Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi

Bu çalışma, farelere tekrarlayan bir travmatik beyin hasarının verilmesini ve iki foton mikroskobu kullanılarak nöron eksprese edilen bir EGFP'nin daha sonraki intravital görüntülemesi için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonunu göstermektedir.

Protokolümüz, travmatik beyin hasarının beyni nasıl etkilediğine dair doğrudan kanıt sağlayabilen, canlı bir farede mekanik strese verilen nöronal tepkiyi görselleştirmenin bir yolunu sunar. Bu teknik, travmatik beyin hasarından sonra hem akut hem de kronik fazlar için aynı hayvanda aynı beyin bölgesinde hedef proteini izleyebilir. İlgilenilen gen ve virüs promotörü, beyindeki spesifik hücre tiplerindeki diğer proteinleri incelemek için buna göre değiştirilebilir.

Başlamak için, anestezi uygulanmış farenin gözlerine oftalmik merhem sürün. Normal makasla keserek saçı başın üstünden çıkarın. 12 ila 15 milimetre uzunluğunda bir orta hat kesisi oluşturduktan sonra, kavisli uçlu yaylı makas kullanarak kafatasının sol ve sağ yarım küreleri üzerindeki cildi çıkarın.

Kafatası açığa çıktığında, steril pamuk uçlu aplikatör ile hafifçe ovalayarak ve steril salinle yıkayarak periosteuumu çıkarın. Kafatası bölgesi kuruduktan sonra, Travmatik Beyin Hasarı veya TBI, darbe bölgesini bregmanın 2.5 milimetre posterior ve sagital sütürden sağa iki milimetre lateral koordinatlarda işaretleyin. Fareyi stereotaksik çerçeveden hızla çıkarın ve kafayı TBI cihazının altındaki tampon yastığına yerleştirin.

Çarpma tertibatı ucunu işaretli çarpma alanıyla hizalayın. Bağlı naylon ipi fare kafasının 15 santimetre yukarısına çekerek metal sütunu kaldırın ve ardından serbest bırakın, ağırlığın TBI bölgesindeki kafatası tepesi ile temas halinde olan dönüştürücü çubuğun üzerine serbestçe düşmesine izin verin. Anestezi uygulanmış farenin kafasını cerrahi mikroskop altında tutulan stereotaksik çerçeveye yerleştirin.

Kalan periosteuumu çıkarmak için düşük rotor hızında bir FG4 karbür uç kullanarak kafatasının yüzeyini nazikçe ve yavaşça delin ve diş çimentosu kafatasına güvenli bir şekilde bağlanacak şekilde pürüzlü bir kafatası yüzeyi oluşturun. Kafatası yüzeyindeki kemik tozunu temizlemek ve temizlemek için salin kullanın. Lateral kasları kafatasından ayırmak için, parietal ve temporal kafatasını birbirine bağlayan sütürün bulunduğu gözün yaklaşık beş milimetre arkasında, ince kapalı uçları nazikçe yerleştirin ve kapalı uçları lambdoid dikişe kadar yavaşça arka yönde hareket ettirin.

Kraniyal pencere implantasyonunun gerçekleşeceği taraftaki yan kasları ayırın. Tuzlu su kullanarak ameliyat bölgesindeki kalıntıları yıkayın ve alanı gazlı bezle kurulayın. Baş direğini implante etmek için, bir işaretleyici kalem ve cerrahi bir kumpas kullanarak sağ hemisferde bregmanın 2,5 milimetre arkasında ve sagital sütürden 1,5 milimetre uzakta merkez noktasını işaretleyin.

Sonra temiz ve kuru kafatası üzerinde kraniotominin çevresini izleyin. Kulak çubuğunu gevşetin ve kafayı döndürün, böylece kraniyotomi düzlemi tamamen yatay olur ve ardından kulak çubuğunu tekrar sıkın. Baş direğinin ön ve arka kenarına iki küçük damla süper yapıştırıcı eklemek için pamuk uçlu bir aplikatörün ahşap çubuğunu kullanın.

Titanyum kafa direğini kraniotominin merkezine yerleştirin ve kraniyal pencerenin implante edileceği aynı düzlemde duracak şekilde hızlı bir şekilde ayarlayın. Süper yapıştırıcı kuruyana kadar hafif basınç uygulayın, bu genellikle yaklaşık 30 saniye sürer. 300 miligram çimento tozu, altı damla QuickBase sıvısı ve bir damla katalizörü iyice karıştırarak önceden soğutulmuş bir seramik kapta diş çimentosu hazırlayın.

İzlenen çevrenin dış çevresine bol miktarda diş çimentosu karışımını hızlı bir şekilde uygulayın ve açıkta kalan kemik yüzeyini örtün. Bununla birlikte, kraniotomi bölgesini kapsamayın. İşaretli kraniyotomi çevresi boyunca hassas delme için başlığın sabit olduğundan emin olmak için kulak çubuğunu serbest bırakın ve kafa direğini metal çerçeveye sabitleyin.

Kraniyotomiyi gerçekleştirmek için, daha önce gösterildiği gibi işaretli dairenin çapını doğrulamak için cerrahi bir kumpas kullanın ve kraniyal pencerenin kraniotominin içine sıkıca oturması için gerektiği gibi ayarlayın. Elektrikli bir diş matkabı kullanarak, önce kafatasını inceltmek için bir iz oluşturan bir FG4 karbür ucu kullanarak kafatasını işaretli dairenin dışı boyunca aşındırın ve inceltin. Kemik tozunu temizlemek için alanı tuzlu suyla sulayın.

Kafatası kağıt inceliğinde ve şeffaf olana kadar bir FG 1/4 karbür uç kullanarak kafatasını inceltmeye devam edin. Periyodik olarak, delmeyi durdurun ve matkaptan kaynaklanan ısınmayı azaltmak ve kemik tozunu yıkamak için tüm alanı tekrar steril tuzlu su ile sulayın. Bir EF4 karbür uç kullanarak kafatası inceltme işlemini tamamlayın ve iz boyunca kafatasının geri kalanını inceltmeye ve delmeye devam edin.

Çatlak yerden 0,5 milimetre ince uçlu bir forseps sokun ve alttaki beyni girintilemeden kemik flebini hafifçe yukarı doğru kaldırın. Kemik flebini çıkardıktan sonra, kraniyotomi bölgesini tuzlu su ile yıkayın. Kavisli uçlu cerrahi forsepsleri kullanarak, görünür araknoid maddeyi nazikçe çıkarın.

Üç milimetre cam kapak kayması aşağı bakacak şekilde steril cam pencereyi almak için düz uçlu cerrahi forseps kullanın. Pencerenin kraniyotomi kenarına tam olarak oturduğundan emin olmak için cam pencereyi kraniyotomi bölgesinin üzerine yerleştirin ve ayarlayın. Beş milimetrelik cam kapak kayma üstte.

Diş çimentosunu daha önce gösterildiği gibi hazırlayın ve çimento macun kıvamına gelene ve kalınlaşana kadar yaklaşık altı dakika bekleyin. Çimentonun macun kıvamına gelmesini ve kalınlaşmasını beklerken, kafatasının cam pencereye güvenli ve sıkı bir şekilde temas edip etmediğini kontrol etmek için stereotaksik bir manipülatör aracılığıyla pencereye yeterli miktarda basınç uygulayın. Cam pencereyi kafatası ile kapatmak için pencere kenarının yanına az miktarda çimento eklemek için ayarlanabilir bir hassas aplikatör fırçası kullanın.

Çimentonun tamamen kuruması için yaklaşık 10 dakika bekleyin, ardından yavaşça serbest bırakın ve manipülatörü pencerenin üzerinde çıkarın. Fazla çimento pencereyi kaplıyorsa, bir FG4 karbür uçlu diş matkabını kullanarak diş çimentosunu keserek tamamlayın. Ameliyattan yaklaşık dört saat sonra, yüzeysel düzeyde damar sisteminin siyah göründüğü ve yaklaşık 400 mikrometre derin seviyede, EGFP protein ekspresyonunun hücre gövdesi boyunca yaygın olarak dağıldığı iki foton görüntüleme gerçekleştirildi.

TBH'den bir hafta ve dört ay sonra, sıfır zaman noktasında gözlemlenen vaskülatür paterni, aynı görüntüleme bölgesini bulmak için referans olarak kullanıldı. Damar sistemi paterni sıfırıncı gündekine benzer. Benzer şekilde, EGFP ekspresyonu hücre gövdesi boyunca tespit edildi.

Sıfırıncı ve dört aydaki floresan yoğunluğu hem yüzeysel hem de daha derin seviyelerde benzerdi. Bununla birlikte, bir haftadaki floresan yoğunluğu, muhtemelen diğer TBI modelleri için bildirilen translasyonel baskıdan dolayı, sıfır ve dört aydan daha düşüktü. Beyin dokusuna zarar vermemek için kraniyotomi adımını çalıştırırken azami özen göstermek çok önemlidir.

Matkap ucunu beyne sokmayın. Araştırmacılar bu tekniği kullanarak, TBI sonrası farklı fazlarda aynı hücrede ilgilenilen farklı proteinleri uzunlamasına görselleştirebilir ve bu proteinin travma sonrası memeli beynindeki lokalizasyonu, ekspresyonu ve çözünürlüğü hakkında bilgi sağlayabilir.