Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Bu yöntem, bir durumun bağırsak bariyeri bütünlüğünü değiştirip değiştirmediği veya potansiyel bir tedavinin bağırsak bariyeri bütünlüğünü koruyup koruyamayacağı hakkındaki soruları cevaplamaya yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, in vivo olarak bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek ve ölçmek için invaziv olmayan, düşük yüklü bir teknik sunmasıdır. Başlamak için, fareleri dört saat boyunca hızlandırın, ardından 38 milimetre 22 gauge sterilize edilmiş kavisli gavage iğnesi kullanarak her fareye oral gavaj yoluyla 200 mikrolitre FITC-dextran süspansiyonu uygulayın.

İlk gavajdan sonra bir zamanlayıcı başlatın ve in vivo ölçümlere izin vermek için her bir gavage arasında beş ila 10 dakika bekleyin, bir saat sonra gavage koruyun. Standart eğri için kalan FITC-dextran süspansiyonunu saklayın. Başlat düğmesini tıklayıp basılı tutarak makineyi ve yazılımı başlatın ve sistemin ısınmasına izin verin.

Cihaz durumu'na tıklayın ve devam etmeden önce yapılandırılan tüm cihazların Tamam gösterdiğinden emin olun. Ardından Yeni etüde tıklayın ve dosyayı istediğiniz adla kaydedin. Ardından, Çalışma seçenekleri'ne tıklayın.

Örnek kimliğini girin ve doğru lazeri seçin ve deneyin. Daha sonra elektrikli tıraş makinesi kullanarak kürkü karın bölgesinden çıkarın ve kurumasını önlemek için veteriner merhemini gözlere cömertçe uygulayın. Görüntüleme odasını açın ve hayvanı dorsal olarak tarama plakasına yerleştirin.

Sonra uzuvları ve kuyruğu bantla sabitleyin. Ardından, Çizim aracını kullanarak taranacak alanı seçin. Karnın tüm genişliğini karaciğerin hemen üstünden rektuma dahil ettiğinizden emin olun.

Ardından, çizildikten sonra alanı ayarlamak için Değiştir aracına tıklayın. Tarama çözünürlüğünü 2,0 milimetreye ayarlayın ve taramayı başlatmak için Başlat'a tıklayın. Ardından, görüntü dosyalarını seçilen dosya adı altında bularak açın ve aynı anda tüm dosyaları senkronize edilmiş ayarlarla açın.

Görüntü ayarları araç çubuğunu kullanarak, doğru bir karşılaştırma için görüntü ayarlarını eşitlemek üzere Görüntüyü eşitle ve Ölçeği eşitle düğmelerini kullanın. Ardından görüntüleri ayarlanan ölçeklerle kaydedin. Her hayvanın abdominal floresansını ve kontrol faresini, görüntüleme sistemiyle ilişkili yazılımı kullanarak eşit ölçeklendirilmiş görüntülerde karşılaştırın.

Gavage sonrası dört saat steril bir tüpte her fareden bir dışkı peleti toplayın. Sonra tüpleri buz üzerinde tutun ve karanlıkta yerleştirin. Daha sonra, kan örneklerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 9.390 x g'de santrifüj yapın.

Ardından plazmayı yeni bir steril tüpe aktarın ve karanlıkta buz üzerinde tutun. 200 mikrolitre PBS'de 50 miligram dışkı örneğini seyreltin ve plazmayı PBS ile bir ila iki oranında seyreltin. Plaka 100 mikrolitrelik numuneler ve standartlarda opak siyah 96 delikli bir plaka içinde.

Floresanı bir floresan plaka okuyucusunda 485 nanometrede uyarma ve 530 nanometrede absorpsiyon ile okuyun. Son olarak, floresanı standart eğrinin bilinen konsantrasyonlarıyla karşılaştırarak numune başına FITC-dextran konsantrasyonunu belirleyin. İn vivo floresan analizi, sadece kontrol diyetini alan farelerin, inülin takviyeli diyet alan farelere kıyasla karın boşluğunda daha yüksek hepatik FITC-dextran alımına ve daha yüksek seviyelerde artık floresan seviyesine sahip olduğunu göstermiştir.

İnülin takviyeli diyet alan fareler, plazmalarında sadece kontrol diyetini alan farelere kıyasla önemli ölçüde daha düşük FITC-dekstran seviyelerine sahipti. Buna uygun olarak, inülin diyetini alan fareler, dışkılarında sadece kontrol diyetini alan farelerden önemli ölçüde daha yüksek FITC-dekstran seviyelerine sahipti. Kontrollü farelerin dışkısındaki daha düşük FITC-dekstran seviyeleri, uygun şekilde atılmak yerine bağırsak bariyerinden dolaşıma nüfuz ettiğini gösterir.

Plazmadaki yüksek FITC-dekstran seviyeleri bu bulguyu güçlendirdi. Bu prosedürü denerken zamanlama çok önemlidir. Floresan okuma ve numune toplama, her bir fare için gavage sonrası bir saat dört saate kadar mümkün olduğunca yakın bir şekilde gerçekleşmelidir.