Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tüm Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi
December 16th, 2022
Nörobilimde az çalışılmış bir doku olan koroid pleksus (SP), merkezi sinir sisteminin sağlığında ve hastalığında önemli bir rol oynar. Bu protokol, SP'yi izole etmek için bir mikrodiseksiyon tekniğini ve hücresel yapısının genel bir görünümünü elde etmek için taramalı elektron mikroskobunun kullanımını açıklar.
Koroid pleksusun bileşimi ve yapısı hakkında daha iyi bir fikir edinmek için, koroid pleksusu beyin ventriküllerinden izole etmek için etkili bir yöntem ilk paha biçilmez bir adımdır. Bu mikrodiseksiyon tekniği ile koroid pleksusu beyin ventriküllerinden dışarı çıkarırken, koroid pleksusu çevreleyen doku ile kirletmeden fonksiyonunu, canlılığını ve yapısını içerecek şekilde diseke etmek mümkündür. Koroid pleksus izolasyonundaki önemli bir engel, yapıyı hala beyin ventriküllerinde yüzerken tanımlamaktır.
Koroid pleksusun bromofenol mavisi ile boyanması izolasyonu kolaylaştırır. Prosedürü gösteren, laboratuvar yöneticimiz Elien Van Wonterghem olacaktır. Bir terminal anestezik, transkardiyal perfüzyon çözeltisi ve elektron mikroskobu veya SEM ve metinde belirtildiği gibi diğer çözeltileri taramak için gerekli bir çözelti hazırlayarak başlayın.
Fare beynini izole etmek için ölümcül anestezi altındaki hayvanı dorsal decubitus pozisyonuna yerleştirin ve uzuvları bir tabağa sabitleyerek fareyi sabitleyin. Karbon çelik cerrahi bıçak kullanarak diyaframın hemen altında yaklaşık dört santimetrelik bir kesi yapmadan önce% 70 etanol püskürterek göğsü dezenfekte edin. Cildi açın ve cerrahi makas kullanarak göğsü açığa çıkarın.
Akciğerleri ve atan kalbi açığa çıkarmak için diyaframı tamamen açın ve göğüs kafesini ayırın. Bir perfüzyon pompası kullanarak, fareyi dakikada 4,5 mililitre oranında 10 mililitre perfüzyon çözeltisi ile transkardiyal olarak perfüze edin. Çözeltiyi sistemik devreye pompalamak için sol ventriküle 26 gauge'lik bir iğne yerleştirin.
Cerrahi makas kullanarak, kanın dolaşımdan çıkması için sağ atriyumu kesin. Farenin kafası kesildikten sonra kulakların arasından başlayarak gözlerden üstünlüğe doğru bir kesi yaparak kafa derisini kesin. Kafatasını açığa çıkarmak için cildi yanal olarak çekin.
Daha sonra burun kısmına doğru skuamozal dikişleri takip ederek kafatasını kesin. İşiniz bittiğinde, beyni buz gibi soğuk bir Petri kabına yerleştirin ve beyin dokusuna bir mililitre buz gibi PBS ekleyin. Dördüncü ventrikülde yüzen koroid pleksusu izole etmek için, bir neşter kullanarak beyinciği beyincikten yavaşça kesin.
Kalan beyin sapı doku parçalarını beyincikten çıkarın. Beyni, kesme çizgisi yukarı bakacak şekilde döndürün, dördüncü ventrikül boşluğunun, dorsal bölgede yatan koroid pleksus ile bölümün ortasında görünür olmasını sağlayın. Gerekirse, bağ dokusunu keskin forsepslerle çekerek ventrikülü açın.
Koroid pleksusu küçük keskin forsepsler kullanarak ventrikül duvarından yavaşça yırtın. Koroid pleksusu lateral ventrikülden izole etmek için, küçük keskin forsepsler kullanarak beyni sagittal olarak iki yarım küreye bölün. Bir beyin yarımküresini, kesme çizgisi yukarı doğru olacak şekilde döndürün.
Lateral ventrikülü ortaya çıkarmak için korteksi talamustan yavaşça çekin. Hipokampüsü orta sagital kesme hattına geri çekin. Lateral ventrikül artık ventrikülün dibinde yatan koroid pleksus ile görülebilir.
Gerekirse, bağ dokusunu keskin forsepslerle açarak ventrikülü biraz açın. Koroid pleksusu ventrikül duvarından nazikçe koparmak için küçük keskin forseps kullanın. SEM için numune hazırlığını gerçekleştirmek için, taze izole edilmiş koroid pleksusu taze yapılmış fiksasyon çözeltisine aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
İşiniz bittiğinde, numuneyi her biri beş dakika boyunca üç ila beş mililitre 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu kullanarak üç kez yıkayın. Numuneleri üç ila beş mililitre% 2 osmiyum tetroksit içinde 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda 30 dakika bekletin. Daha sonra numuneleri her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın, üç ila beş mililitre ultra saf su kullanın.
Daha sonra, numuneleri artan bir dizi buz gibi soğuk etil alkol konsantrasyonunda, etil alkol çözeltisi başına 15 dakika ile kurutun. Numuneyi düzgün bir şekilde kurutmak için kritik bir nokta kurutucu kullanın. Numuneyi karbon etiketli bir numune montajına dikkatlice yerleştirin ve SEM kullanarak koroid pleksus numunelerini görselleştirin.
Mevcut protokol, koroid pleksusun fare beyninden, lateral ve dördüncü ventriküllerden etkili bir şekilde izole edilmesini kolaylaştırmıştır. Bromofenol mavisi ile yapılan perfüzyon, koroid pleksusun görüntülenmesi ile sonuçlandı. Daha sonraki işlem adımlarında bromofenol mavisine izin verilmediğinde, PBS-heparin ile perfüzyon yapıldı veya işleme için perfüzyon yapılmadı.
Koroid pleksus epitelyal veya CPE hücrelerinin yüzeyinin SEM morfolojik analizi, dördüncü ventrikülün iki kol yapısını ve lateral ventrikülden izole edilen lateral koroid pleksusun tipik C şeklindeki formunu açıkça göstermektedir. Daha yüksek bir SEM büyütmesi, CPE hücrelerinin ve mikrovillusların apikal tarafında vezikül benzeri yapılar ortaya çıkardı, bu da CPE hücrelerinin hastalık koşullarındaki morfolojik değişikliklerinin SEM kullanılarak araştırılabileceğini gösterdi. Numuneyi çevreleyen doku ile kirletmemek için sadece koroid pleksus dokusuna dokunmak ve çıkarmak önemlidir.
Koroid pleksusun yapısını korumak için gerekli dikkati kullanın. İzole koroid pleksusun yapısını ve işlevini araştırmak için mikroskop analizinden transkriptom analizine ve akış sitometrisine kadar çeşitli aşağı akış teknikleri uygulanabilir. Koroid pleksusun beyinden mikrodiseksiyonu, bu küçük beyin dokusunun yapısı ve işlevi hakkında daha iyi bir fikir edinmemizi sağlar.
Bu bilgi, nörolojik hastalıklardaki rolünü daha iyi anlamak için gereklidir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, fare beyin ventriküllerinden korioid pleksusun (CP) izole edilmesi için bir mikrodiseksiyon tekniğini ve hücresel yapısını incelemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanımını detaylandırmaktadır. CP'nin mimarisini ve işlevini anlamak, özellikle merkezi sinir sistemi sağlığı ve hastalıklarına dahil olması açısından sinirbilimde esastır.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Nöroanatomi
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Korioid pleksus önemli ancak yeterince incelenmemiş bir dokudur.
- Merkezi sinir sisteminin sağlığı ve patolojisinde kritik bir rol oynar.
- CP'nin verimli izolasyonu ve karakterizasyonu, nörolojik hastalıkları anlamak için önemlidir.
Çalışmanın Amacı
- Fare beyin ventriküllerinden korioid pleksusu izolasyonu için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Taramalı elektron mikroskobu kullanarak korioid pleksusun hücresel yapısını incelemek.
- İzolasyon sırasında korioid pleksusun canlılığı ve bütünlüğünü korumak.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışma, korioid pleksusu izole etmek için mikrodiseksiyon tekniklerini kullanır.
- İzolasyon sürecinde fare modelleri kullanılır ve dördüncü ve lateral ventriküllere özel odaklanma ile.
- Metodyoloji, terminal anestezi, cerrahi prosedürler ve SEM analizi için fiksasyonu içerir.
- Kritik adımlar, gelişmiş görselleştirme için bromofenol mavisi boyama kullanımını ve kontaminasyonu önlemek için titiz elleçlemeyi içerir.
Ana Sonuçlar
- Protokol, korioid pleksusu etkili bir şekilde izole ederek SEM ile morfolojik analizi mümkün kılar.
- Gözlemler, korioid pleksus epitel hücrelerinin mikrovilliler ve vezikül benzeri yapılar dahil olmak üzere kesin yapısal özelliklerini ortaya koymuştur.
- Bu bulgular, hücresel düzeyde hastalıkla ilgili değişikliklerin araştırılmasını mümkün kılar.
Sonuçlar
- Bu çalışma, detaylı yapısal analiz için korioid pleksusu izole etmek için düzenli bir yaklaşımı gösterir.
- Elde edilen bilgiler, CP'nin nörolojik sağlık ve hastalıktaki rolü hakkındaki anlayışımızı artırabilir.
- Genel olarak, yöntem bu kritik ancak sıklıkla göz ardı edilen beyin bileşeni üzerinde çalışmanın önemli bir gelişimine olanak tanır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Efficient microdissection and SEM visualization of the mouse choroid plexus (CP) enable high-fidelity structural and functional analysis of this critical CNS interface. This workflow supports early discovery efforts by providing uncontaminated, viable CP tissue for downstream molecular and morphological studies, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in neurobiological research. Reliable CP isolation underpins translational continuity for CNS disease models and biomarker exploration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of CP structure and function for target validation in CNS research.
- Supports mechanistic de-risking by preserving tissue viability and minimizing contamination.
- Facilitates predictive confidence in early-stage neurobiological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated CP tissue for quantitative downstream assays, including transcriptomics and proteomics.
- Ensures reproducibility and standardization by maintaining structural integrity during isolation.
- Prepares samples suitable for high-resolution imaging and scalable analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables investigation of disease-relevant morphological changes in CP epithelial cells using SEM.
- Supports alignment of preclinical models with human CNS disease mechanisms.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural findings to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This microdissection and SEM protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing foundational tissue samples for molecular, cellular, and imaging analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating uncontaminated CP tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples for reproducible quantitative measurements.
- Analytics: Enables high-resolution morphological readouts and comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling disease-relevant structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Promotes reproducibility, standardization, and scalability in tissue preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and SEM sample preparation.
- Needs access to perfusion equipment, fixation reagents, and electron microscopy infrastructure.
- Demands strict cross-team standardization to avoid tissue contamination.
- Adaptable to other species with protocol modifications as needed.
- Careful handling is essential to preserve CP structure and downstream analytical quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:59
Microdissection of the Choroid Plexus Out of the Lateral and Fourth Ventricle
3:47
Morphological Analysis of Choroid Plexus Tissue Using Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:48
Results: Isolation of Choroid Plexus and Analysis of Cellular Structure
5:49
Conclusion
