Name: Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin, travmatik beyin hasarı sonrası farelerde iki foton mikroskobu ile intravital görüntüleme yöntemini. Bu teknik, akut ve kronik fazlarda nöronal yanıtları zamana yayılı izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Massachusetts Üniversitesi Chan Tıp Fakültesi'nden Dr. Miguel Sena-Esteves'e AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP virüsünü hediye ettiği için ve Massachusetts Üniversitesi Chan Tıp Fakültesi'nden Debra Cameron'a farelerin kafatası taslağını çizdiği için teşekkür ederiz. Ayrıca Bosco, Schafer ve Henninger laboratuvarlarının mevcut ve geçmiş üyelerine önerileri ve destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Savunma Bakanlığı (W81XWH202071/PRARP) tarafından DAB, DS ve NH'ye finanse edildi.

<ol><li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research%3A+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences%2C+Engineering%2C+and+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li>
<li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Traumatic+Brain+Injury%3A+A+Roadmap+for+Accelerating+Progress%22">Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress</a>. , The National Academies Press. (2022).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60(2021).</li>
<li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li>
<li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li>
<li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+NINDS%2FNIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li>
<li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li>
<li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins%3A+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li>
<li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646(2013).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li>
<li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060(2021).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li>
<li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742(2014).</li>
<li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li>
<li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li>
<li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li>
<li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633(2021).</li>
<li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II%3A+Morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li>
<li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Through-Intact-Skull+%28TIS%29+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLight%22%5BJournal%5D)">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li>
<li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559(2014).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210(2020).</li>
<li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine%22%5BJournal%5D)">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601(2020).</li>
<li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain%3B+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Los+Angeles+Neurological+Society%22%5BJournal%5D)">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li>
<li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contrecoup-coup+phenomenon%3A+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocritical+Care%22%5BJournal%5D)">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmez.

Bu çalışmada, TBH'nin kortikal nöronlar üzerindeki etkilerini gözlemlemek için fare beyin korteksi (katman IV ve V) içindeki EGFP etiketli nöronların uzunlamasına görüntüleme analizi için AAV enjeksiyonu, TBI uygulaması ve kraniyal pencere implantasyonu olan bir başlık birleştirildi. Bu çalışma, burada seçilen TBI bölgesinin, hipokampusun üstünde, kraniyal pencerenin implantasyonu için nispeten düz ve geniş bir yüzey sağladığını belirtmektedir. Tersine, kafatası bu bölgenin önünde nispeten dardır ve bu nedenle kafa direğ...

Spor yaralanmaları, araç çarpışmaları ve askeri savaştan kaynaklanabilen travmatik beyin hasarı (TBI), dünya çapında bir sağlık sorunudur. TBH fizyolojik, bilişsel ve davranışsal eksikliklere ve yaşam boyu sakatlık veya mortaliteye yol açabilir 1,2. TBH şiddeti hafif, orta ve şiddetli olarak sınıflandırılabilir, büyük çoğunluğu hafif TBH'dir (%75-%90)3. TBH'nin, özellikle tekrarlayan TBH oluşumlarının, nöronal dejenerasyonu teşvik edebileceği ve Alzheimer hastalığı (AD), amyotrofik lateral skleroz (ALS), frontotemporal demans (FTD) ve kronik travmatik ensefalopati (CTE) dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklar için risk faktörleri olarak hizmet edebileceği giderek daha fazla kabul edilmektedir4,5,6. Bununla birlikte, TBH kaynaklı nörodejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır ve bu nedenle aktif bir çalışma alanını temsil etmektedir. Nöronların TBH'ye nasıl tepki verdiği ve TBH'den nasıl kurtulduğu hakkında fikir edinmek için, TBH'den sonra farelerde uzunlamasına intravital görüntüleme ile, özellikle nöronlar içinde, floresan etiketli proteinlerin izlenmesi için bir yöntem burada açıklanmaktadır.
Bu amaçla, bu çalışma, daha öncebildirilenlere benzer kapalı kafatası TBH'sinin uygulanması için cerrahi bir prosedürün nasıl birleştirileceğini göstermektedir 7,8 Goldey ve ark.9 tarafından tanımlandığı gibi, aşağı akış intravital görüntüleme için bir kraniyal pencerenin implantasyonu için cerrahi bir prosedür. Özellikle, TBI'yı indükleyen ağırlık düşüşünün etkisinin pencereye zarar vermesi ve fareye onarılamaz bir zarar vermesi muhtemel olduğundan, önce bir kraniyal pencere implante etmek ve ardından aynı bölgede bir TBI gerçekleştirmek mümkün değildir. Bu nedenle, bu protokol TBH'yi uygulamak ve daha sonra kraniyal pencereyi doğrudan etki bölgesine implante etmek için tasarlanmıştır. Hem TBI hem de kraniyal pencere implantasyonunu tek bir cerrahi seansta birleştirmenin bir avantajı, bir farenin ameliyata maruz kalma sayısındaki azalmadır. Ayrıca, pencereyi daha sonraki bir cerrahi seansta implante etmek yerine (yani, TBI sonrası günlerin zaman ölçeğinde başlayan ilk görüntüleme) TBI'ya anında yanıtı (yani, saatlerin zaman ölçeğinde) izlemesine izin verir. Kraniyal pencere ve intravital görüntüleme platformu, sabit dokuların immün boyanması gibi geleneksel yöntemlerle nöronal proteinlerin izlenmesine göre de avantajlar sunar. Örneğin, intravital görüntüleme için daha az fare gerekir, çünkü aynı fare, ayrı zaman noktaları için gereken ayrı fare kohortlarının aksine, birden fazla zaman noktasında incelenebilir. Ayrıca, aynı nöronlar zaman içinde izlenebilir ve aynı hücre içindeki belirli biyolojik veya patolojik olayların izlenmesine izin verilir.
Kavramın bir kanıtı olarak, sinapsin promotörü altında gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) nörona özgü ekspresyonu burada gösterilmiştir10. Bu yaklaşım, 1) oligodendrositler için miyelin bazik protein (MBP) promotörü ve astrositler için glial fibriler asidik protein (GFAP) promotörü gibi diğer hücre tipine özgü promotörleri kullanarak farklı beyin hücresi tiplerine genişletilebilir11, 2) genlerini EGFP geni ile kaynaştırarak ilgilenilen farklı hedef proteinler ve 3) farklı floroforlara kaynaşmış çoklu proteinleri birlikte eksprese etmek. Burada EGFP, intrakraniyal enjeksiyon yoluyla adeno-ilişkili virüs (AAV) iletimi yoluyla paketlenir ve eksprese edilir. Kapalı bir kafatası TBI, bir ağırlık düşürme cihazı kullanılarak uygulanır ve ardından bir kraniyal pencerenin implantasyonu yapılır. Nöronal EGFP'nin görselleştirilmesi, in vivo EGFP floresansını tespit etmek için iki foton mikroskobu kullanılarak kraniyal pencereden elde edilir. İki fotonlu lazer ile, minimum foto hasarı ile kortikal dokuya daha derine nüfuz etmek mümkündür, bu da tek bir fare içinde aynı kortikal bölgelerin günlerce veaylara kadar tekrarlanan uzunlamasına görüntülenmesine izin verir 12,13,14,15. Özetle, TBH cerrahisini intravital görüntüleme ile birleştiren bu yaklaşım, TBH'nin neden olduğu hastalık patolojisine katkıda bulunan moleküler olayların anlaşılmasını ilerletmeyi amaçlamaktadır16,17.

<table><tbody><tr><td>Ayarlanabilir Hassas Aplikatör Fırçaları</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td></td></tr><tr><td>BD insülin şırıngası</td><td>BD</td><td>NDC/HRI# 08290-3284-38</td><td>5/16" x 31G</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>NDC67618-151-17</td><td>%7,5 povidon iyot dahil</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>PAR İlaç</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Sefazolin</td><td>HIKMA İlaç</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Seramik Karıştırma Kabı</td><td>Parkell</td><td>SKU: S387</td><td>Diş çimentosu hazırlığı için</td></tr><tr><td>Pamuk Uçlu Aplikatörler</td><td>ZORO</td><td>catlog #: G9531702</td><td></td></tr><tr><td>Katalizör</td><td>Parkell</td><td>S371</td><td>tam adı: "C" Evrensel TBB Katalizörü</td></tr><tr><td>Diş çimentosu tozu</td><td>Parkell</td><td>S396</td><td>C & için Radyoopak L-Toz B Metabond</td></tr><tr><td>Diş matkabı</td><td>Foredom</td><td>H.MH-130</td><td></td></tr><tr><td>Dental matkap kontrolörü</td><td>Foredom</td><td>HP4-310</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-519-05</td><td></td></tr><tr><td>EF4 karbür bit</td><td>Mikroskopi</td><td>Lot # C150113</td><td>Kafa Çapı / Lgth / mm 1.0 / 4.2</td></tr><tr><td>Ethonal</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>04355223EA</td>% <td>75</td></tr> <tr><td>FG1 / 4 karbür bit</td><td></td><td>Mikroskopi Lot # C150413</td><td>Kafa Çapı / Lgth / mm 0.5 / 0.4</td></tr><tr><td>FG4 karbür bit</td><td>Mikroskopi</td><td>Lot # C150309</td><td>Kafa Çapı / Lgth / mm 1.4 / 1.1</td></tr><tr><td>Başlık</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Özel üretim</td></tr><tr><td>Isıtma cihazı</td><td>CWE</td><td>TC-1000 Fare</td><td>stereotaksik aletle donatılmıştır ve ameliyat sırasında kullanılabilir</td></tr><tr><td>Isıtma battaniyesi</td><td>CVS eczane</td><td>E12107</td><td>ekstra ısıtma cihazı ve ameliyattan sonra kullanılabilir</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-03</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran indüksiyon odası</td><td>Vetequip</td><td>89012-688</td><td>kısa indüksiyon odası</td></tr><tr><td>için İzofluran uçucu</td><td></td><td></td> makine Vetequip 911103 <td></td></tr><tr><td>İzofluran uçucu makine tutucusu</td><td>Vetequip</td><td>901801</td><td></td></tr><tr><td>Leica cerrahi mikroskop</td><td>Leica</td><td>LEICA 10450243</td><td></td></tr><tr><td>Kayganlaştırıcı oftalmik merhem</td><td>Picetal</td><td>NDC 46066-753-55</td><td></td></tr><tr><td>Marker kalem</td><td>Delasco</td><td>SMP-BK</td><td></td></tr><tr><td>Meloksikam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon pompası ve kontrolörü</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>micro4 ve UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Mikrolitre şırınga</td><td>Hamilton</td><td>Hamilton 80014</td><td>1701 RN, 10 & mu; Şırınga için L ölçer ve iğne için 32 ölçer, 2 inç, nokta stili 3</td></tr><tr><td>Sivrisinek forseps</td><td>CAROLINA</td><td>Ürün #:625314</td><td>Paslanmaz Çelik, Kavisli, 5 inç</td></tr><tr><td>Tüy dökücü ajan</td><td>McKesson Corporation</td><td>N/A</td><td>Nair Hair Aloe & Lanolin Epilasyon Losyonu</td></tr><tr><td>Mikroskobu 1</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Kraniyal pencere hazırlığı için Nikon mikroskobu</td></tr><tr><td>Mikroskop 2</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7 MP</td><td>iki fotonlu mikroskop</td></tr><tr><td>Çoklu foton lazer</td><td>Tutarlı</td><td>Bukalemun Ultra II, Model: MRU X1, VERDI İki</td><td>foton mikroskobu için</td>18W lazer</tr><tr><td>Emilmeyen cerrahi sütür</td><td>Harvard Aparatı</td><td>catlog # 59-6860</td><td>6-0, yuvarlak iğne ile</td></tr><tr><td>Norland Optik Yapıştırıcı 81</td><td>Norland Ürünleri</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>Engelsiz İğne Tutucu</td><td>CAROLINA</td><td>Ürün #: 567912</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı baz sıvı</td><td>Parkell</td><td>S398</td> <td>"B" C & için Hızlı Taban B Metabond</td></tr><tr><td>Normal makas 1</td><td>Eurostat</td><td>eurostat es5-300</td><td></td></tr><tr><td>Normal makas 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>No. 501759-G</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak kapak camı 1</td><td>Warner aletleri</td><td>CS-5R Cat# 64-0700</td><td>5 mm çap için</td></tr><tr><td>Yuvarlak kapak camı 2</td><td>Warner aletleri</td><td>CS-3R Cat# 64-0720</td><td>3 mm çap için</td></tr><tr><td>Kauçuk halkalar</td><td>Orings-Online</td><td>Ürün # OO-014-70-50</td><td>O-Halkalar</td></tr><tr><td>Tuzlu</td><td>Bioworld</td><td>L19102411PR</td><td></td></tr><tr><td>Yaylı makas 1</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>No. 91500-09</td><td>uç düz</td></tr><tr><td>Yaylı makas 2</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>No. 91501-09</td><td>uç kavisli</td></tr><tr><td>Stereotaksik platform</td><td>KOPF</td><td>Model 900LS</td><td></td></tr><tr><td>Süper yapıştırıcı</td><td>Henkel</td><td>Ürün #: 1647358</td><td></td></tr><tr><td>cerrahi Kaliper</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>No. 501200</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi forseps 1</td><td>ELEKTRON MİKROSKOPİSİ BİLİMLERİ</td><td>Katalog# 0508-5/45-PO</td><td>stil 5/45, kavisli</td></tr><tr><td>Cerrahi forseps 2</td><td>ELEKTRON MİKROSKOPİSİ BİLİMLERİ</td><td>catlog# 0103-5-PO</td><td>stil 5, düz</td></tr><tr><td>Cerrahi forseps 3</td><td>ELEKTRON MİKROSKOPİSİ BİLİMLERİ</td><td>catlog # 72912</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi forseps 4</td><td>ELEKTRON MİKROSKOPİSİ BİLİMLERİ</td><td>Catlog # 0508-5 / 45-PO</td><td>stil 5/45, kavisli</td></tr><tr><td>Cerrahi gazlı bez</td><td>ZORO</td><td>catlog #: G0593801</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi lamba</td><td>Leica Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>UV kutusu</td><td>Spektrolinker</td><td>XL-1000</td><td>ayrıca UV çapraz bağlayıcı</td></tr><tr><td>Vaporguard Vetequip</td><td></td> olarak da adlandırılır <td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Doku Yapıştırıcısı</td><td>3M Hayvan Bakımı</td><td>Parça Numarası:014006</td><td></td></tr></tbody></table>

kapalı kafatası travmatik beyin hasarı ve kraniyal penceresi olan farelerde floresan protein ekspresyonunun İki foton mikroskobu kullanılarak İntravital görüntülenmesi

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Bu protokolün amacı, eksojen uyaranlara maruz kaldıktan sonra, bir hayvanın beyninin belirli hücre tipleri içinde ilgilenilen bir proteinin ekspresyonunun ve lokalizasyonunun uzunlamasına nasıl görselleştirileceğini göstermektir. Burada, kapalı kafatası travmatik beyin hasarının (TBI) uygulanması ve farelerde müteakip uzunlamasına intravital görüntüleme için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonu gösterilmektedir. Farelere intrakraniyal olarak, nöronal spesifik bir promotör altında gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) eksprese eden adeno-ilişkili bir virüs (AAV) enjekte edilir. 2 ila 4 hafta sonra, fareler, AAV enjeksiyon yeri üzerinde bir ağırlık düşürme cihazı kullanılarak tekrarlayan bir TBI'ya tabi tutulur. Aynı cerrahi seansta, farelere metal bir başlık ve daha sonra TBI etki bölgesi üzerine bir cam kraniyal pencere implante edilir. EGFP'nin ekspresyonu ve hücresel lokalizasyonu, aylar boyunca travmaya maruz kalan aynı beyin bölgesinde iki fotonlu bir mikroskop kullanılarak incelenir.

Bu protokol için kavram kanıtı olarak, AAV-Syn1-EGFP eksprese eden viral partiküller, 3 aylıkken erkek TDP-43 Q331K /Q331K farelerinin (C57BL / 6J arka planı) 19 beyin korteksine enjekte edildi. Yabani tip C57BL/6J hayvanların da kullanılabileceği belirtilmektedir, ancak bu çalışma TDP-43Q331K/Q331K farelerinde gerçekleştirilmiştir çünkü laboratuvar nörodejeneratif hastalık araştırmalarına odaklanmıştır. AAV enjeksiyonundan 4 hafta sonra TBI ameliyatı yapıldı. Aynı cerrahi or...

Bu çalışma, farelere tekrarlayan bir travmatik beyin hasarının verilmesini ve iki foton mikroskobu kullanılarak nöron eksprese edilen bir EGFP'nin daha sonraki intravital görüntülemesi için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonunu göstermektedir.

Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Protokolümüz, travmatik beyin hasarının beyni nasıl etkilediğine dair doğrudan kanıt sağlayabilen, canlı bir farede mekanik strese verilen nöronal tepkiyi görselleştirmenin bir yolunu sunar. Bu teknik, travmatik beyin hasarından sonra hem akut hem de kronik fazlar için aynı hayvanda aynı beyin bölgesinde hedef proteini izleyebilir. İlgilenilen gen ve virüs promotörü, beyindeki spesifik hücre tiplerindeki diğer proteinleri incelemek için buna göre değiştirilebilir.Başlamak için, anestezi uygulanmış farenin gözlerine oftalmik merhem sürün. Normal makasla keserek saçı başın üstünden çıkarın. 12 ila 15 milimetre uzunluğunda bir orta hat kesisi oluşturduktan sonra, kavisli uçlu yaylı makas kullanarak kafatasının sol ve sağ yarım küreleri üzerindeki cildi çıkarın.Kafatası açığa çıktığında, steril pamuk uçlu aplikatör ile hafifçe ovalayarak ve steril salinle yıkayarak periosteuumu çıkarın. Kafatası bölgesi kuruduktan sonra, Travmatik Beyin Hasarı veya TBI, darbe bölgesini bregmanın 2.5 milimetre posterior ve sagital sütürden sağa iki milimetre lateral koordinatlarda işaretleyin. Fareyi stereotaksik çerçeveden hızla çıkarın ve kafayı TBI cihazının altındaki tampon yastığına yerleştirin.Çarpma tertibatı ucunu işaretli çarpma alanıyla hizalayın. Bağlı naylon ipi fare kafasının 15 santimetre yukarısına çekerek metal sütunu kaldırın ve ardından serbest bırakın, ağırlığın TBI bölgesindeki kafatası tepesi ile temas halinde olan dönüştürücü çubuğun üzerine serbestçe düşmesine izin verin. Anestezi uygulanmış farenin kafasını cerrahi mikroskop altında tutulan stereotaksik çerçeveye yerleştirin.Kalan periosteuumu çıkarmak için düşük rotor hızında bir FG4 karbür uç kullanarak kafatasının yüzeyini nazikçe ve yavaşça delin ve diş çimentosu kafatasına güvenli bir şekilde bağlanacak şekilde pürüzlü bir kafatası yüzeyi oluşturun. Kafatası yüzeyindeki kemik tozunu temizlemek ve temizlemek için salin kullanın. Lateral kasları kafatasından ayırmak için, parietal ve temporal kafatasını birbirine bağlayan sütürün bulunduğu gözün yaklaşık beş milimetre arkasında, ince kapalı uçları nazikçe yerleştirin ve kapalı uçları lambdoid dikişe kadar yavaşça arka yönde hareket ettirin.Kraniyal pencere implantasyonunun gerçekleşeceği taraftaki yan kasları ayırın. Tuzlu su kullanarak ameliyat bölgesindeki kalıntıları yıkayın ve alanı gazlı bezle kurulayın. Baş direğini implante etmek için, bir işaretleyici kalem ve cerrahi bir kumpas kullanarak sağ hemisferde bregmanın 2,5 milimetre arkasında ve sagital sütürden 1,5 milimetre uzakta merkez noktasını işaretleyin.Sonra temiz ve kuru kafatası üzerinde kraniotominin çevresini izleyin. Kulak çubuğunu gevşetin ve kafayı döndürün, böylece kraniyotomi düzlemi tamamen yatay olur ve ardından kulak çubuğunu tekrar sıkın. Baş direğinin ön ve arka kenarına iki küçük damla süper yapıştırıcı eklemek için pamuk uçlu bir aplikatörün ahşap çubuğunu kullanın.Titanyum kafa direğini kraniotominin merkezine yerleştirin ve kraniyal pencerenin implante edileceği aynı düzlemde duracak şekilde hızlı bir şekilde ayarlayın. Süper yapıştırıcı kuruyana kadar hafif basınç uygulayın, bu genellikle yaklaşık 30 saniye sürer. 300 miligram çimento tozu, altı damla QuickBase sıvısı ve bir damla katalizörü iyice karıştırarak önceden soğutulmuş bir seramik kapta diş çimentosu hazırlayın.İzlenen çevrenin dış çevresine bol miktarda diş çimentosu karışımını hızlı bir şekilde uygulayın ve açıkta kalan kemik yüzeyini örtün. Bununla birlikte, kraniotomi bölgesini kapsamayın. İşaretli kraniyotomi çevresi boyunca hassas delme için başlığın sabit olduğundan emin olmak için kulak çubuğunu serbest bırakın ve kafa direğini metal çerçeveye sabitleyin.Kraniyotomiyi gerçekleştirmek için, daha önce gösterildiği gibi işaretli dairenin çapını doğrulamak için cerrahi bir kumpas kullanın ve kraniyal pencerenin kraniotominin içine sıkıca oturması için gerektiği gibi ayarlayın. Elektrikli bir diş matkabı kullanarak, önce kafatasını inceltmek için bir iz oluşturan bir FG4 karbür ucu kullanarak kafatasını işaretli dairenin dışı boyunca aşındırın ve inceltin. Kemik tozunu temizlemek için alanı tuzlu suyla sulayın.Kafatası kağıt inceliğinde ve şeffaf olana kadar bir FG 1/4 karbür uç kullanarak kafatasını inceltmeye devam edin. Periyodik olarak, delmeyi durdurun ve matkaptan kaynaklanan ısınmayı azaltmak ve kemik tozunu yıkamak için tüm alanı tekrar steril tuzlu su ile sulayın. Bir EF4 karbür uç kullanarak kafatası inceltme işlemini tamamlayın ve iz boyunca kafatasının geri kalanını inceltmeye ve delmeye devam edin.Çatlak yerden 0,5 milimetre ince uçlu bir forseps sokun ve alttaki beyni girintilemeden kemik flebini hafifçe yukarı doğru kaldırın. Kemik flebini çıkardıktan sonra, kraniyotomi bölgesini tuzlu su ile yıkayın. Kavisli uçlu cerrahi forsepsleri kullanarak, görünür araknoid maddeyi nazikçe çıkarın.Üç milimetre cam kapak kayması aşağı bakacak şekilde steril cam pencereyi almak için düz uçlu cerrahi forseps kullanın. Pencerenin kraniyotomi kenarına tam olarak oturduğundan emin olmak için cam pencereyi kraniyotomi bölgesinin üzerine yerleştirin ve ayarlayın. Beş milimetrelik cam kapak kayma üstte.Diş çimentosunu daha önce gösterildiği gibi hazırlayın ve çimento macun kıvamına gelene ve kalınlaşana kadar yaklaşık altı dakika bekleyin. Çimentonun macun kıvamına gelmesini ve kalınlaşmasını beklerken, kafatasının cam pencereye güvenli ve sıkı bir şekilde temas edip etmediğini kontrol etmek için stereotaksik bir manipülatör aracılığıyla pencereye yeterli miktarda basınç uygulayın. Cam pencereyi kafatası ile kapatmak için pencere kenarının yanına az miktarda çimento eklemek için ayarlanabilir bir hassas aplikatör fırçası kullanın.Çimentonun tamamen kuruması için yaklaşık 10 dakika bekleyin, ardından yavaşça serbest bırakın ve manipülatörü pencerenin üzerinde çıkarın. Fazla çimento pencereyi kaplıyorsa, bir FG4 karbür uçlu diş matkabını kullanarak diş çimentosunu keserek tamamlayın. Ameliyattan yaklaşık dört saat sonra, yüzeysel düzeyde damar sisteminin siyah göründüğü ve yaklaşık 400 mikrometre derin seviyede, EGFP protein ekspresyonunun hücre gövdesi boyunca yaygın olarak dağıldığı iki foton görüntüleme gerçekleştirildi.TBH'den bir hafta ve dört ay sonra, sıfır zaman noktasında gözlemlenen vaskülatür paterni, aynı görüntüleme bölgesini bulmak için referans olarak kullanıldı. Damar sistemi paterni sıfırıncı gündekine benzer. Benzer şekilde, EGFP ekspresyonu hücre gövdesi boyunca tespit edildi.Sıfırıncı ve dört aydaki floresan yoğunluğu hem yüzeysel hem de daha derin seviyelerde benzerdi. Bununla birlikte, bir haftadaki floresan yoğunluğu, muhtemelen diğer TBI modelleri için bildirilen translasyonel baskıdan dolayı, sıfır ve dört aydan daha düşüktü. Beyin dokusuna zarar vermemek için kraniyotomi adımını çalıştırırken azami özen göstermek çok önemlidir.Matkap ucunu beyne sokmayın. Araştırmacılar bu tekniği kullanarak, TBI sonrası farklı fazlarda aynı hücrede ilgilenilen farklı proteinleri uzunlamasına görselleştirebilir ve bu proteinin travma sonrası memeli beynindeki lokalizasyonu, ekspresyonu ve çözünürlüğü hakkında bilgi sağlayabilir.

intravital-imaging-fluorescent-protein-expression-mice-with-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, farelerde Travmatik Beyin Hasarı (TBI) oluşumunu göstermektedir. Kafatası açığa çıkarıldıktan sonra, TBI bölgesi işaretlenir. Fare daha sonra TBI cihazının altına yerleştirilir. Darbe, metal çubuğun kaldırılması ve kafatası ile temas halinde olan çarpma tertibatının üzerine serbestçe düşmesine izin verilmesiyle sağlanır.

Travmatik Beyin Hasarının Bir Fare Beynine Verilmesi

Kaynak: Bisht, K.,  et al. Farelerde nöro-immün dinamiklerin tekrarlayan in vivo görüntülemesini gerçekleştirmek için hassas beyin haritalaması. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, kafatası implantı olan transgenik bir farede nöro-immün dinamiklerin floresan görüntülemesini göstermektedir. Vasküler ve nöronal stabilite, nöronal aktiviteye karşı immün yanıtları yansıtan dinamik mikroglial değişikliklerle birlikte görüntülenir.

Kafatası İmplantı Kullanılarak Nöro-İmmün Dinamiklerin Floresan Görüntülemesi

Source: Nishimura, C.  ve ark. HIV Kaynaklı Nöroinflamasyonun Fare Modelinde İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Serebral Vasküler Mimarinin Ölçülmesi. J. Vis. Exp. (2016). Bu video, iki foton mikroskobu kullanılarak fare beynindeki kortikal kılcal damarların in vivo görselleştirmesini göstermektedir. İnce kafatası kortikal pencereli anestezi uygulanmış bir fareye floresan boya enjekte etme, görüntüleme için kurulumu hazırlama ve analiz için beyin mikrovasküler yapılarının ayrıntılı görüntülerini...

 Fare Beyni Mikrovaskülatürünün İn Vivo Görüntülenmesi için İki Foton Mikroskobu 

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Akut beyin travması bugüne kadar yeterli bir tedavisi olmayan ciddi bir yaralanma olduğunu. Multiphoton mikroskopi uzunlamasına akut beyin travması gelişim sürecini inceleyerek ve kemirgenlerde terapötik stratejiler sondalama sağlar. Beynin in vivo iki foton görüntüleme ile incelenmiştir akut beyin travması iki model bu protokolde gösterilmiştir.

Boyuna İki foton görüntüleme ile takip Farelerde Akut Beyin Travma

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Transkraniyal optik görüntüleme, canlı fareler korteks içinde sağlam bir kafatası ile beyin omurilik sıvı taşımacılığı geniş alan görüntüleme sağlar.

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Bu protokol, nöro-glio-vasküler yapıların uzunlamasına görüntülemesi, hem sağlıklı hem de hastalıklı koşullarda fonksiyon ve fonksiyon için kullanılabilecek kronik bir kafatası pencere implantasyon tekniğini açıklamaktadır. Genellikle tercih edilirken bazı kritik sınırlamalara sahip olan transkraniyal görüntüleme yaklaşımına tamamlayıcı bir alternatif olarak hizmet vermektedir.

Farelerde Nöro-İmmün Dinamiğin Vivo Görüntülemesinde Tekrarlayan Performans için Hassas Beyin Haritalaması

Burada, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesi için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir protokol sunulmaktadır.

Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu

Öğrenin, travmatik beyin hasarı sonrası farelerde iki foton mikroskobu ile intravital görüntüleme yöntemini. Bu teknik, akut ve kronik fazlarda nöronal yanıtları zamana yayılı izlemeyi sağlar.

Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal

Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet