Name: Murin Koroidinde Melanomun İmplantasyonu ve Optik Koherens Tomografi ile Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Öğrenin, optik koherens tomografi kullanarak fare koroidinde melanom implantasyonu ve değerlendirmesi için bu yöntemi. Canlı görüntüleme ile tümör büyümesini sürekli izleyerek homojen çalışma grupları oluşturun ve üvea melanomu tedavi araştırmalarına katkı sağlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Arie Marcovich için İsrail'deki İsrail Bilim Vakfı'ndan (ISF) 1304/20 hibe ile desteklenmiştir. Histoloji analizi için İsrail, Rehovot, Kaplan Tıp Merkezi, Patoloji Bölümü'nden Shahar Ish-Shalom ve Ady Yosipovich'e teşekkür ederiz.

Protokoldeki deneyler İsrail Ulusal Hayvan Deneyleri Konseyi tarafından onaylandı ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanılması için ARVO Beyanı'na uygun. Bu çalışma için 8-10 haftalık dişi C57BL/6 fareler kullanılmış ve 12/12 saatlik aydınlık-karanlık döngülerine maruz bırakılmıştır. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Hücre kültürü
<ol><li>RPMI 1640 ortamındaki kültür B16LS9 hücreleri,% 10 fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 25 mM HEPES,% 1 esansiyel vitamin karışımı,% 200 U / mL penisilin ve 200 mg / mL streptomisin ile desteklenmiştir (bakınız Malzeme Tablosu), % 5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatörde.</li>
	<li>Enjeksiyon için hücreleri% 70-80 birleşimde toplayın.</li>
</ol>2. Hayvan hazırlama
<ol><li>Ketamin (75 mg / kg vücut ağırlığı) ve medetomidin (0.5 mg / kg vücut ağırlığı) anestezik bir karışımı hazırlayın. Anestezik karışımı tek bir enjeksiyonda intraperitoneal olarak enjekte ederek fareleri uyuşturun.</li>
	<li>Her iki göze topikal oftalmik anestezik oksibuprokain (% 0.4) uygulayın.</li>
	<li>Topikal olarak tropikamid uygulayarak fare gözbebeklerini genişletin (% 0.5).</li>
</ol>3. Subkoroidal boşluğa konjonktival peritomi ve skleral trakt oluşturulması
<ol><li>Kurumayı önlemek için her iki göze de yağlayıcı olarak% 1.4 hidroksietilselüloz ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın. Sağ göze% 0.5 tropikamid uygulayın.</li>
	<li>Farenin çalışan gözünü bir çalışma mikroskobu altında gözlemleyin (bkz. Göz kapaklarını steril göz içi forseps ile açık tutun.</li>
	<li>Göz içi forseps kullanarak, süpero-temporal limbal konjonktivayı tutun ve infra-nazal pozisyona doğru çekin22. Bu pozisyonu tüm prosedür boyunca tutarak güvence altına alın (Şekil 1A).</li>
	<li>30 G'lik bir iğne ucu kullanarak, dorsal-temporal bölgede, limbusun yaklaşık 1-2 mm arka tarafında küçük (1-2 mm) bir konjonktival peritomi yapın. NOT: Daha ince iğnelerin kullanılması aşırı delinmeyi önleyebilir ve tümör yerinin daha iyi kesinleştirilmesini sağlayabilir.</li>
	<li>Fazla Tenon kapsülünü peritominin açıklığından çıkarın. NOT: Tenon kapsülü, göz küresini çevreleyen yoğun bir bağ dokusu tabakasıdır22.</li>
	<li>Bu konumda, skleraya nüfuz etmek için iğne ucunu yerleştirin. Koroidin kahverengi rengi skleranın maruz kalan beyaz maddesinden görünene kadar alt koroidal boşluğa bir yol oluşturmak için bir eksizyon yapın (Şekil 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64632/64632fig01.jpg"> Şekil 1: Tümör hücre aşılaması . (A) Süpero-temporal limbal konjonktiva, göz içi forseps kullanılarak tutulur ve burun altı pozisyona doğru çekilir. (B) 30 G'lik bir iğnenin ucu, skleraya nüfuz etmek için yerleştirilir ve alt koroidal boşluğa bir iz oluşturmak için eksizyon yapılır. (C) Hücrelerle yüklü ve 32 G'lik bir iğne ile monte edilmiş bir şırınga raya yerleştirilir ve hücreler enjekte edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64632/64632fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Melanom hücrelerinin aşılanması
<ol><li>2 μL PBS'de 70.000 B16LS9 hücresini yeniden askıya alın. Bu miktar göz başına tahmin edilir.</li>
	<li>Hücreleri, 45° açıyla bükülmüş 32 G künt iğne ile monte edilmiş steril bir 10 μL cam Hamilton şırıngasına (bkz. Malzeme Tablosu) yükleyin.</li>
	<li>Yüklenen şırınga iğnesini adım 3'te oluşturulan parçaya yaklaşık 2 mm yerleştirin.</li>
	<li>2 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.</li>
	<li>Enjeksiyondan sonra iğneyi tüm sıvı temizlenene kadar 2-3 saniye boyunca yerinde tutun.</li>
	<li>İzden sızıntıyı önlemek için iğneyi yavaşça ve yavaşça çekerek çıkarın (Şekil 1C). NOTLAR: Enjeksiyonun hızını ve kuvvetini ayarlamak, tümör gelişim modelini etkileyebilir. Bu parametrelerin, uygulanan doğru kuvveti ve hızı belirlemek için deney yapan bireyler tarafından kalibre edilmesi önerilmektedir. Ön deneylerde toplam 70.000 hücre belirlendi. Bununla birlikte, hücre kültürü tiplerinde veya partilerinde veya fare suşları arasında farklılıklar olabileceğinden, bu sayının kalibrasyonu gereklidir.</li>
</ol>5. Enjeksiyonun yerinin değerlendirilmesi
<ol><li>Vitreus23'te retina dekolmanı (RD), retina hasarı ve / veya hücrelerin görünümünü tanımlamak için melanom hücre aşılamasından hemen sonra enjekte edilen gözü OCT taramalarıyla gözlemleyin. NOTLAR: Tropikamid, oksibuprokain ve etilselülozu gerektiği gibi tekrar uygulayın.</li>
	<li>Adım 5.1'deki OCT taramalarına dayanarak, RD desenleri21'i aşağıdakilere göre sınıflandırın: (1) RD'nin yerel RD-one bölgesi; (2) vitreustaki vitreus gözlemleyen hücre materyaline sızıntı; (3) RD'nin genişletilmiş RD-çoklu siteleri.</li>
	<li>Tümör lokalizasyonunu aşağıdakilere dayanarak tahmin edin: (1) lokal RD beklenen koroidal tümörler; (2) vitreustaki vitreus beklenen tümörlere sızıntı; (3) uzamış RD beklenen değişken ve dağınık tümörler (Şekil 2). NOT: Sadece lokal RD'li farelerin (yaklaşık% 50) koroid ile sınırlı tümörler geliştirmesi beklenir.</li>
</ol>6. RD yüksekliğine göre tümör boyutunu tahmin etme
<ol><li>OCT segmentasyon/analiz yazılımı kullanarak OCT taramalarında yerel RD'nin yüksekliğini ölçün (bkz. Malzeme Tablosu) ve aşağıdaki gruplara göre sınıflandırın: küçük = &lt;300 μm; orta = 300-400 μm; büyük = &gt;400 μm.</li>
	<li>Tümörlerin enjeksiyondan sonraki 5 gün içinde ulaşması beklenen hacmi aşağıdaki kriterlere göre değerlendirin: Küçük boyutlu tümörlerde tipik olarak küçük bir RD yüksekliği gözlenir (tümör hacmi 0.0059 mm 3 ila 0.07 mm3 arasında değişir ve ortalama hacim 0.027 ± 0.005 mm3'tür). Hem küçük hem de orta büyüklükteki tümörlerde orta RD yüksekliği bulunur (tümör hacmi 0.015 mm 3 ila 0.15 mm 3 arasında değişir ve ortalama hacim 0.056 ± 0.016 mm 3'tür). Büyük bir RD yüksekliği, 0.36 mm3'e kadar çok çeşitli tümör hacimleri ile ilişkilidir. NOT: Beklenen tümör boyutları aralığı önceki sonuçlardan elde edildi ve küçük, orta ve büyük tümörlerden oluşan üç gruba ayrıldı.</li>
</ol>7. Postoperatif işlemler
<ol><li>Topikal olarak% 0.3 oftalmik ofloksasin uygulayın.</li>
	<li>Deri altına atipamezol hidroklorür (3 mg/kg) enjekte ederek anesteziyi tersine çevirin.</li>
	<li>Hayvanların ağrı ve ıstırabını azaltmak için 3 gün boyunca günde iki kez deri altından buprenorfin (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin.</li>
	<li>Melanom hücresi enjeksiyonundan 5 gün sonra, aşağıdaki adımları izleyerek tümör boyutunu değerlendirin.<ol><li>Fareleri adım 2.1'de açıklandığı gibi uyuşturun. Tropikamid uygulayın (% 0.5).</li>
		<li>Gözleri uzunlamasına ve sagital OCT taramaları ile inceleyin ve tümör hacmini ve lokalizasyonunu ölçmek için OCT segmentasyon / analiz yazılımı kullanın.</li>
		<li>24 formülünü kullanarak tümör hacmini hesaplayın: V = a * b * c * 6 / π (sırasıyla a, b ve c = uzunluk, genişlik ve yükseklik).</li>
		<li>Tümör boyutunu her 2-3 günde bir 7.4.1-7.4.3 adımlarında açıklandığı gibi inceleyin. NOT: Farklı fare suşları veya hücre çizgileri kullanılıyorsa yordam en iyi duruma getirilmelidir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Jager, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Uveal melanoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).</li>
<li>Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+P+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22">Seminars in Cancer Biology</a>. 71, Academic Press. 65-85 (2021).</li>
<li>Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+treatment+of+choroidal+melanoma+in+relation+to+the+prevention+of+metastatic+death-A+personal+view%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).</li>
<li>Jouhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+fatal+choroidal+melanoma+study.+A+survey+by+the+European+Ophthalmic+Oncology+Group%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group.</a> American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).</li>
<li>Cao, J., Jager, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+eye+models+for+uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Oncology+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal eye models for uveal melanoma.</a> Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).</li>
<li>Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Eye+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of uveal melanoma.</a> Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).</li>
<li>Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+2b+decreases+hepatic+micrometastasis+in+a+murine+model+of+ocular+melanoma+by+activation+of+intrinsic+hepatic+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).</li>
<li>Yang, H., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunologic+and+anti-angiogenic+therapy+reduces+hepatic+micrometastases+in+a+murine+ocular+melanoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model.</a> Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).</li>
<li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+%26+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li>
<li>Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B16LS9+melanoma+cells+spread+to+the+liver+from+the+murine+ocular+posterior+compartment+%28PC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC).</a> Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).</li>
<li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+%26+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li>
<li>Ashur-Fabian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrac+delayed+the+onset+of+ocular+melanoma+in+an+orthotopic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 632335(2019).</li>
<li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+c-met+overexpression+in+liver-metastatic+B16-LS9+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).</li>
<li>Harning, R., Szalay, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+metastasis+of+in+vivo+and+in+vitro+derived+syngeneic+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).</li>
<li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li>
<li>Notting, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+bioluminescent+imaging+of+human+uveal+melanoma+in+a+new+mouse+model+of+local+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+xenograft+murine+human+uveal+melanoma+model+develops+hepatic+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases.</a> Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).</li>
<li>Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases.</a> Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).</li>
<li>Drexler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-resolution+ophthalmic+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography.</a> Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).</li>
<li>Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+of+mouse+models+with+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotyping of mouse models with OCT.</a> Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).</li>
<li>Zaks, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+imaging+for+assessing+tumor+growth+in+mouse+models+of+ocular+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma.</a> Experimental Eye Research. 204, 108431(2021).</li>
<li>Brar, V. S. American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrar%2C+VS+%22Fundamentals+and+principles+of+ophthalmology%22">Fundamentals and principles of ophthalmology</a>. , (2022).</li>
<li>Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuker%2C+JS+%22Handbook+of+Retinal+OCT%3A+Optical+Coherence+Tomography%2C+2nd+Edition%22">Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition</a>. , Elsevier Health Sciences. (2021).</li>
<li>Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+subcutaneous+tumor+size+in+athymic+%28nude%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).</li>
<li>Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+uveal+melanoma%3A+Strengths%2C+weaknesses%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (2), 264(2020).</li>
<li>Chen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+molecular+imaging-escorted+adipose+photodynamic-browning+synergy+for+fighting+obesity+with+virus-like+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes.</a> Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+visualization+of+early+cancer+hepatic+micrometastasis+and+intraoperative+image-guided+surgery+by+photoacoustic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).</li>
</ol>

Marcovich A.L.: Steba Biotech (P), Yeda Weizmann (P), EyeYon Medical (C, P), Mor Isum (P). (C) = Danışman; (P) = Patent. Diğer tüm yazarların birbiriyle çelişen çıkarları yoktur.

Üveal melanom, yeni terapötik yaklaşımlara büyük ihtiyaç duyulan yıkıcı bir hastalıktır. Bununla birlikte, üveal melanom ve potansiyel tedaviler üzerine yapılan araştırmalar, üveal melanom hayvan modellerinin teknik zorlukları ile sınırlıdır 1,25. Kanser hücrelerinin göz içi enjeksiyonu ile indüklenen oküler tümörler, muhtemelen fare gözünün küçük boyutları nedeniyle, hem lokalizasyon hem de boyut bakımından oldukça değişkendir. Bu değişkenlik, tümör progresyonun...

Üveal melanom (UM) erişkinlerde en sık görülen göz içi primer malignitedir. Oküler melanomların yaklaşık% 90'ı üveal sistem1'in koroid bölgesindeki melanositlerden kaynaklanır. UM, morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir, çünkü hastaların% 50'sine yakınının metastatik hastalık geliştirdiği ve karaciğerin metastaz2'nin ana bölgesi olduğu tahmin edilmektedir. Primer lezyonların erken tedavisi metastaz olasılığını azaltabilir, ancak etkili bir tedavi metastaz oluşumunu engellemez3.
Üveal melanomun standart tedavisi, optik nöropati, retinopati, kuru göz sendromu ve katarakt nedeniyle görme kaybı ile ilişkili ışınlama tedavisini içerir. Cerrahi rezeksiyon tipik olarak lezyonun büyümesi tanınana ve karakterize edilene kadar ertelenir. Bununla birlikte, böyle bir gecikme metastatik hastalık gelişimine izin verebilir4. Bazı durumlarda, boşuna enükleasyon gereklidir. Tabii ki, bu radikal prosedür vizyonu tehlikeye atar ve dramatik estetik bozulmaya neden olur.
Üveal melanomu incelemek için deneysel modeller geliştirmeye adanmış birçok çaba gösterilmiştir. Bu malignitenin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan preklinik hayvan modelleri, üveal melanom için yeni tanı ve tedavi stratejilerinin araştırılmasında anahtardır. Oküler melanomun deneysel hayvan modelleri esas olarak farelerde, sıçanlarda ve tavşanlarda tümör hücrelerinin aşılanmasına dayanmaktadır 5,6. Fare modelleri uygun maliyetlidir ve hızlı üreme hızları ve insanlara yüksek genom benzerlikleri nedeniyle melanom çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Murin kutanöz melanom hücre hattı B16, C57BL6 farelerini aşılamak ve sinjenik tümörleri indüklemek için yaygın olarak kullanılır. Üveal melanomu indüklemek için bu modeli kullanırken, tümör taşıyan gözlerin tipik olarak aşılamadan 7-14 gün sonra enükleasyona tabi tutulması gerekir. Ayrıca, B16 oldukça invaziv bir modeldir. Gözün bağışıklık ayrıcalıklı doğası metastazı destekler ve metastazlar tipik olarak tümör hücresi aşılamasından 3-4 hafta sonra tespit edilebilir. Orijinal B16 çizgisinin alt kültürleri farklı metastatik özellikler gösterir6. Örneğin, Queens melanom hattı yüksek bir metastatik orana sahiptir 7,8. B16LS9 hücre hattı dendritik hücre morfolojisine sahiptir ve ebeveyn kutanöz melanom hattı B16F19 ile enjekte edilen C57BL / 6 farelerin karaciğer metastazlarından türetilmiştir. Gözün arka bölmesine enjekte edildiğinde, bu hücrelerin histolojik olarak insan üveal melanomuna benzeyen ve C57BL / 6'da karaciğere özgü metastazlar oluşturan, ancak Balb / C'de değil, fareler10,11,12'de karaciğere özgü metastazlar oluşturan göz içi tümörler oluşturduğu gösterilmiştir. Genetik olarak, hücreler, hepatosit büyüme faktörü13 için hücresel bir reseptör görevi gören c-met proto-onkogeninin daha yüksek ekspresyonu ile karakterize edilir. Buna karşılık, ebeveyn B16'nın 10. geçişi olan B16F10, göz içinden aşılandığında öncelikle akciğerlere metastaz yapar14. Hem B16F10 hem de B16LS9 pigmentlidir12.
Bazı önemli zorluklar murin üveal melanom modellerinin başarısını sınırlamaktadır. İlk olarak, tümör hücresi reflüsü ekstraoküler veya subkonjonktival melanoma yol açabilir. İkincisi, melanom hücrelerinin göz içi aşılamasından sonra tümör büyümesi genellikle oldukça değişkendir ve tedavi ve ilerlemeyi değerlendirmede zorluklar doğurur. Bir diğer önemli zorluk, tümör büyümesini in vivo olarak takip etme yeteneğinin sınırlı olmasıdır. Lusiferaz eksprese eden tümörler gibi biyolüminesan görüntüleme, oküler tümör büyümesini izlemek için yaygın olarak kullanılır15,16, tümörün göz içi yerleşimi hakkında bilgi sağlayamaz. Bu nedenle, tümörün değerlendirilmesi tipik olarak gözün enükleasyonunu takiben yapılır10,17. Bu, tümör progresyonunu ve tedavilere yanıtı kapsamlı bir şekilde karakterize etme yeteneğini büyük ölçüde sınırlar. Üveal melanomun incelenmesindeki bir diğer önemli engel, pigmentli farelerde lezyonların izlenmesindeki zorluktur. Bu zorlukların üstesinden gelen yeni yaklaşımlar, hayvan modellerinde üveal melanom araştırmalarını teşvik etmek için gereklidir.
Optik koherens tomografi (OCT), gözün farklı bölümlerine yüksek çözünürlükte derinlemesine görüntü vermek için ayırt edici yetenekler sağlar, bu da ultrason18,19 dahil olmak üzere diğer metodolojilerle benzersizdir. OCT görüntüleme, çeşitli oküler hastalıkları incelemek için hayvan modellerinde kullanılmıştır20. Son zamanlarda, OKT görüntülemenin göz içi tümör büyümesini değerlendirmek için noninvaziv bir araç olduğu gösterilmiştir21. Burada tarif edilen protokol, melanom hücrelerinin murin koroidine implantasyonunu ve hücre aşılaması sırasında göz içi tümör lokalizasyonunu ve boyutunu tahmin etmek için OCT'nin kullanımını göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>10 & mu; L cam şırınga (Hamilton Co., Bonaduz, İsviçre)</td><td>Hamilton</td><td>721711</td><td></td></tr><tr><td>30 G iğneler</td><td>BD Microbalance</td><td>2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol hidroklorür</td><td>Orion Phrma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16LS9 hücreleri</td><td>Hans Grossniklaus USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin&nbsp;</td><td>richter pharma</td><td>102047</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 dişi fareler</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essential vitamin karışımı</td><td>satorius</td><td>01-025-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>renyum</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>satorius</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hidroksietilselüloz %1.4 göz damlası</td><td>Fisher İlaç</td><td>390862</td><td></td></tr><tr><td>InSight OCT segmentasyon yazılımı&nbsp;</td><td>Phoenix Micron, Inc&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>bremer ilaç GMBH (medimarket)</td> <td>17889</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>satorius</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidin ve nbsp;</td><td>zoetis (vetmarket)</td><td>102532</td><td></td></tr><tr><td>Ofloksasin% 0.3 göz damlası</td><td>alerjisi</td><td>E92170</td><td></td></tr><tr><td>Optik koherens tomografi (nbsp;</td><td>Phoenix Micron, Inc&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oksibuprokain% 0.4</td> <td>Fisher İlaç</td><td>393050</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin-amfoterasin</td><td>satorius</td><td>03-033-1B</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS) &nbsp;</td><td>satorius</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI hücre ortamı</td><td>satorius</td><td>01-104-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>satorius</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>OPMI-6 CFC</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide %0,5</td> <td>Fisher İlaç</td><td>390723</td><td></td></tr></tbody></table>

murin koroidinde melanomun İmplantasyonu ve optik koherens tomografi ile değerlendirilmesi

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Deneysel koroidal melanom modellerinin oluşturulması, tümörleri doğru lokalizasyonda indükleme yeteneği açısından zordur. Ek olarak, posterior koroidal melanomun in vivo olarak gözlemlenmesindeki zorluklar, tümör lokalizasyonunu ve büyüme değerlendirmesini gerçek zamanlı olarak sınırlar. Burada açıklanan yaklaşım, çok aşamalı bir alt koroidal B16LS9 hücre enjeksiyon prosedürü ile farelerde koroidal melanom oluşturmak için teknikleri optimize eder. Fare uveasının küçük boyutlarına enjeksiyonda hassasiyet sağlamak için, tüm prosedür mikroskop altında gerçekleştirilir. İlk olarak, gözün dorsal-temporal bölgesinde konjonktival bir peritomi oluşur. Daha sonra, maruz kalan skleradan bir iğne sokularak alt koroidal boşluğa bir yol oluşturulur. Bunu künt bir iğnenin kanala sokulması ve melanom hücrelerinin koroide enjekte edilmesi izler. Enjeksiyondan hemen sonra, tümörün lokalizasyonunu ve ilerlemesini belirlemek için noninvaziv optik koherens tomografi (OCT) görüntüleme kullanılır. Retina dekolmanı, tümör yeri ve boyutunun belirleyicisi olarak değerlendirilir. Sunulan yöntem, farelerde koroid lokalize melanomun tekrarlanabilir indüksiyonunu ve tümör büyüme değerlendirmesinin canlı görüntülenmesini sağlar. Bu nedenle, göz içi tümörleri incelemek için değerli bir araç sağlar.

Gözler, B16LS9 hücrelerinin enjeksiyonundan hemen sonra OCT ile incelendi. Enjeksiyon sonrası lokal retina dekolmanı gözlendi. Fareler üç RD paterni sergiledi: fokal (Şekil 2, üst panel), vitreusa sızıntı (Şekil 2, orta panel) ve genişletilmiş RD (Şekil 2, alt panel). Uzatılmış RD muhtemelen enjeksiyondan kaynaklanan hasardan kaynaklanır. Enjeksiyondan hemen sonra RD paterni ile enjeksiyondan 5-7 gün sonra tümörlerin lokali...

Bu protokol, optik koherens tomografi kullanılarak murin koroidine melanomun implantasyonu ve değerlendirilmesini tanımlamaktadır.

Murin Koroidinde Melanomun İmplantasyonu ve Optik Koherens Tomografi ile Değerlendirilmesi

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Tümörleri gözün arka kısmı olarak belirlemek zordur. Bu yöntem, farelerde tekrarlanabilir koroidal melanom tümörlerinin indüksiyonunu ve değerlendirme için tümör büyümesinin canlı görüntülenmesini sağlar. Bu protokol, tümör hücresi aşılaması sırasında tümörlerin yerini değerlendirmek ve canlı hayvanlarda tümör büyümesini takip etmek için OCT canlı görüntülemeyi kullanır.Üveal melanom %50'ye yakın metastaz oranı ile yıkıcı bir hastalıktır. Deneysel modeller geliştirmek, yeni terapötik olasılıklara yönelik araştırmaları ilerletmenin anahtarıdır. Bu yöntemin bir avantajı, enjeksiyon başarısının derhal değerlendirilmesinin, homojen tümörleri olan çalışma gruplarına ulaşmayı ve canlı görüntüleme ile sürekli takip etmeyi sağlamasıdır.Tümör progresyonunu incelemek. Küçük farenin gözlerine enjekte etmek pratik gerektirir. Enjekte edilen hücreleri görselleştirme yeteneği, başarınızı hemen değerlendirmenize ve gerektiğinde daha fazla fareyle tekrarlamanıza olanak tanır.Prosedürü gösteren, Kaplan Tıp Merkezi'ndeki Oftalmoloji Araştırma Laboratuvarı'ndan Dr. Dimitri Gaber olacaktır. Başlamak için, anestezi uygulanan farenin her iki gözüne% 0.4 topikal oftalmik anestezik, Oxybuprocaine uygulayın. Daha sonra topikal olarak, göz bebeklerini genişletmek için her iki göze de% 0.5 Tropikamid, ardından gözlerin kurumasını önlemek için bir yağlayıcı olarak% 1.4 hidroksietil selüloz uygulayın.Farenin bir gözünü ameliyat mikroskobu altında gözlemleyin. Göz kapaklarını steril göz içi forseps ile açık tutun. Daha sonra üstün temporal limbo-konjonktivayı tutun ve bir infra nazal pozisyonuna doğru çekin.İşlem boyunca limbo-konjonktivayı tutarak bu pozisyonu güvence altına alın. 30 gauge'lik bir iğne ucu kullanarak, dorsal temporal bölgede limbusun yaklaşık bir ila iki milimetre arkasında küçük bir konjonktival peritomi yapın. Fazla tendon kapsülünü peritominin açıklığından çıkarın.Skleraya nüfuz etmek için iğne ucunu yerleştirin ve koroidin kahverengi rengi skleranın maruz kalan beyaz maddesinden görünene kadar subkoroidal boşluğa bir iz bırakın. Hücreleri, 45 derecelik bir açıyla bükülmüş 32 gauge künt bir iğne ile monte edilmiş steril bir 10 mikrolitrelik cam Hamilton şırıngasına yükleyin. Yüklenen şırınganın iğnesini oluşturulan kanala yaklaşık iki milimetre yerleştirin ve hücre süspansiyonunun iki mikrolitresini enjekte edin.Enjeksiyondan sonra iğneyi tüm sıvı temizlenene kadar iki ila üç saniye boyunca yerinde tutun. Kanaldan sızıntıyı önlemek için iğneyi yavaşça dışarı çekerek çıkarın. Melanom hücresi aşılamasından hemen sonra, OCT taramaları ile hayvanın enjekte edilen gözünü gözlemleyin.Taramalara dayanarak, retina dekolmanı veya RD paternlerini üç kategoriye göre sınıflandırın yerel RD, Vitreus İçine Sızıntı veya Genişletilmiş RD. RD yüksekliğine göre tümör boyutunu tahmin etmek için bir OCT segmentasyon analiz yazılımı açın. OCT taramalarında Yerel RD'nin yüksekliğini ölçün ve bunları üç gruba ayırın. Postoperatif aşamada, topikal olarak% 0.3 oranında Ofloksasin uygulayın.Subkoroidal hücre enjeksiyonunu takiben tümör büyümesinin OKT temelli tahmini bu şekilde gösterilmiştir. Fareler RD, Focal, Leakage To The Vitreus ve Extended RD'nin üç modelini sergiledi. Enjeksiyondan hemen sonra RD paterni ile enjeksiyondan beş gün sonra tümörlerin lokalizasyonu arasında bir ilişki vardı. Fokal RD, koroid ile sınırlı tümör hücresi büyümesi ile ilişkiliydi.Bununla birlikte, Fokal RD gösteren hayvanlarda enjeksiyondan sonra vitreustaki hücrelerin gözlemlenmesi, vitreal boşlukta ve koroidde tümör büyümesini göstermiştir. Enjeksiyondan sonra uzamış RD gözlendiğinde, tümörler beş gün sonra koroid ve vitreus boyunca dağıldı. Bu modelde indüklenen tümör boyutlarının aralığı küçük, orta ve büyük olarak ayrılabilir.Burada, enjeksiyondan sonra RD yüksekliğinin OCT ölçümünün temsili görüntüleri ve buna karşılık gelen fundus görüntüsü, enjeksiyondan sonraki beşinci günde tümör yüksekliğinin ve genişliğinin yatay bir OCT taraması ve buna karşılık gelen fundus görüntüsü ve karşılaştırılabilir tümör ölçümlerini gösteren ilgili H &E lekeli göz bölümü gösterilmektedir. Hücre enjeksiyonundan hemen sonra küçük, orta veya büyük RD sunan farelerin tümör hacim ölçümleri burada sunulmuştur. Enjeksiyon kuvvetinin ayarlanması tümör boyutunu ve yerini etkileyebilir.Bunu kalibre etmek ve enjeksiyondan sonra OCT ile indüklenen retina dekolmanı paternini değerlendirmek önemlidir. Koroidal tümörlerin canlı görüntülenmesi, farklı faktörlerin veya potansiyel tedavilerin tümör progresyonu üzerindeki etkisini incelemeyi sağlayan önemli bir deneysel araçtır.

implantation-evaluation-melanoma-murine-choroid-via-optical-coherence

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, bir fare enfeksiyöz üveit fare modelinde göz iltihabını tespit etmek ve ölçmek için in vivo bir görüntüleme tekniğini göstermektedir. Optik koherens tomografi (OCT) olarak bilinen teknik, hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için gözün yüksek çözünürlüklü kesitsel görüntülerini üretir.

Bir Fare Modelinde Üveiti Değerlendirmek için Optik Koherens Tomografi Görüntüleme

Source: Jagodzinska, J., et. al., Optik Koherens Tomografi: Fare Retinal Ganglion Hücrelerini Görüntüleme In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  Bu videoda, optik nöropatili genetik olarak değiştirilmiş bir fare modelinde retina katmanlarını görüntülemek ve yapısal değişiklikleri değerlendirmek için spektral alan optik koherens tomografinin (SD-OCT) kullanımını gösteriyoruz.

Optik Koherens Tomografi Kullanılarak Fare Retinasının İn Vivo Görüntülenmesi

Biz, tümörün büyüme sırasında oynayan normal biyo-fiziksel kısıtlamalar tekrarıdır intravital iki foton mikroskopi için farelerde kortikal glioblastoma ortotopik bir model oluşturduk. Tümörün yukarıdaki kafatasını yerine bir kronik cam pencere, iki-foton mikroskobu ile zamanla tümörün ilerlemesinin takibini sağlar.

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Yumurtalık kanseri büyümesinin ve nüksünün tespitine, ölçülmesine ve izlenmesine olanak tanıyan non-invaziv bir hayvan görüntüleme platformunu tanımlıyoruz. Bu intraperitoneal ksenogreft modeli, yumurtalık kanserli hastaların klinik profilini taklit eder.

Non-invaziv Görüntüleme için fare modeli Algılama ve Monitör Yumurtalık Kanseri nüks için

Bu el yazması ile yüksek çözünürlüklü spektral etki alanı optik Koherens tomografi (SD-Ekim) fare retinanın vivo içinde görüntüleme için bir protokol açıklar. Retina ganglion hücrelerinin (RGC) peripapillary bölgede çeşitli tarama ve açıklanan yaklaşımlar miktarının üzerinde duruluyor.

Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Burada, boyuna vivo içinde görüntüleme kullanışlılığı lazer kaynaklı choroidal neovaskülarizasyon farelerde morfolojik değişiklikler takip içinde mevcut.

Vivo Multimodal görüntüleme ve fare lazer kaynaklı Choroidal neovaskülarizasyon Model analizi

Aşağıdaki prosedür, genetik olarak tasarlanan bir fare modelini kullanarak, murine dorsal deride melansitik tümör başlamasını uzamsal ve temporal kontrol etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol makroskopik ve mikroskopik kutanöz Melanom inisiyasyonu açıklanmaktadır.

Mutant melanosit kök hücrelerinden Murine Melanoma başlangıcı uzamsal ve temporal kontrol

Burada, farelerde retinopatinin tanısını ve kantitatif ölçümünü kolaylaştırmak için optik koherens tomografi kullanan bir in vivo görüntüleme tekniğini tanımladık.

Optik Koherens Tomografinin Retinopatinin Bir Fare Modeline Uygulanması

Mevcut protokol, in vivo görüntülerde gözlenen retinal ganglion hücre akson demeti morfolojisini doğrulamak amacıyla in vivo görünür ışık optik koherens tomografi fibergrafi (vis-OCTF) görüntülerini aynı fare retinasının ex vivo konfokal görüntüleriyle hizalama adımlarını özetlemektedir.

Görünür Işık Optik Koherens Tomografi Fibergramlarının Aynı Fare Retinasının Konfokal Görüntüleri ile Hizalanması

Biz farelerde yorgunluk benzeri bir davranış ikna etmek için hedeflenen çevre radyasyon kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Seçilen öldürücü olmayan ışınlama dozu gönüllü tekerlek çalışan aktivitesinde bir hafta süren azalmaya yol açar.

Periferik Radyasyonla Bağlı Yorgunluk A Fare Modeli

Öğrenin, optik koherens tomografi kullanarak fare koroidinde melanom implantasyonu ve değerlendirmesi için bu yöntemi. Canlı görüntüleme ile tümör büyümesini sürekli izleyerek homojen çalışma grupları oluşturun ve üvea melanomu tedavi araştırmalarına katkı sağlayın.

Murin Koroidinde Melanomun İmplantasyonu ve Optik Koherens Tomografi ile Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet