic meme kanseri model uygun meme yağ yastığı yapısına sahip çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir kanser.

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

Bu protokol, yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu hücrelerinin intra-vesically instilling veya intra-rektal enjekte kolorektal kanser hücreleri olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine tarafından hasta türeyen ortootopik xenograft modellerinin oluşturulması açıklanmaktadır immüneksikliği (NOD/SCıD) primer tümör büyümesi için fareler ve lenf nodu stromal hücrelerin etkisi altında spontan metastaz, hangi insan metastatik hastalıkların ilerlemesini taklit.

Insan Üromotorial Hücre Karsinomu ve kolorektal kanser tümörü büyüme ve spontan Metasrik için hasta türevi Ortootopik xenograft modelleri

Kolorektal kanser (KRK) organoidlerinin portal ven enjeksiyonu stroma bakımından zengin karaciğer metastazı oluşturur. CRC hepatik metastazının bu fare modeli, tümör-stroma etkileşimlerini incelemek ve adeno ilişkili virüs aracılı gen terapileri gibi yeni stroma yönelimli terapötikler geliştirmek için yararlı bir araçtır.

Karaciğer Metastazı Stromasını İncelemek için Kolorektal Kanser Organoidlerinin Portal Ven Enjeksiyonu

Öğrenin farelerde hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu, ileri kolorektal kanser metastazını ve yeni tedavi ilaçlarının değerlendirilmesini. Bu model akciğer ve karaciğer metastazlarının klinik senaryosunu taklit eder.

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Daha fazla video keşfet