Name: Aldehit Dehidrogenaz 1A1 aktivitesine dayalı yumurtalık kanseri hücrelerini tabakalaştırmak için AlDeSensein uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Keşfedin ALDH1A1 aktivitesini ölçme yöntemini, kanser kök hücre biyobelirteci için akış sitometrisi ve canlı hücre görüntüleme kullanarak. Bu protokol yumurtalık kanser hücrelerinde yüksek duyarlılıkla seçici izoform tespiti sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (JC'ye R35GM133581) ve Illinois Lisansüstü Bursu'ndaki Kanser Merkezi (SG'ye verildi) tarafından desteklenmiştir. JC, Camille ve Henry Dreyfus Vakfı'na destekleri için teşekkür eder. Yazarlar, Dr. Thomas E. Bearood'a AlDeSense ve AlDeSense'nin stoklarının hazırlanmasına yaptığı ilk katkı için teşekkür eder. Oliver D. Pichardo Peguero ve Joseph A. Forzano'ya çeşitli sentetik öncüllerin hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Caov-3, IGROV-1 ve PEO4 hücreleri için Prof. Dr. Erik Nelson'a (Moleküler ve Bütünleştirici Fizyoloji Anabilim Dalı, UIUC) teşekkür ederiz. BG-1 hücreleri için Prof. Paul Hergenrother'e (UIUC Kimya Bölümü) teşekkür ederiz. Carl R. Woese Genomik Biyoloji Enstitüsü'ndeki Temel Tesislere, Zeiss LSM 700 Konfokal Mikroskop ve ilgili yazılıma erişim için teşekkür ederiz. BD LSR II CMtO Analizörüne erişim için Flow Sitometri Tesisi'ne teşekkür ederiz. Dr. Sandra McMasters'a ve Hücre Medyası Tesisi'ne hücre kültürü medyasının hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.

1. Florimetri ile yumurtalık kanseri hücre homojenatlarında toplam ALDH1A1 aktivitesini ölçün
<ol><li>Aşağıdaki hücre kültürü ortamının 5 mL'sinde bir T25 hücre kültürü şişesinde 1 × 106 hücreyi çözün:<ol><li>IGROV-1 ve PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 besiyeri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S).</li>
		<li>BG-1 ve Caov-3: Dulbecco'nun %10 FBS ve %1 P/S ile Modifiye Kartal Ortamı (DMEM).</li>
		<li>OVCAR-3:% 20 FBS,% 1 P / S ve 0.01 mg / mL insülin ile RPMI 1640.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri bir inkübatörde iki ila üç geçiş için 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun. Hücrelerin geçmeden önce% 80-90 akıcılığı geçmediğinden emin olun.</li>
	<li>Hücreleri 10 dakika boyunca% 0.25 tripsin içinde tripsin haline getirin, otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın ve 5 dakika boyunca 25 ° C'de santrifüjleme (180 × g) yoluyla pelet 1 ×10 7 hücre.</li>
	<li>Süpernatantı aspirasyon yoluyla dikkatlice çıkarın, peleti 1 mL 1x PBS'de hücreleri yeniden askıya alarak yıkayın ve adım 4'te tarif edildiği gibi aynı koşullar altında santrifüjleme yoluyla hücreleri yeniden pelet edin.</li>
	<li>Hücreleri 1x PBS'de 1x proteaz inhibitörü çözeltisinde yeniden askıya alın. 2.5 × 106 hücre başına bu çözeltinin 1 mL'sini kullanın.</li>
	<li>Bir hücre homojenizatör probu ile hücre süspansiyonunu 2 dakika (1 s darbe,% 40 genlik) boyunca buz üzerinde sonikleştirin.</li>
	<li>15 dakika boyunca 25 °C'de santrifüjleme yoluyla (3.200 × g) pelet çözünmez/membran fraksiyonları. Süpernatanı çıkarın ve saklayın, çünkü bu sonraki adımlarda kullanılacak homojenattır. Deneyi üçlü olarak gerçekleştirmek için homojenatları üç küvete ayırın.</li>
	<li>4 μM'lik nihai prob konsantrasyonunu elde etmek için probu homojenata ekleyin. çözeltiyi iyice karıştırmak için pipeti üç kez yukarı ve aşağı indirin.</li>
	<li>Floresan sinyalini ilaveden hemen sonra ve bir florimetre üzerinde istenen inkübasyon sürelerinden sonra ölçün. Kuluçka süresi, maksimum kıvrım açılımını görmek için optimize edilebilir (bu deneyde 1 saat). Kuluçka süresi, karşılaştırılan tüm hücre hatları boyunca sabit olmalıdır.<ol><li>Uyarma dalga boyunu 496 nm olarak ayarlayın.</li>
		<li>Emisyonu 510-600 nm olarak ayarlayın.</li>
		<li>Yarık genişliğini 0,5 mm'ye ayarlayın.</li>
		<li>Çözeltiyi 1 mL'lik bir kuvars küvete pipetleyin, florimetreye yerleştirin ve taramaya basın.</li>
	</ol></li>
	<li>İzoform seçici boyanın kıvrım aktivasyonunu belirlemek için 516 nm'deki (maksimum floresan dalga boyu) son floresan yoğunluğunu, ilk okumadan aynı dalga boyundaki yoğunluğa bölün.</li>
</ol>2. Yüksek ALDH1A1 aktivitesine sahip hücreleri görüntülemek için floresan mikroskobu kullanımı
<ol><li>1 × 106 hücreyi, uygun hücre kültürü ortamının 5 mL'sinde bir T25 hücre kültürü şişesinde çözün.</li>
	<li>Hücreleri bir inkübatörde iki ila üç geçiş için 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun. Hücrelerin geçmeden önce% 80-90 akıcılığı geçmediğinden emin olun.</li>
	<li>Konfokal görüntülemeden bir gün önce, 8 delikli bir odacıklı slaytta plaka 4 × 105 hücre.<ol><li>Her bir kuyucuğun tabanını 10 dakika boyunca poli-L-lizin (0.1 mg / mL, kuyucuk başına 100 μL) ile kaplayın, daha sonra aspire edin.</li>
		<li>Hücre kültürü sınıfı su (kuyucuk başına 100 μL) ekleyerek ve aspire ederek her bir kuyuyu 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Hücreleri 10 dakika boyunca% 0.25 tripsin içinde tripsin haline getirin, otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın ve hücreleri kuyucuk başına 4 × 105 hücrede plakalayın.</li>
		<li>Hücrelerin bir gecede yerleşmesine ve bağlanmasına izin verin (12-16 saat).</li>
	</ol></li>
	<li>Büyüme ortamını aspire edin ve 2 μM prob veya kontrol probu ile desteklenen serumsuz ortam (kuyucuk başına 500 μL) ekleyin.</li>
	<li>Prob ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin ve hücreleri hemen görüntüleyin.</li>
	<li>Konfokal mikroskobu açın ve numune için ayarlayın.<ol><li>Numuneyi en düşük büyütmede dikkatlice yükleyin; Doğru konumlandırmayı sağlamak için hücreleri bulun.</li>
		<li>Objektif lensin 10x büyütmede olduğundan emin olun ve hücreleri bulun.</li>
	</ol></li>
	<li>Bu deney için FITC kanalı (uyarma: 488 nm lazer; emisyon: 516-521 nm) ve T-PMT (iletilen ışık) kanalı gereklidir. Önyargıyı ortadan kaldırmak için deneyin tamamı boyunca aynı z-düzlemine odaklanmak için T-PMT kullanarak hücreleri bulun ve bunlara odaklanın.</li>
	<li>Lazer gücünü ve FITC kazancını, AlDeSense örneklerinde sinyal görmeye devam ederken Ctrl-AlDeSense örneklerinden gelen sinyalin minimum düzeyde algılanabildiği uygun ayara ayarlayın. Her parametre, ilgili çubuğu kaydırarak ayarlanabilir. Doğru parametreleri tanımlamak için ayarların birkaç kez ayarlanması gerekebilir. Optimize edildikten sonra, aynı parametreleri kullanarak denemenin geri kalanını bu hücre satırında tamamlayın.</li>
	<li>Tedavi koşulu başına toplam üç kuyucuk için kuyu başına üç görüntü çekin (toplamda dokuz görüntü). Floresan kanalını veya birleştirilmiş görüntüyü kullanmak yerine önyargıyı önlemek için T-PMT kullanarak uygun düzleme odaklanın.</li>
	<li>ALDH1A1+ hücrelerinin yüzdesini belirlemek için görüntüleri işleyin.<ol><li>Görüntü işleme yazılımını kullanarak, czi dosyasını farklı kanallara bölün.</li>
		<li>Toplam hücre sayısını ve toplam floresan hücre sayısını sayın.</li>
		<li>ALDH1A1+ hücrelerinin yüzdesini belirlemek için, floresan hücrelerin sayısını her görüntüdeki toplam hücre sayısına bölün. Görüntüleri manipüle etmeden her görüntü için aynı şekilde saymak zorunludur, çünkü örneğin, parlaklığı ayarlamak kafa karıştırıcı bir değişken ekleyebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Yüksek ALDH1A1 aktivitesine sahip hücreleri tanımlamak için akış sitometrisinin uygulanması
<ol><li>1 × 106 hücreyi, uygun hücre kültürü ortamının 5 mL'sinde bir T25 hücre kültürü şişesinde çözün.</li>
	<li>Hücreleri bir inkübatörde iki ila üç geçiş için 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun. Hücrelerin geçmeden önce% 80-90 akıcılığı geçmediğinden emin olun.</li>
	<li>15 mL'lik bir santrifüj tüpündeki hücreleri santrifüj yoluyla (180 × g) 25 ° C'de 5 dakika boyunca tripsiniz, sayın ve pelet edin.</li>
	<li>PBS'de 1 mL 2 μM prob / kontrol probu çözeltisi içindeki hücreleri yeniden askıya alın. Boyaya eşit maruz kalmasını sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sallayın.</li>
	<li>Kuluçka döneminden sonra, hücreleri santrifüjleme yoluyla (180 × g) 25 ° C'de 5 dakika boyunca pelet edin. Hücreleri 0.5 mL PBS'de yeniden askıya alın. Akış sitometresini tıkayabilecek hücre kümelerini çıkarmak için hücreleri bir hücre süzgecinden (35 μm naylon ağ) geçirin. Hücreleri hemen buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Cihazı açın ve başlatma protokolünü çalıştırın.</li>
	<li>Kılıf sıvısı ve boş atık olup olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>Hatları her biri 5 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu ve su ile çalıştırın.</li>
	<li>Düzgün çalışmasını sağlamak için kalite kontrol boncuklarını çalıştırın.</li>
	<li>Ayarlar sekmesinde, floresan filtresi için FSC (ileri saçılma), SSC (yan saçılma) ve FITC (floresein izotiyosiyanat) seçeneklerini belirleyin.</li>
	<li>Canlılık, tekli ve floresan için aşağıdaki grafikleri çizin. Lazer gücünü (kullanıcının cihazına özgü) optimize edin, böylece hücre popülasyonları daha fazla analiz için verilen parametreler dahilinde olur.<ol><li>FSC-A ve SSC-A dağılım grafiği: ana hücre popülasyonu grafiğin merkezine yakındır.</li>
		<li>FSC-A ve FSC-W dağılım grafiği: teklilerin göstergesi olan dar yatay bant (hücre kümeleri yerine).</li>
		<li>FITC-A ve FSC-A saçılma grafiği: izoform seçici florojenik açma probu tarafından sıralanan hücrelerin dağılımını gözlemleyin.</li>
		<li>FITC-A histogramı: ALDH1A1+ hücrelerinin yüzdesini belirlemek için FITC'ye dayalı popülasyondaki değişimi gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>FITC lazer gücünü optimize etmek için, histogram eğrisinin sağ kuyruğu maksimum FITC-A sinyaline yakın olacak şekilde probla bir numune çalıştırın. Daha sonra, kontrol probu ile bir numune çalıştırın. Maksimum dinamik aralığı ortaya çıkarmak için bir popülasyon kayması gözlemlenebilir olmalıdır. Lazer gücü optimizasyonu adımının birden çok kez tekrarlanması gerekebilir, ancak bir deney için bir ayar belirlendikten sonra lazer gücü numuneler arasında değiştirilmemelidir.</li>
	<li>Her örneği 10.000 sayım için çalıştırın (üçlü olarak yapılır).</li>
	<li>Her hücre satırı için adım 3.12'yi tekrarlayın, çünkü alım ve ALDH1A1 aktivitesinde değişkenlik olacaktır.</li>
	<li>Numune toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hatları her biri 5 dakika boyunca %10 ağartıcı ve su ile çalıştırın, ardından cihazın kapatılmasını başlatın.</li>
	<li>Akış sitometri yazılımını kullanarak verileri işleyin ve istenen hücre popülasyonunu açın. Kapıları, tüm olaylar ALDH1A1- veya ALDH1A1+ kapısına düşecek şekilde ayarlayın. Dikdörtgen kapı seçimini kullanarak, ALDH1A1- kapısını, kontrol probu örneklerindeki olayların %>99,5'i bu kapı içinde gerçekleşecek şekilde ayarlayın. Kalan hücreler ALDH1A1+ olarak kabul edilecektir. Bu aynı kapılar daha sonra ALDH1A1- ve ALDH1A1+ olarak kabul edilen olayların sayısını ölçmek için prob örneğine uygulanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukaemia+is+organised+as+a+heirarchy+that+originates+from+a+primitive+haematopoetic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+transporters+in+cancer+stem+cells%3A+Beyond+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).</li>
<li>Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+cancer+stem+cells+in+therapy+resistance%3A+Cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms.</a> Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).</li>
<li>Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+potential+of+cancer+stem+cells%3A+A+review+of+the+detection+of+cancer+stem+cells+and+their+roles+in+cancer+recurrence+and+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment.</a> Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).</li>
<li>Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+tumorigenesis%3A+Cancer+stem+cells+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis.</a> Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).</li>
<li>Kim, W. T., Ryu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+surface+markers+on+normal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell surface markers on normal stem cells.</a> BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).</li>
<li>Pors, K., Moreb, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer%3A+An+opportunity+for+biomarker+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development.</a> Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).</li>
<li>Jackson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+aldehyde+dehydrogenase+gene+%28ALDH%29+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily.</a> Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).</li>
<li>Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+aldehyde+dehydrogenases+in+endogenous+and+xenobiotic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism.</a> Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).</li>
<li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li>
<li>Anorma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+cancer+stem+cell+plasticity+using+an+isoform-selective+fluorescent+probe+for+aldehyde+dehydrogenase+1A1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1.</a> ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).</li>
<li>Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+red+fluorescent+sensor+for+ALDH1A1+displaying+enhanced+cellular+uptake+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity.</a> Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).</li>
<li>Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-based+small-molecule+fluorescent+probes+for+chemoselective+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging.</a> Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).</li>
<li>East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+of+activity-based+sensing+for+in+vivo+NIR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging.</a> Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).</li>
<li>Yadav, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+NIR+bioluminescence+probe+enables+discovery+of+diet-induced+modulation+of+the+tumor+microenvironment+via+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide.</a> ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).</li>
<li>Yadav, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activity-based+sensing+approach+for+the+detection+of+cyclooxygenase-2+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells.</a> Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).</li>
<li>Ueno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+principles+for+modulating+fluorescence+properties+of+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).</li>
<li>Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+use+of+fluorogenic+aldehydes+for+monitoring+the+progress+of+aldehyde+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).</li>
<li>Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+tumor+penetration%3A+transport+opposed+by+systemic+and+antigen-mediated+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).</li>
<li>Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+its+role+as+a+cancer+stem+cell+marker+comes+down+to+the+specific+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform.</a> Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).</li>
<li>Meng, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1A1+maintains+ovarian+cancer+stem+cell-like+properties+by+altered+regulation+of+cell+cycle+checkpoint+and+DNA+repair+network+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling.</a> PLoS One. 9 (9), e107142(2014).</li>
<li>Kaipio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1A1-related+stemness+in+high-grade+serous+ovarian+cancer+is+a+negative+prognostic+indicator+but+potentially+targetable+by+EGFR%2FmTOR-PI3K%2Faurora+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors.</a> The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).</li>
<li>Deng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+expression+levels+and+patterns+of+stem+cell+marker%2C+aldehyde+dehydrogenase+isoform+1+%28ALDH1%29%2C+in+human+epithelial+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers.</a> PLoS One. 5 (4), e10277(2010).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+expression+correlates+with+favorable+prognosis+in+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers.</a> Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).</li>
<li>Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+activity-based+sensing+probes+for+isoform-selective+imaging+of+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity.</a> Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).</li>
<li>Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+ovarian+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of ovarian cancer: a review.</a> Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).</li>
<li>Tulake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+stem+cell+markers+ALDH1A1+and+OCT4+as+potential+biomarkers+for+the+early+detection+of+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma.</a> Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).</li>
<li>Nwani, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ALDH1A1+inhibitor+targets+cells+with+stem+cell+characteristics+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer.</a> Cancers. 11 (4), 502(2019).</li>
<li>Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1A1+%28ALDH1A1%29+expression+by+immunohistochemistry+is+associated+with+chemo-refractoriness+in+patients+with+high-grade+ovarian+serous+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma.</a> Human Pathology. 73, 1-6 (2018).</li>
<li>Landen Jr, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aldehyde+dehydrogenase+cancer+stem+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).</li>
<li>Condello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-catenin-regulated+ALDH1A1+is+a+target+in+ovarian+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids.</a> Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).</li>
<li>Storms, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primitive+human+hematopoietic+progenitors+on+the+basis+of+aldehyde+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescence+assay+for+aldehyde+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity.</a> Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).</li>
<li>Minn, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red-shifted+fluorescent+substrate+for+aldehyde+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase.</a> Nature Communications. 5, 3662(2014).</li>
<li>Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+ALDH+substrates+and+their+potential+to+study+maturational+lineage+biology+in+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).</li>
<li>Yagishita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+highly+selective+fluorescent+probe+enabling+flow-cytometric+isolation+of+ALDH3A1-positive+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).</li>
<li>Maity, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiophene+bridged+aldehydes+%28TBAs%29+image+ALDH+activity+in+cells%3A+Via+modulation+of+intramolecular+charge+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer.</a> Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).</li>
<li>Koenders, S. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+retinal-based+probe+for+the+profiling+of+retinaldehyde+dehydrogenases+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells.</a> ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).</li>
<li>Oe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep-red%2Fnear-infrared+turn-on+fluorescence+probes+for+aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).</li>
<li>Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+BODIPY-based+blue+fluorescent+probes+for+aldehyde+dehydrogenase+1-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).</li>
<li>Okamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+cancer+stem+cells+using+a+newly+developed+long-acting+fluorescence+probe%2C+C5S-A%2C+targeting+ALDH1A1%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1.</a> Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).</li>
</ol>

AlDeSense teknolojisi için bekleyen bir patenti (US20200199092A1) açıklıyoruz.

Pan-seçicilik, birçok ALDH probunun önemli bir sınırlamasıdır; Bununla birlikte, son zamanlarda birkaç izoform seçici örnek bildirilmiştir 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Bu çalışmada kull...

Kanser kök hücreleri (CSC'ler), kök hücre benzeri özellikler sergileyen tümör hücrelerinin bir alt popülasyonudur1. Kanserli olmayan meslektaşlarına benzer şekilde, CSC'ler kendini yenilemek ve çoğalmak için olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. ATP bağlayıcı kaset taşıyıcılarının yukarı regülasyonu gibi diğer yerleşik mekanizmalarla birlikte, CSC'ler genellikle ilk cerrahi debulking çabalarından ve sonraki adjuvan tedaviden2 korunur. Tedavi direnci3, nüks4 ve metastaz5'teki kritik rolleri nedeniyle, CSC'ler kanser araştırmalarında bir öncelik haline gelmiştir. CSC'leri tanımlamak için kullanılabilecek çeşitli hücre yüzey antijenleri (örneğin, CD133) olmasına rağmen, 6, sitoplazmada bulunan aldehit dehidrojenazların (ALDH'ler) enzimatik aktivitesinden yararlanmak çekici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır7. ALDH'ler, reaktif endojen ve ksenobiyotik aldehitlerin karşılık gelen karboksilik asit ürünlerine oksidasyonunu katalize etmekten sorumlu 19 enzimin bir üst ailesidir8.
Genel olarak, aldehit detoksifikasyonu, hücreleri istenmeyen çapraz bağlanma olaylarından ve kök hücre bütünlüğüne zarar verebilecek oksidatif stresten korumada çok önemlidir9. Dahası, 1A1 izoformu retinoik asit metabolizmasını kontrol eder ve bu da retinaldehit sinyali10 yoluyla gövdeyi etkiler. ALDH1A1 aktivitesini seçici olarak tespit etmek için küçük moleküllü aktivite tabanlı bir algılama (ABS) probu olan AlDeSense 11,12, yakın zamanda geliştirilmiştir. ABS tasarımları, bağlayıcı bir olaydan ziyade kimyasal bir değişiklik yoluyla analit tespiti yaparak, yüksek seçiciliğe ve hedef dışı tepkilerin azalmasına izin verir13,14,15,16. İzoform seçici florojenik probun tasarım prensibi, prob18'in floresan imzasını bastırmaya yarayan aldehit fonksiyonel grubundan kaynaklanan bir donör-fotoindüklenmiş elektron transferi (d-PeT) söndürme mekanizması17'ye dayanır. ALDH1A1 aracılı karboksilik aside dönüştürüldükten sonra, yüksek floresan bir ürün elde etmek için ışınımsal gevşemenin kilidi açılır. D-PeT söndürme hiçbir zaman% 100 verimli olmadığından, olası yanlış pozitif sonuçlara yol açabilecek artık floresan, bu tahlili oluştururken, eşleşen fotofiziksel özelliklere (örneğin, kuantum verimi) ve hücrelerde aynı sitoplazmik boyama modeline sahip yanıt vermeyen bir reaktif olan Ctrl-AlDeSense'in geliştirilmesi yoluyla göz önünde bulundurulmuştur. Birlikte kullanıldığında, bu benzersiz eşleştirme, yüksek ALDH1A1 aktivitesine sahip hücreleri, florimetri, moleküler görüntüleme ve akış sitometrisi yoluyla düşük seviyeler sergileyenlerden güvenilir bir şekilde ayırt edebilir. Birçok önemli avantaj, geleneksel immünohistokimyasal yöntemlere göre izoform seçici aktive edilebilir boyaların kullanımı ile ilişkilidir. Örneğin, CSC'lerin bir tümörün derinliklerine gömüldüğü varsayılmıştır ve bu nedenle büyük antikorlara göre küçük bir molekül için daha erişilebilirdir19. Ek olarak, ters çevrilmiş floresan ürün herhangi bir hücresel bileşeni kovalent olarak değiştirmez, yani bir CSC'yi değiştirilmemiş bir durumda bırakmak için yıkama döngüleri yoluyla kolayca çıkarılabilir. Son olarak, açılma yanıtı, NAD + kofaktörüne olan bağımlılığı nedeniyle, MTT testi gibi, yalnızca canlı hücreleri ve işlevleri tanımlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig01.jpg"> Şekil 1: AlDeSense'in floresan açılımını gösteren şematik. İzoform seçici boya, ALDH1A1 tarafından aktive edilir ve yumurtalık kanseri hücrelerinde yüksek ALDH1A1 aktivitesini florimetri, moleküler görüntüleme ve akış sitometrisi yoluyla tanımlamak için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64713/64713fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Geçmiş çalışmalarda, izoform seçici florojenik prob testi, K562 insan kronik lösemi hücrelerinde, MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinde ve B16F0 murin melanom hücrelerinde ALDH düşük (ALDH-) hücrelerden ALDH yüksek (ALDH +) hücrelerini başarıyla tabakalaştırdı. Bu önemlidir, çünkü birçok kanser türü için yüksek ALDH1A1 protein ekspresyonu daha kötü bir klinik prognozu gösterir20. Bu, yüksek ALDH1A1 seviyelerinin, tedaviden kaçabilen, direnç geliştirebilen ve vücuda yayılabilen CSC'lerin göstergesi olduğunu varsaymaktadır. Bununla birlikte, yumurtalık kanseri durumunda, tam tersi bulguyu bildiren çalışmalar vardır (yüksek ALDH1A1 ekspresyonu, hasta sağkalımının iyileşmesi ile bağlantılıdır)21,22,23,24. Bu ilk bakışta çelişkili görünse de, ekspresyon mutlaka tümör mikroortamındaki değişikliklerden (örneğin, pH akısı, oksijen gradyanları), NAD + kofaktör veya aldehit substratlarının mevcudiyeti, karboksilik asit seviyeleri (ürün inhibisyonu) ve enzim aktivitesini değiştirebilen translasyonel sonrası modifikasyonlardan etkilenebilecek enzim aktivitesi ile ilişkili değildir25 . Ek olarak, yumurtalık kanseri beş ana histolojik tipe (yüksek dereceli seröz, düşük dereceli seröz, endometrioid, berrak hücreli ve müsinöz) ayrılır ve bunların ALDH1A1 aktivitesinin değişken seviyelerine sahip olacağını varsayıyoruz26. Yumurtalık tümörlerinde ALDH1A1 aktivitesini araştırmak amacıyla, yukarıda belirtilen farklı histolojik tiplere ait beş yumurtalık kanseri hücre hattından oluşan bir panelde ALDH1A1 + popülasyonlarını tanımlamak için izoform seçici bir florojenik prob testi kullanılmıştır. Bu çalışmada test edilen hücre hatları, berrak hücreli ve seröz histotipleri kapsayan BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 ve PEO4 hücrelerini içerir. Burada, probun çok yönlülüğü ve genellenebilirliği, diğer ölümsüzleştirilmiş kanser hücre hatlarında ve hasta örneklerinde benzer çalışmalar yapmak isteyen araştırmacılar için CSC'leri tanımlamak için vurgulanmıştır. AlDeSense'in kullanımı, karmaşık doku mikro ortamlarında CSC bakımında yer alan biyokimyasal yollara ışık tutacak ve potansiyel olarak prognozu belirlemek ve kanser saldırganlığını ölçmek için klinik bir araç olarak hizmet edecektir.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Kalsiyum, Magnezyum ve Sodyum Bikarbonat içermeyen HBSS'de %0.25 Tripsin, %0.1 EDTA</td><td>Corning</td><td>&nbsp; &nbsp; 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfat Tampon Salin</td><td>Corning</td><td>21-040-CMX12</td><td></td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>AlDeSense</td><td></td><td></td><td>Sentezlenmiş şirket içi</td></tr><tr><td>BG-1</td><td></td><td></td><td>Prof. Paul Hergenrother Lab, Illinois Üniversitesi Urbana-Champaign BioLite tarafından sağlanan bir hediye</td></tr><tr><td>25cm2 Şişe</td><td>Termo Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td></td><td></td>130189</tr><tr><td>Biyogüvenlik Kabini 1300 serisi A2</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caov-3</td><td></td><td></td><td>Prof. Erik Nelson Lab, Illinois Üniversitesi tarafından sağlanan bir hediye Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>Hücre homojenizatörü</td><td>Fisher Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5180R</td><td>Eppendorf</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>Contrl-AlDeSense</td><td></td><td></td><td>Sentezlenmiş kurum içi</td></tr><tr><td>DMEM, %10 FBS, %1 P/S</td><td></td><td></td><td>UIUC hücresi tarafından hazırlanmıştır. medya tesisi</td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeci Geçmeli Kapaklı Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpleri, 5 mL</td><td>Corning</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td></td><td></td><td>UIUC CMtO</td></tr><tr><td>FL mikroskobu</td><td>EVOS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Florometre</td><td>Foton Teknolojisi Uluslararası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Serisi II Su Ceketli CO2&nbsp; Kuluçka</td><td>makinesi Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>IGROV-1</td><td></td><td></td><td>Prof. Erik Nelson Lab, Illinois Üniversitesi Urbana-Champaign tarafından sağlanan bir hediye</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 42R İnkübe Çalkalayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Odacıklı # 1.0 Borosicilat Kapak Camı Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>155383</tr><tr><td>OVCAR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>PEO4</td><td></td><td></td><td>Illinois Üniversitesi Prof. Erik Nelson Laboratuvarı tarafından sağlanan bir hediye Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>Pierce Proteaz İnhibitörü Tabletleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI, %10 FBS, %1 P/S</td><td></td><td></td><td>UUCUC hücre ortamı tesisi tarafından hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>RPMI, %20 FBS, %1 P/S, 0.01 mg/mL İnsülin</td><td></td><td></td><td>UIUC hücre ortamı tesisi tarafından hazırlanmıştır</td></tr></tbody></table>

aldehit dehidrogenaz 1a1 aktivitesine dayalı yumurtalık kanseri hücrelerini tabakalaştırmak için aldesense'in uygulanması

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

Kanser tedavisinden sonra nüks genellikle kanser kök hücreleri (CSC'ler) olarak bilinen tümör hücrelerinin bir alt popülasyonunun kalıcılığına atfedilir ve bunlar dikkat çekici tümör başlatıcı ve kendini yenileme kapasiteleri ile karakterize edilir. Tümörün kökenine (örneğin, yumurtalıklar) bağlı olarak, CSC yüzey biyobelirteç profili önemli ölçüde değişebilir, bu da bu tür hücrelerin immünohistokimyasal boyama yoluyla tanımlanmasını zorlu bir çaba haline getirir. Aksine, aldehit dehidrogenaz 1A1 (ALDH1A1), CSC'ler de dahil olmak üzere hemen hemen tüm progenitör hücrelerde korunmuş ekspresyon profili nedeniyle, CSC'leri tanımlamak için mükemmel bir belirteç olarak ortaya çıkmıştır. ALDH1A1 izoformu, çeşitli endojen ve ksenobiyotik aldehitlerin karşılık gelen karboksilik asit ürünlerine oksidasyonundan sorumlu olan 19 enzimden oluşan bir süper aileye aittir. Chan ve ark. yakın zamanda ALDH1A1 aktivitesinin tespiti için izoform seçici bir "açma" probu olan AlDeSense'i ve ayrıca hedef dışı boyamayı hesaba katmak için reaktif olmayan bir eşleştirme kontrol reaktifini (Ctrl-AlDeSense) geliştirdi. Bu izoform seçici aracın, K562 miyelojen lösemi hücrelerinde, mamosferlerde ve melanom kaynaklı CSC ksenogreftlerinde ALDH1A1 aktivitesinin tespiti yoluyla çok yönlü bir kimyasal araç olduğu zaten gösterilmiştir. Bu makalede, probun faydası, beş yumurtalık kanseri hücre hattından oluşan bir panelde göreceli ALDH1A1 aktivitesinin belirlendiği ek florimetri, konfokal mikroskopi ve akış sitometri deneyleri ile gösterilmiştir.

Yumurtalık kanseri hücre homojenatlarının toplam ALDH1A1 aktivitesi Bu tahlilden elde edilen her hücre hattı için ortalama kıvrım dönüşleri şunlardır: BG-1 (1.12 ± 0.01); IGROV-1 (1.30 ± 0.03); Caov-3 (1.72 ± 0.06); PEO4 (2,51 ± 0,29); ve OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (Şekil 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig02.jpg"> Şekil 2: ...

Canlı hücrelerde ALDH1A1 aktivitesini ölçme yöntemleri, köklülüğün biyobelirteci olarak statüsü nedeniyle kanser araştırmalarında kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada, beş yumurtalık kanseri hücre hattından oluşan bir panelde ALDH1A1 aktivitesinin göreceli seviyelerini belirlemek için izoform seçici bir florojenik prob kullandık.

Aldehit Dehidrogenaz 1A1 aktivitesine dayalı yumurtalık kanseri hücrelerini tabakalaştırmak için AlDeSense'in uygulanması

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...

Protokolümüz, kullanıcıların akış sitometrisinden canlı hücre moleküler görüntülemeye kadar çeşitli modaliteler kullanarak bir kök hücre biyobelirteci olan ALDH1A1 aktivitesini ölçmelerini sağlar. Bu yaklaşımın en büyük avantajları, prob aktivasyonunun, seçici ALDH1A1 izoform tespitinin yanı sıra yüksek sinyal-arka plan oranı ile karakterize edilen geri dönüş tepkisini içermesidir. Bu prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan Michael Lee, Sarah Gardner ve Rodrigo Tapia Hernandez lisansüstü öğrencileri olacak.Başlamak için, sekiz kuyu odası slaytında ilgilenilen kültürlenmiş hücrelerden büyüme medyasını aspire edin. İki mikromolar izoform seçici florojenik prob veya reaktif olmayan bir kontrol probu ile desteklenmiş serum serbest ortam kuyucuğu başına 500 mikrolitre ekleyin. Slaydı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyondan sonra, hemen konfokal mikroskop görüntülemeye geçin. Hücreleri 10 x büyütmede bulun. Bu deney için FITC kanalı ve iletilen ışık kanalları gereklidir.Önyargıyı ortadan kaldırmak için deneyin tamamı boyunca aynı Z düzlemine odaklanmak için iletilen ışık kanalını kullanarak hücreleri bulun ve odaklayın. Lazer gücünü ve FITC kazancını, AlDeSense numunelerinde sinyal görmeye devam ederken, kontrol AlDeSense numunelerinden gelen sinyalin minimum düzeyde algılanabildiği uygun ayara ayarlayın. İlgili çubuğu kaydırarak her parametreyi ayarlayın.Doğru parametreleri tanımlamak için ayarların birkaç kez ayarlanması gerekebilir. Optimize edildikten sonra, aynı parametreleri kullanarak denemenin geri kalanını bu hücre satırında tamamlayın. Tedavi koşulu başına toplam üç kuyucuk için kuyu başına üç görüntü çekin ve görüntüleri kaydedin.Önyargıyı önlemek için yalnızca düzlemler ve kuyular arasında geçiş yaparken iletilen ışık kanalını kullanarak odaklandığınızdan emin olun. Daha sonra, görüntü işleme yazılımını kullanarak CZI dosyasını farklı kanallara bölün ve toplam hücre sayısını ve floresan hücreleri sayın. Aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için, floresan hücrelerin sayısını her görüntüdeki toplam hücre sayısına bölün.Değişkenleri karıştırmaktan kaçınmak için her görüntü için aynı şekilde sayın. İnkübatörde tutulan hücreleri içeren bir T25 hücre kültürü şişesi çıkarın. Hücre ayrılması için tripsin ekleyin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde, 25 santigrat derecede beş dakika boyunca 180G'de santrifüjleme yoluyla pelet haline getirin. PBS'de iki mikromolar probun veya kontrol probu çözeltisinin bir mililitresindeki hücreleri tekrar askıya alın. Boyaya eşit maruz kalmayı sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sallayın.Kuluçka döneminden sonra, hücreleri 25 santigrat derecede beş dakika boyunca 180 G'de santrifüjleme yoluyla pelet edin. Daha sonra hücreleri 0.5 mililitre PBS'de tekrar askıya alın. Akış sitometresini tıkayabilecek hücre kümelerini çıkarmak için hücreleri 35 mikrometrelik bir naylon ağ hücre süzgecinden buz üzerine yerleştirilmiş bir tüpe geçirin.Akış sitometresi cihazını açın ve başlangıç protokolünü çalıştırın. Kılıf sıvısı ve boş bel olup olmadığını kontrol edin. Hatları her biri beş dakika boyunca% 10 ağartıcı ve su ile çalıştırın.Ardından, düzgün çalışmasını sağlamak için kalite kontrol boncuklarını çalıştırın. Ayarlar sekmesinde, floresan filtresi için ileri saçılma yan saçılımı ve FITC'yi seçin. Grafiğin merkezine yakın ana hücre popülasyonu için bir yan dağılım alanı grafiğine karşı bir ileri dağılım alanı çizin.Ardından, teklileri gösteren dar yatay bantlar için ileri saçılma genişliği grafiğine karşı ileri saçılma alanı çizin. Ardından, izoform seçici florojenik açma probu tarafından sıralanan hücrelerin dağılımını gözlemlemek için bir ileri saçılma alanı grafiğine karşı bir FITC alanı çizin. Daha sonra, FITC'ye dayalı popülasyondaki değişimi gözlemlemek ve aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için bir FITC alan histogramı çizin.FITC lazer gücünü optimize etmek için, histogram eğrisinin sağ kuyruğu maksimum FITC alan sinyaline yakın olacak şekilde probla bir numune çalıştırın. Lazer gücü optimizasyonu adımının birden çok kez tekrarlanması gerekebilir, ancak bir deney için bir ayar belirlendikten sonra lazer gücü numuneler arasında değiştirilmemelidir. Daha sonra, eleğete bir numune ekleyin ve kontrol probu ile çalıştırın.Maksimum dinamik aralığı ortaya çıkarmak için bir popülasyon kayması gözlemlenebilir olmalıdır. Her örneği üçlü olarak yapılan 10.000 sayım için çalıştırın. Numune toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hatları her biri beş dakika boyunca %10 ağartıcı ve su ile çalıştırın, ardından cihazı kapatın.Akış sitometri yazılımını kullanarak verileri işleyin ve istenen hücre popülasyonunu yürüyün. Dikdörtgen kapı seçimini kullanarak, aldehit dehidrogenaz 1A1 negatif yürüyüşünü ayarlayın, böylece kontrol probu numunelerindeki olayların% 99,5'inden fazlası bu kapı içinde gerçekleşir. Kalan hücreler aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif olarak kabul edilecektir.Aynı kapıları prob numunesine uygulayın. Aldehit dehidrogenaz 1A1 negatif ve 1A1 pozitif olarak kabul edilen olayların sayısını ölçmek. Her hücre hattı için ortalama kıvrım dönüşleri, toplam aldehit dehidrogenaz 1A1 aktivitesini ölçmek için belirlendi.Aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin yüzdesi, lazer gücü ve kazancı ayarlanarak her hücre hattında belirlendi. Kontrol AlDeSense ile muamele edilen numunedeki sinyali en aza indirmek için, floresan sinyali AlDeSense ile muamele edilen hücrelerde optimize edilmiştir. Aldehit dehidrogenaz A1A pozitif hücrelerin sayısı sayılarak, aldehit dehidrogenaz A1A pozitif hücrelerin yüzdesi belirlendi.İzoform seçici florojenik probun uygulanmasıyla, aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücre popülasyonu, kontrol AlDeSense ile tedavi edilen popülasyondaki en parlak hücrelerin en üst% 0.5'ine geçitlenerek her hücre hattında ölçülmüştür. Yumurtalık kanseri hücrelerinin panelinin analizi, aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin yüzdesini ortaya koymuştur. Test edilen kanser hücre hatlarının elde edilen sonuçlarından, BG-1'in en düşük aldehit dehidrogenaz 1A1 aktivitesine ve en düşük aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif popülasyonuna sahip olduğu sonucuna varılabilir.Ek olarak, konfokal görüntüleme ve akış sitometrisi, Caov-3 hücrelerinde aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin en büyük yüzdesini ortaya koymuştur. Ancak hücre hattının genel aktivitesi sadece üçüncü en yüksek seviyedeydi. Alternatif olarak, OVCAR-3 hücreleri üçüncü en yüksek aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif popülasyonunu içeriyordu, ancak en yüksek genel aktiviteyi sergiledi.AlDeSense, ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarında ve hasta örneklerinde CSC'leri tanımlamak için çok yönlü ve genelleştirilebilir bir probdur. Klinik ortamda prognostik bir araç olarak görmeyi umuyoruz.

application-aldesense-to-stratify-ovarian-cancer-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Singeneik immün yetmetik konakçılarda değerlendirilen kanser kök hücre (KSS) bazlı dendritik hücre (DC) aşısı, heterojen dökme tümör hücreleri ile nabızlanan geleneksel DC aşılarına göre önemli ölçüde daha yüksek antitümör bağışıklık göstermiştir.

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

İn vitro küre testleri, kanser kök hücrelerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Burada tek ve çok hücreli küre tahlillerini karşılaştırıyoruz. Daha zahmetli tek hücre bazlı tahliller veya metilselüloz takviyesi daha doğru sonuçlar verirken, sıvı ortamda gerçekleştirilen çok hücreli bazlı tahliller hücre yoğunluğundan büyük ölçüde etkilenebilir.

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Tümör başlatıcı hücreler (TIC'ler), oldukça tekrarlayan ve ölümcül bir hastalık olan yumurtalık kanserinin tedavisi için uygun bir terapötik hedef olabilir. Bu yüksek derecede tümörjenik hücre popülasyonu için zenginleştiren kültür koşulları için bir protokol sunuyoruz.

Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Burada bir tümörün genomik yapısına dayalı olarak seçilen hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini test etmek için bir protokol sayılacağız. Protokol, yapısal DNA düzenlemelerinin tanımlanması ve doğrulanması, hastaların tümörlerinin farelere engraftasyonu ve ilgili ilaçlara verilen yanıtların test edilmesi olarak tanımlanmaktadır.

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

Bu protokol, lazer mikrodiseksiyonu kullanarak histoloji ile çözülmüş hücre popülasyonlarının zenginleştirilmesi için lekeli, ince doku kesiti görüntülerinden patoloji onaylı ilgi alanlarının yapay zeka odaklı segmentasyonu için yüksek verimli bir iş akışını açıklamaktadır. Bu strateji, ilgilenilen hücre popülasyonlarını gösteren sınırların doğrudan lazer mikroskoplara aktarılmasını sağlayan yeni bir algoritma içerir.

Tümör Mikroçevresinin Mikro Ölçekli Proteomik Analizi için Endüstriyelleşmiş, Yapay Zeka Rehberliğinde Lazer Mikrodiseksiyonu

Hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri ile terapötik ilaç testi yapmak için kullanılabilecek bir protokol sunuyoruz.

Klinik Öncesi İlaç Testi için Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoid Modeller

Bu protokol, farklı hastalık evrelerinden yumurtalık kanseri organoidlerinin oluşturulması için sistematik bir çerçeve sunar ve verimi artırmak ve sonraki uygulamalar için sağlam uzun vadeli genişleme sağlamak için hastaya özgü değişkenliğin zorluklarını ele alır. Doku işleme, tohumlama, ortam gereksinimlerini ayarlama ve immünofloresan boyama için ayrıntılı adımlar içerir.

Yumurtalık Kanseri Organoidlerinin Biyobankacılığı Stratejisi: Histolojik Alt Tipler ve Hastalık Evrelerinde Hastalar Arası Heterojenliğin Ele Alınması

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Bu deneysel protokol, lncRNA'nın koloni oluşturan testlerle birleştirerek lncRNA'nın osteosarkom hücre çoğalması üzerindeki etkisini niceleyen istikrarlı, maliyet etkin ve verimli bir yöntem sunar.

Koloni Oluşumu Testi LncRNA Knockdown Osteosarkom Hücrelerinin Proliferatif Kapasitesini Tespit Ediyor

Keşfedin ALDH1A1 aktivitesini ölçme yöntemini, kanser kök hücre biyobelirteci için akış sitometrisi ve canlı hücre görüntüleme kullanarak. Bu protokol yumurtalık kanser hücrelerinde yüksek duyarlılıkla seçici izoform tespiti sağlar.

Aldehit Dehidrogenaz 1A1 aktivitesine dayalı yumurtalık kanseri hücrelerini tabakalaştırmak için AlDeSense'in uygulanması

Daha fazla video keşfet