Name: Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanarak Yumurtalık Hücrelerinde X Kromozomal Anormalliklerinin Araştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Öğrenin, X kromozomal anormallikli kadınlarda yumurtalık hücrelerinin X kromozom içeriğini floresan in situ hibridizasyon ile analiz etme yöntemlerini. Bu teknikler üreme potansiyeli araştırmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef ve Milan Intezar'a uzmanlıkları ve teknik yardımları için teşekkür eder. Finansman kaynakları: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ve Ferring.

TurnerFertility çalışma protokolü, İnsan Denekleri İçeren Araştırma Merkez Komitesi (NL57738.000.16) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada TS'li 93 kadının yumurtalık korteks dokusu elde edilmiştir. Güvenlik önlemleri gerektiren malzemeler Tablo 1'de listelenmiştir.
Tablo 1: Güvenlik önlemleri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Malzeme</td>
			<td colspan="3">Tehlike</td>
		</tr><tr><td>Asetik asit</td>
			<td colspan="3">Ciddi cilt yanıkları ve solunum sisteminin tahrişi</td>
		</tr><tr><td>Kollajenaz</td>
			<td colspan="3">Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder</td>
		</tr><tr><td>cesaret</td>
			<td colspan="3">Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder</td>
		</tr><tr><td>DNaz I</td>
			<td colspan="3">Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder</td>
		</tr><tr><td>Etanol</td>
			<td colspan="3">Son derece yanıcı</td>
		</tr><tr><td>Formaldehit</td>
			<td colspan="3">Soluma, yutma ve cilt temasından sonra toksiktir</td>
		</tr><tr><td>Formamid (floresan problarda)</td>
			<td colspan="3">Doğmamış çocuğa zarar verebilir</td>
		</tr><tr><td>Arjantin</td>
			<td colspan="3">Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder</td>
		</tr><tr><td>Metanol</td>
			<td colspan="3">Son derece yanıcıdır, soluma, yutulması ve cilt teması ile toksiktir</td>
		</tr><tr><td>Nonidet P40</td>
			<td colspan="3">Cildi veya gözleri tahriş eder</td>
		</tr><tr><td>Arjantin</td>
			<td colspan="3">Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder</td>
		</tr><tr><td>Proteinaz K</td>
			<td colspan="3">Soluma sonrası solunum güçlüğü</td>
		</tr><tr><td>Ksilen</td>
			<td colspan="3">Son derece yanıcıdır, inhalasyon ve cilt temasından sonra toksiktir. Gözlerle temasından kaçının.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Güvenlik önlemi gerektiren malzemeler.
1. İzole edilmiş bireysel yumurtalık korteks hücrelerinde FISH
<ol><li>Bireysel hücreler elde etmek için yumurtalık korteks dokusunun ayrışması<ol><li>Kriyoprezervasyonlu/çözülmüş yumurtalık korteks dokusunu bir neşter kullanarak yaklaşık 1 mm x 1 mm x 1 mm'lik küçük parçalara ayırın.</li>
		<li>C. histolyticum'dan 0.1 mg/mL doku ayrışma enzim karışımı, 10 μg/mL DNaz I ve 1 mg/mL kollajenaz I içeren 4 mL önceden ısıtılmış (37 °C) L15 besiyerinde doku fragmanlarını 37 °C'de maksimum 75 dakika boyunca enzimatik olarak sindirin. Çürütme karışımını her 15 dakikada bir yukarı ve aşağı doğru pipetin.</li>
		<li>% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 4 mL soğuk L15 ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Ayrışmış dokuyu bir kez 8 mL soğuk L15 ortamı ile 500 x g'de santrifüjleme ile yıkayın ve hücrelere zarar vermemek için vorteks olmadan 500 μL L15 ortamında tekrar askıya alın.</li>
		<li>Büyük ölçüde bireysel stromal hücreler ve küçük foliküller (tek bir granüloza hücresi tabakası ile çevrili oositler) içeren hücre süspansiyonunu plastik bir Petri kabına aktarın ve hücre süspansiyonunu stereomikroskop altında inceleyin (100x büyütme).</li>
		<li>75 μm'lik plastik pipet kullanarak küçük folikülleri (<50 μm) manuel olarak toplayın ve foliküllerin birikmesini önlemek için folikülleri 4 °C'de %10 FBS ile desteklenmiş bir L15 ortam damlacığına aktarın. En fazla 30 dakika boyunca folikül toplama işlemini gerçekleştirin. FISH analizinden önce foliküler hücre yayılımını iyileştirmek için, saflaştırılmış folikülleri% 0.06 tripsin, 1 mg / mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 1 mg / mL glikoz çözeltisine aktarın ve 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Küçük foliküllerle kontaminasyonu önlemek için özel dikkat göstererek 75 μm'lik plastik pipet kullanarak korteks hücresi süspansiyonundan yumurtalık stromal hücreleri elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bireysel yumurtalık hücresinin FISH analizi<ol><li>Tripsin / EDTA / glikoz veya stromal hücreler (n > 1.000) ile tedavi edilen yumurtalık foliküllerini (önerilen n = 5-20) bir slayt üzerinde 5 μL 0.15 mM KCl / 15 μL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) damlacıklarına aktarın ve 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Slaytları 300 μL 0,05 mM KCl/%7,5 asetik asit/%22,5 metanol içinde oda sıcaklığında (RT) 2 dakika kurutun ve önceden sabitleyin. Fiksasyonu tamamlamak için slaytları RT'de 2 dakika boyunca metanol / asetik asit (3: 1) ile örtün.</li>
		<li>5 L damıtılmış suya 876 g sodyum klorür ve 441 g tri-sodyum sitrat dihidrat ekleyerek 20x standart sodyum sitrat (SSC) yapın. Daha sonra, 2x SSC elde etmek için 900 mL demineralize (demi) suya 20x SSC'nin 100 mL'sini ekleyin. Numuneyi 73 °C'de 2x SSC'de yıkayın, 100 μL% 2 proteinaz K ile örtün ve bir kapak kayması ile kapatın. Slaytları hibridizasyon istasyonunda 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Kapak kapağını çıkarın ve slaytları RT'de DPBS'de 5 dakika yıkayın. Bu aşamada, malzeme henüz cam kızaklara tam olarak tutturulmamıştır ve bu nedenle bir sallama platformuna yerleştirilmemelidir.</li>
		<li>Slaytları RT'de DPBS'de 5 dakika boyunca yıkayın, ardından her biri 2 dakika boyunca% 70,% 80,% 90 ve% 100 etanolde dehidrasyon yapın. Susuz bırakılmış numuneyi havayla kurutun ve floresan etiketli problarla hibritleştirin.</li>
		<li>Yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için kontrol olarak X kromozomu için sentromere özgü bir prob ve başka bir kromozoma özgü sentromerik prob seçin. Bu durumda, doğrudan florokrom SpectrumGreen ile etiketlenmiş kromozom X (CEP X [DXZ1]) ve doğrudan florokrom SpectrumOrange ile etiketlenmiş kromozom 18 (CEP 18 [D18Z1]) için sentromere özgü problar kullanılır.</li>
		<li>Numuneye 1 μL CEP X, 1 μL CEP 18 ve 18 μL hibridizasyon tamponu ekleyin ve hibridizasyon sırasında probun buharlaşmasını önlemek için slaytlara yapıştırılmış bir kapak kayması ile kapatın. Slaytları 3 dakika boyunca 73 ° C'de denatürasyon için hibridizasyon istasyonuna aktarın, ardından 37 ° C'de bir gece inkübasyonu sırasında hibridizasyon yapın.</li>
		<li>Hibridizasyondan sonra kapak kaymasını ve kalan yapıştırıcıyı slayttan çıkarın. Slaytları 2 dakika boyunca 72 ° C'de 0.4x SSC / % 0.3 Ara-20'de yıkayın, ardından RT'de 2x SSC /% 0.1 Ara-20'de 1 dakika inkübasyon yapın.</li>
		<li>Slaytları% 70,% 80,% 90 ve% 100 etanolde 2 dakikalık inkübasyonlarla kurutun ve karanlıkta hava kurutun. Slaytları 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir montaj ortamı ile örtün. Floresan mikroskobu ile analizden önce -20 ° C'de en az 10 dakika bekletin.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleme<ol><li>X kromozomu için sinyalleri, bir görüntü işleme yazılımına bağlı bir floresan mikroskobu ile inceleyin.<ol><li>İlk olarak, florokrom DAPI'yi seçin.<ol><li>630x büyütmede Yeni Hücre > Canlı > Yakalama'yı seçerek bir görüntü elde edin. Eşiği olan yeni bir pencere açılacaktır. Arka planı simge durumuna küçültmek için eşiğin mavi çubuğunu 0 olarak ve sinyalleri daha parlak hale getirmek için kırmızı çubuğu maksimum (255) olarak ayarlayın. Kabul Et'e tıklayın.</li>
				<li>Daha koyu/daha parlak (12), yarıçap (3) ve derinlik (1) için bir öneri içeren iyileştirme içeren yeni bir pencere görünecektir. Önerilen değerleri kullanın veya memnun kalmazsanız ayarlayın.</li>
			</ol></li>
			<li>İkinci olarak, florokrom SpectrumOrange'ı seçin ve Yakala'ya tıklayın.<ol><li>Arka planı simge durumuna küçültmek için eşiğin mavi çubuğunu 0 olarak ve sinyalleri daha parlak hale getirmek için kırmızı çubuğu maksimum (255) olarak ayarlayın. Kabul Et'e tıklayın.</li>
				<li>İyileştirme içeren pencere, daha koyu/daha parlak (-11), yarıçap (2,7) ve derinlik (0,6) için bir öneriyle birlikte görünür. Önerilen değerleri kullanın veya memnun kalmazsanız ayarlayın.</li>
			</ol></li>
			<li>Son olarak, florokrom SpectrumGreen'i seçin ve Yakala'ya tıklayın.<ol><li>Arka planı simge durumuna küçültmek için eşiğin mavi çubuğunu 0 olarak ve sinyalleri daha parlak hale getirmek için kırmızı çubuğu maksimum (255) olarak ayarlayın. Kabul Et'e tıklayın.</li>
				<li>İyileştirme içeren pencere, daha koyu/daha parlak (0), yarıçap (3) ve derinlik (0) için bir öneri içeren bir öneriyle birlikte görünür. Önerilen değerleri kullanın veya memnun kalmazsanız ayarlayın. Görüntüyü yeni oluşturulan bir dosyaya kaydedin. NOT: Somatik hücreler sadece kontrol kromozomu 18'in iki sinyali görünür olduğunda değerlendirildi. Çoğu oositte, her kromozom için sadece bir sinyal tespit edilebilir.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>Sinyal kaybını önlemek için slaytları analizden sonra karanlıkta 4 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Aşılanmış yumurtalık korteks dokusunun parafin kesitleri üzerinde FISH
NOT: TS'li 18 dişinin kriyoprezervasyonlu/çözülmüş yumurtalık korteks dokusunun bir parçası, 5 ay boyunca şiddetli kombine immün yetmezlikli (SCID) farelere ksenograf edildi. Ksenografting prosedürü daha önce tanımlanmış ve Université Catholique de Louvain'de (Brüksel, Belçika) Hayvan Araştırmaları Komitesi'nin hayvan refahı ile ilgili yerel yönergelerini izleyerek gerçekleştirilmiştir (referans 2014 / UCL / MD / 007) 18,19.
<ol><li>Folikül içeren ksenograflı over korteks dokusunun bölümlerinin seçilmesi<ol><li>Ksenograflı over korteks dokusunu %4 formaldehit içinde sabitleyin ve dokuyu parafin içine yerleştirin. Ekstra parafini çıkarmak için blokları bir neşterle kesin ve parafin bloğunu bir dönme mikrotomunda 4 μm kalınlığa kesin.</li>
		<li>Hangi bölümlerin folikül içerdiğini belirlemek için hematoksilin ve eozin (HE) boyaması için parafin şeridinin her yedinci bölümünü seçin. Bölümü 40-45 ° C'de bir su banyosuna koyun ve immünohistokimya mikroskop slaytlarına monte edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Deparafinizasyon ve HE boyama<ol><li>Slaytları 60 ° C'de 10 dakika boyunca bir sobaya koyun ve daha sonra slaytları 5 dakika boyunca% 100 ksilene batırın. Slaytları doğrudan sobanın üzerine yerleştirmek gerekli değildir. Bölümleri %100 etanolde 15 sn, ardından %96 etanolde 2 x 15 sn nemlendirin. Slaytları musluk suyunda 2 dakika durulayın.</li>
		<li>Slaytları hematoksilin içinde 10 dakika boyunca lekeleyin ve daha sonra slaytları musluk suyunda kısaca durulayın. Slaytları kısaca bir bikarbonat çözeltisine daldırın (5 L damıtılmış suya 100 g magnezyum sülfat ve 10 g sodyum bikarbonat). Slaytları musluk suyunda 5 dakika durulayın.</li>
		<li>Slaytları 4 dakika boyunca eozin ile karşı boyayın ve slaytları% 100 etanol, ardından ksilen ile üç kez dehidre edin. Slaytlardaki HE lekelerini örtün ve foliküllü bölümleri seçmek için HE bölümlerini ışık mikroskobu altında değerlendirin (100x büyütme).</li>
	</ol></li>
	<li>DNA FISH için parafin kesitlerinin ön işlemi ve hibridizasyonu<ol><li>Parafin şeritten foliküller içeren bölümden önce veya sonra yatan yeni bölümleri seçin. Bir bölümü cam slayta monte edin. Parafin bölümlerini 56 °C'de bir ocakta en az 45 dakika kurutun. Slaytları doğrudan sobanın üzerine yerleştirmek gerekli değildir.</li>
		<li>Ksilen içindeki bölümleri 10 dakika boyunca ayırın. Slaytları% 99.5 etanol içine batırın ve musluk suyunda 5 dakika durulayın. Slaytları 96 ° C'de 10 dakika boyunca hedef alma çözeltisi (düşük pH) ile ön işlemden geçirin. Soğuduktan sonra, slaytları damıtılmış suda durulayın.</li>
		<li>Slaytları 5 dakika boyunca 0.01 M hidroklorik asit ile tedavi edin, ardından 37 ° C'de 15 dakika boyunca pepsin sindirimi (200 U / mL) izleyin. Slaytları tekrar 0,01 M hidroklorik asitte ve daha sonra PBS'de durulayın.</li>
		<li>Slaytları %1 formaldehit/PBS ile 5 dakika sabitleyin. Slaytları PBS'de kısaca durulayın ve sonra tekrar yarı suda durulayın. Slaytları% 99.5 etanol içinde kurutun ve havayla kurumasını bekleyin.</li>
		<li>Granüloza hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için kontrol olarak X kromozomu için bir sentromere özgü prob ve başka bir kromozoma özgü sentromerik prob seçin. Burada, kromozom 18 kontrol olarak kullanılır.</li>
		<li>Doğrudan florokrom SpectrumGreen ile etiketlenmiş 5 μL prob CEP 18 (D18Z1) ve önceden işlenmiş slaytlara doğrudan florokrom SpectrumRed ile etiketlenmiş CEP X (DXZ1) probu uygulayın. Bir kapak fişi uygulayın ve alanı fotoğraf yapıştırıcı ile kapatın. Slaytları 10 dakika boyunca 80 ° C'de denatürasyon ve 37 ° C'de gece boyunca hibridizasyon için bir hibridizatöre yerleştirin.</li>
		<li>Ertesi gün, slaytları 42 ° C'de 2x SSC'de 5 dakika durulayın, ardından 73 ° C'de% 0.3 Nonidet P40'ta 2 dakika ve 1 dakika durulayın. 2x SSC'yi yenileyin ve slaytları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tekrar durulayın. Bölmelerin karanlıkta kalması için küveti örtün.</li>
		<li>Slaytları damıtılmış suda kısaca durulayın. Slaytları% 99.5 etanol içinde kurutun ve tekrar hava kurumasını bekleyin. Son olarak, slaytları DAPI ve montaj ortamı içeren bir çözelti ile monte edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleme<ol><li>Sonuçları 630x büyütmede floresan mikroskobu altında analiz edin. Bilgisayarda görüntü işleme yazılımını açın. Profil olarak FISH'i seçin.</li>
		<li>DAPI emisyonunun 431 nm ve uyarımın 359 nm, Teksas kırmızı emisyonunun 613 nm ve uyarmanın 595 nm ve FITC emisyonunun 519 nm ve uyarımın 495 nm olarak ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol edin.</li>
		<li>Canlı > Tek Görüntü Yakala'yı seçerek bir görüntü elde edin. Soldaki Görüntü menüsündeki Pozlama Kaydırıcısı ve Kazanç Kaydırıcısı'nı hareket ettirerek pozlamayı ve kazancı ayarlayarak görüntü kalitesini optimize edin (ör. pozlama: 212 ms ve kazanç: 7,9). Gerekli pozlama ve kazanç görüntüye göre değişebilir; En iyi duruma getirilmiş bir görüntü elde etmek için bu işlem sırasındaki değişiklikleri gözlemleyin. Görüntüyü yeni oluşturulan bir dosyaya kaydedin.</li>
		<li>Sinyal kaybını önlemek için slaytları analizden sonra karanlıkta 4 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+and+infertility%3A+Definition+and+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li>
<li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+female+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li>
<li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility%2C+testing%2C+and+management%3A+a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+National+Research+Centre%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65(2021).</li>
<li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li>
<li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675(2011).</li>
<li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45%2CX+karyotype%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li>
<li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+X+syndrome%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li>
<li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+History%2C+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nano+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3(2014).</li>
<li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Urology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li>
<li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm%3A+diagnostics%2C+indications%2C+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li>
<li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients%3A+a+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li>
<li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurnerFertility+trial%3A+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855(2019).</li>
<li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner%27s+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45%2CX+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li>
<li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+some+patients+with+45%2CX+Turner+syndrome+fertile%3F+A+young+girl+with+classical+45%2CX+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li>
<li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li>
<li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice%3A+comparison+between+four+grafting+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li>
<li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+tissue+damage+after+grafting%3A+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li>
<li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Horizons%22%5BJournal%5D)">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li>
<li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

FISH analizi, hem erkek hem de kadınların lenfositlerinde veya bukkal hücrelerinde X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için iyi bilinen bir tekniktir10. Birçok çalışma, X kromozomal anormallikleri olan erkeklerin gametleri üzerinde FISH'i tanımlamıştır, ancak FISH tarafından X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücreleri hakkında elde edilen ayrıntılı bilgiler hala14'ten yoksundur. Bu makalede, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan alınan aş...

Kısırlık, erkek veya kadın üreme sisteminin bir sağlık sorunudur ve dünya çapında üreme çağındaki yaklaşık 186 milyon bireyi etkilemektedir1. İnfertil çiftlerin en az% 35'inde infertilite, kadın üreme sisteminin bir bozukluğundan kaynaklanır2. Kadın infertilitesine neden olabilecek genetik faktörler, genital sistem anormallikleri, endokrin disfonksiyon, inflamatuar hastalıklar ve iyatrojenik tedavi gibi birçok faktör vardır3.
İnfertil kadınların yaklaşık %10'unda genetik anormallikler mevcuttur 4,5. Tüm genetik anormallikler arasında, X kromozomu anormallikleri yumurtalık disgenezisinin en yaygın nedenidir2. Birçok çalışma, Turner sendromu (TS) veya Triple X sendromlu kadınlarda X kromozomal anormalliklerinin, germ hücrelerinin hızlandırılmış kaybı veya bozulmuş oogenez 6,7,8 nedeniyle erken yumurtalık yetmezliği ile ilişkili olduğunu bildirmiştir.
X kromozomunun anormallikleri ayrılabilir: 1) X kromozomlarının sayısının farklı olduğu ancak X kromozomlarının sağlam olduğu sayısal sapmalar; ve 2) X kromozomunun genetik materyal kazandığı veya kaybettiği yapısal sapmalar 3,9. X kromozomunun sayısal anormallikleri yapısal anormalliklerden daha yaygındır ve genellikle hücre bölünmesi sırasındaki kendiliğinden hatalardan kaynaklanır 3,9. Mayoz sırasında böyle bir hata meydana geldiğinde, anöploid gametlere ve nihayetinde tüm hücrelerde kromozomal anormallikleri olan yavrulara yol açabilir. Ontogenezin erken evrelerinde mitoz sırasında meydana gelen hataların bir sonucu olarak somatik hücrelerde kromozom kusurları ortaya çıktığında, mozaikliğe yol açabilir. Bu bireylerde hem normal X kromozomal içeriğine sahip hücreler hem de X kromozomal anormalliklerine sahip hücreler mevcuttur.
1980'lerde, metafaz ve interfaz kromozomları10,11 üzerindeki spesifik nükleik asit dizilerini görselleştirmek ve bulmak için floresan in situ hibridizasyon (FISH) adı verilen sitogenetik bir teknik geliştirilmiştir. Bu teknik, kromozomdaki belirli bir diziye bağlanmak için floresan etiketli DNA problarını kullanır ve daha sonra bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.
Günümüzde, FISH klinik bir tanı aracı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve kromozomal anormalliklerin saptanmasında altın standart olarak kabul edilmektedir10. Üreme tıbbı alanında, sperm üzerindeki FISH analizi, somatik hücrelerde sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerde spermatozoanın X kromozomal içeriği hakkında fikir edinmek için kullanılmıştır12,13,14. Bu çalışmalar, kromozomal anormallikleri olan erkeklerin, normal karyotipli erkeklere kıyasla menilerinde bulunan anöploid spermatozoa sıklığının daha yüksek olduğunu göstermiştir 12,13,14.
Spermatozoanın aksine, kromozomal anormalliği olan bireylerde yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza / teka hücreleri ve stromal hücreler dahil) X kromozomal içeriği ve bu hücrelerin anöploidisinin üreme potansiyelleri üzerindeki olası sonuçları hakkında çok az şey bilinmektedir. Yumurtalık hücrelerinin karyotipi hakkında spermatozoaya kıyasla az bilgi bulunmasının önemli bir nedeni, kadınların oosit veya yumurtalık korteks dokusu elde etmek için folikül delinmesi veya ameliyatı gibi invaziv bir prosedürden geçmek zorunda kalmalarıdır. Bu nedenle dişi gametlerin araştırma amacıyla elde edilmesi zordur.
Şu anda, Hollanda'da TS15'li genç kadınlarda yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonunun etkinliğini araştırmak için gözlemsel bir müdahale çalışması yapılmaktadır. Hastanın over korteks dokusunun bir parçası, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için mevcuttu16,17. Çalışmanın bir parçası olarak, lenfositler veya bukkal hücreler gibi yumurtalık dışı somatik hücrelerde kromozomal anormallik taşıyan kadınlarda yumurtalık hücrelerinde kromozomal anormalliklerin olup olmadığını belirlemek için ayrışmış yumurtalık korteks dokusunun FISH'ine dayanan yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Ayrıca yumurtalık hücrelerinde anöploidinin folikülogenez üzerine etkisi de belirlenmiştir. Bu amaçla, immün sistemi baskılanmış farelerde uzun süreli ksenotransplantasyon sırasında yapay olarak indüklenen folikülogenez sonrası yumurtalık korteks dokusunun histolojik kesitlerinin analizini sağlayan yerleşik bir FISH protokolü değiştirilmiştir. Bu çalışmada, X kromozomal anomalileri olan kadınlarda aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki yumurtalık hücrelerinde X kromozomal içeriğini belirlemek için FISH'e dayalı iki yöntem sunulmuş ve bu konudaki temel bilimi geliştirmek amaçlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Asetik asit</td><td>Biosolve BV</td><td>0001070602BS</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 1200</td><td>Hettich Universal</td><td>4140</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td>Sigma</td><td>131470</td><td></td></tr><tr><td>Lamel</td><td>VWR</td><td>0631-0146</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vektör</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-513Q</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>108421</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Sigma</td><td>1159350100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMSURE</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>DM4 B bölümleri için floresan mikroskobu</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop kapsamı A1</td><td>Zeiss AXIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ayrışmış hücreler için floresan etiketli problar</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818</td><td></td></tr><tr><td>Doku kesitleri için floresan etiketli problar</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1)&nbsp; 05J10-028</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Tutkal (Fixogum)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LK071A</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>Sigma</td><td>1159380025</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon tamponu</td><td>Abott Diagnostics</td><td>32-804826/06J67-001</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon İstasyonu&nbsp;</td><td>Dako</td><td>S2451</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü işleme yazılımı bireysel yumurtalık korteks hücreleri (Cytovision 7.7)</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafin kesitlerinde görüntü işleme yazılımı&nbsp;</td><td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İmmünohitokimya mikroskobu slaytları</td><td>Dako</td><td>K802021-2</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>Lonza</td><td>12-700Q</td><td></td></tr><tr><td>Liferaz DH</td><td>Roche</td><td>05 401 151 001</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Zeiss Batı Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Merck</td><td>A335586</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Honeywell</td><td>14262-1L</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>Vectashield, Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma</td><td>7385-1L</td><td></td></tr><tr><td>Parafin</td><td>Poth Hile</td><td>2712.20.10</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P7000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11530546</td><td></td></tr><tr><td>Plastik pipet</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-4075 / 1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür ve nbsp;</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Rotasyon mikrotomu HM 355S</td><td>Termo sceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Dahlhausen</td><td>11.000.00.515</td><td></td></tr><tr><td>Ayrışmış hücrelerde BALIK için slayt</td><td>Termo bilimsel</td><td>J1810AM1JZ</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>55761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Standart Sodyum Sitrat (SSC)</td><td>Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>10515203</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop IX 70</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hedef Alma Solüsyonu &nbsp; &nbsp;</td><td>Dako</td><td>GV80511-2</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>ThermoFisher</td><td>85113</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>BOOM</td><td>760518191000</td><td></td></tr></tbody></table>

floresan in situ hibridizasyon kullanarak yumurtalık hücrelerinde x kromozomal anormalliklerinin araştırılması

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Dünya çapında milyonlarca insan doğurganlıkla ilgili sorunlarla uğraşmaktadır. Azalmış doğurganlık, hatta infertilite, kromozomal anormalliklerin en yaygın olduğu genetik bozukluklar da dahil olmak üzere birçok farklı nedenden kaynaklanabilir. Floresan in situ hibridizasyon (FISH), insanlarda kromozomal anormallikleri tespit etmek için iyi bilinen ve sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. FISH esas olarak sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerin spermatozoasındaki kromozomal anormalliklerin analizi için kullanılır. Ayrıca, bu teknik, yumurtalık disgenezine neden olduğu bilinen X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için kadınlarda da sıklıkla uygulanır. Bununla birlikte, lenfositlerde ve / veya bukkal hücrelerde X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriği hakkında bilgi hala eksiktir.
Bu çalışmanın amacı, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için FISH'e dayalı iki yöntem sunarak kadınlarda X kromozomal anormallikleri ile ilgili temel araştırmaları ilerletmektir. İlk olarak, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan aşılanmamış yumurtalık korteks dokusunda izole yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza hücreleri ve stromal hücreler) X kromozomal içeriğini belirlemek için bir yöntem tanımlanmıştır. İkinci yöntem, uzun süreli aşılamadan sonra X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan immün sistemi baskılanmış farelere yumurtalık dokusunda yeni oluşan sekonder ve antral foliküllerin yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirleyerek kromozomal anormalliklerin folikülogenez üzerindeki etkisini değerlendirmeye yöneliktir. Her iki yöntem de X kromozomal anormallikleri olan kadınların üreme potansiyeli hakkında fikir edinmek için gelecekteki araştırmalarda yardımcı olabilir.

Aşılamadan önce izole edilmiş yumurtalık hücrelerinde FISH Bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçları göstermek için 45,X/46,XX (hasta A) veya 45,X/46,XX/47,XXX (hasta B) TS'li kadınlardan kriyokorunmuş over korteks dokusu kullanıldı. Hasta A'da lenfositlerin P'sinde 45,X karyotip, P'sinde 46,XX karyotip saptandı. B hastasında lenfositlerin 8'i 45,X, ('i 46,XX ve 4'ü 47,XXX idi. Kontrol (kırmızı) olarak X kromozomu (yeşil) ve kromozom 18 için sentromere özgü problar, TS hastalarının yumurtalık kor...

Bu makalede, X kromozomal anomalileri olan kadınlardan aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki over hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için floresan in situ hibridizasyona dayalı iki yöntem sunulmaktadır.

Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanarak Yumurtalık Hücrelerinde X Kromozomal Anormalliklerinin Araştırılması

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücrelerinin FISH analizi, bu spesifik gruptaki yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriği hakkında fikir edinmek için benzersiz bir tekniktir. Bu teknikler, X kromozomal anormallikleri olan kadınlarda üreme potansiyeli hakkında daha fazla bilgi edinmek için yararlı olabilir. Her iki yöntemin de gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmayı amaçladığını ve klinik uygulamada bir teşhis aracı olarak kullanılmak üzere tasarlanmadığını belirtmek önemlidir.Prosedürü gösteren, doğurganlık laboratuvarımızdan kıdemli bir araştırmacı olan Ronald Peek ve patoloji bölümümüzden bir analist olan Milad Intezar olacaktır. Başlamak için, kriyoprezerve edilmiş veya çözülmüş yumurtalık korteks dokusunu bir neşter kullanarak birer birer milimetrelik küçük parçalara ayırın. Doku parçalarını enzimatik olarak dört litre önceden ısıtılmış L15'te 37 santigrat derecede 75 dakika boyunca sindirin.Sindirim karışımını her 15 dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin. % 10 Fetal Sığır Serumu veya FBS ile desteklenmiş dört mililitre soğuk L15 ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Ayrışmış dokuyu, 500 mikrolitre L15 ortamında tekrar askıya almadan önce 500 g'da santrifüjleme ile sekiz mililitre soğuk L15 ortamı ile bir kez yıkayın.Büyük ölçüde bireysel stromal hücreler ve küçük foliküller içeren hücre süspansiyonunu plastik bir Petri kabına aktarın ve süspansiyonu stereo mikroskop altında inceleyin. 75 mikrometrelik plastik pipet kullanarak 50 mikrometreden küçük folikülleri manuel olarak seçin ve bunları dört santigrat derecede% 10 FBS ile desteklenen L15 ortamının damlacığına aktarın. Daha sonra saflaştırılmış folikülleri% 0.06 tripsin, mililitre EDTA başına bir miligram ve mililitre glikoz başına bir miligram çözeltisine aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyondan sonra, 75 mikrometrelik plastik pipet kullanarak korteks hücre süspansiyonundan yumurtalık stromal hücreleri elde edin. Floresan In Situ Hibridizasyon veya bireysel yumurtalık hücrelerinin FISH analizi için, tedavi edilen yumurtalık foliküllerini tripsin / EDTA / glikoz veya stromal hücrelerle beş mikrolitre 0.15 milimolar potasyum klorür damlacıklarına ve bir slayt üzerinde 15 mikrolitre DPBS damlacıklarına aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin. Slaydı iki dakika boyunca 300 mikrolitre 0.05 milimolar potasyum klorür,% 7.5 asetik asit ve% 22.5 metanol içinde kurutun ve önceden sabitleyin.Fiksasyonu tamamlamak için slaytı iki dakika boyunca üçe bir metanol asetik asitle örtün. Sabitlemeden sonra, numuneyi 73 santigrat derecede taze hazırlanmış SSC'de iki kez yıkayın. 100 mikrolitre% 2 Proteinaz K ile örtün ve bir kapak kayması ile kapatın.Slaydı hibridizasyon istasyonunda 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kapak fişini çıkarın ve slaydı DPBS'de beş dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalama altında yıkayın. Numuneyi% 1 formaldehit ile beş dakika sabitleyin.Daha sonra slaydı DPBS'de yıkayın ve her biri iki dakika boyunca artan etanol konsantrasyonlarında seri olarak dehidrate edin. Numuneyi floresan olarak etiketlenmiş problarla hibridize etmeden önce havayla kurutun. Daha sonra, numuneye bir mikrolitre CEPX, bir mikrolitre CEP18 ve 18 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin ve slayta yapıştırılmış bir kapak kayması ile kapatın.Slaytı üç dakika boyunca 73 santigrat derecede denatürasyon için hibridizasyon istasyonuna aktarın, ardından 37 santigrat derecede bir gece inkübasyonu sırasında hibridizasyon yapın. Hibridizasyondan sonra, kapak kaymasını ve kalan yapıştırıcıyı slayttan çıkarın. Slaydı iki dakika boyunca 0.4X SSC,% 0.3 Ara-20'de 72 santigrat derecede yıkayın, ardından 2X SSC'de bir dakika ve % 0.1 Ara-20'de bir dakika inkübasyon yapın.Slaytı gösterildiği gibi kurutun ve DAPI içeren bir montaj ortamıyla kaplamadan önce karanlıkta havayla kurutun. Floresan mikroskobu ile analizden önce slaytı eksi 20 santigrat dereceye 10 dakika boyunca yerleştirin. Parafin kesitlerini melezleştirmek için, parafin şeridinden foliküller içeren bölümden önce veya sonra yeni bölümler seçin.Bir bölümü bir cam slayta monte edin ve 56 santigrat derecede bir ocakta 45 dakika kurutun. Bölümü 10 dakika boyunca ksilen içinde paraffinize edin, ardından slaydı% 99.5 etanol içine batırın ve beş dakika boyunca musluk suyunda durulayın. Slaytı 96 santigrat derecede 10 dakika boyunca hedef alma çözeltisiyle ön işlemden geçirin.Soğuduktan sonra, slaytı damıtılmış suda durulayın. Slaydı beş dakika boyunca 0.01 molar hidroklorik asitle tedavi edin, ardından 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca pepsin sindirimi izleyin. Slaydı tekrar hidroklorik asitte ve daha sonra PBS'de durulayın.Slaydı beş dakika boyunca %1 formaldehit PBS'de sabitleyin. Daha sonra slaytı PBS'de ve tekrar demineralize suda% 99.5 etanol içinde dehidre etmeden önce kısa bir süre durulayın. Önceden işlenmiş slayta beş mikrolitre prob CEP18 ve CEPX uygulayın.Ardından bir kapak fişi uygulayın ve alanı fotoğraf yapıştırıcı ile kapatın. Slaytı 10 dakika boyunca 80 santigrat derecede denatürasyon ve gece boyunca 37 santigrat derecede hibridizasyon için bir melezleştiriciye yerleştirin. Ertesi gün, slaytı SSC'de her biri beş dakika boyunca 42 santigrat derecede iki kez durulayın, ardından 73 santigrat derecede% 0.3 Nonidet P-40'ta iki dakika ve bir dakika durulayın.Yine, slaytı 2X SSC'de durulayın, ardından% 99.5 etanol ile kurutmadan önce damıtılmış suda durulayın. Kızağı hava ile kurutun ve DAPI içeren montaj ortamına monte edin. Hasta A'da kriyokorunmuş over korteks dokusunda lenfositlerin %50'sinde lenfosit, %45'inde X, %50'sinde 46, Hasta B'de XX.In lenfositlerin %38'inde 45, X, %28'inde 46, XX ve %34'ünde 47, XXX saptandı.Çevreleyen stromal hücreler de X kromozomal içeriği için analiz edildi. Yumurtalık korteks dokusunun enzimatik sindirimi, büyük ölçüde ayrışmış hücrelerin süspansiyonuna neden oldu, ancak tek bir granülazoz hücre tabakası ile çevrili sağlam bir oositten oluşan ilkel folikülleri bıraktı. Küçük foliküller, granülazis hücrelerinin kümelenmesi nedeniyle FISH sonrası sinyalleri yorumlamada zorluklar sağlamıştır.FISH'ten önce foliküllerin tripsin ile ek sindirimi, bireysel granülazis hücrelerinin foliküllerin yüzeyinde küresel bir morfolojiye büzülmesine neden oldu. Hematoksilin eozin boyaması, beş aylık ksenogreftlemeden sonra over korteks dokusunda morfolojik olarak normal sekonder ve antral foliküller gösterdi. Bu foliküllerin granüloz hücrelerinin X kromozomal içeriği FISH analizi ile belirlendi.Bouin çözeltisinde aşılanmış yumurtalık korteks dokusunun sabitlenmesi, yeşil bir pus nedeniyle foliküler hücrelerde bulanık ve büyük ölçüde gizlenmiş floresan sinyallerle sonuçlandı. Buna karşılık, formaldehit içine sabitlenmiş yumurtalık korteks dokusu mükemmel floresan sinyalleri sağladı. Bu protokolün ana zorluğu, yumurtalık hücrelerinin izolasyonunda ve dokunun enzimatik sindiriminde yatmaktadır.Bu protokolden sapmak, işlem sırasında önemli miktarda yumurtalık hücresi kaybına neden olabilir ve bu, özellikle düşük yumurtalık rezervine sahip kadınlarda kaçınılmalıdır. Ek gen ekspresyon profillemesi, anöploid yumurtalık hücrelerinin folikülogenez üzerindeki etkisi ve dolayısıyla X kromozomal anormallikleri olan kadınlarda erken yumurtalık yetmezliği süreci hakkında daha fazla bilgi edinmek için yararlı olabilir.

exploring-x-chromosomal-aberrations-ovarian-cells-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu video-makale, semen örneği nasıl işleneceğini, iyi kalite floresan elde etmek için adım adım...

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Chromosomics: Sayısal ve Yapısal Değişmeler Algılama Tüm 24 İnsan Kromozomlar Aynı zamanda Roman OctoChrome BALIK Test kullanma

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi...

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücre içinde kendi doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar. Burada fare embriyonik kök hücreleri X kromozomu inaktivasyon incelemek için kullanılabilir FISH vasıtasıyla RNA ve DNA birleşik, eş zamanlı olarak saptanması için bir protokol açıklar.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

İmmünofloresan ile birlikte kolayca özelleştirilebilen bir ipliğe özgü floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokolü geliştirdik. Bu, tek hücre düzeyinde kromatin yapısı, nükleer organizasyon ve transkripsiyonel düzenleme hakkında eşzamanlı bilgi ile RNA dinamiklerinin ayrıntılı bir şekilde incelenmesine olanak tanır.

Hızlı Floresan In Situ Hibridizasyon Protokolü

Mevcut protokol, toplam vücut ışınlamasına maruz kaldıktan sonra farelerin kemik iliği hücrelerindeki kromozomal stabil anormallikleri tanımlamada çoklu floresan in situ hibridizasyon (mFISH) ve spektral karyotiplemenin (SKY) yararlılığını açıklamaktadır.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Burada, multipl miyelom hastalarından alınan kemik iliği yaymalarında interfaz floresan in situ hibridizasyon tespitinin başarısını artırmak için bir protokol sunuyoruz.

İnfaz Floresan in situ Multipl Miyelomun Kemik İliği Yaymalarının Hibridizasyonu

Burada, hücrelerdeki tek sarmallı DNA seviyelerini ölçmek için immünofloresan tabanlı bir yöntem tarif ediyoruz. Bu etkili ve tekrarlanabilir yöntem, birçok yumurtalık kanserinde ortak bir özellik olan replikasyon stresini incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, bu tahlil, verimliliğini daha da artıran otomatik bir analiz boru hattı ile uyumludur.

Tek Sarmallı DNA İmmünofloresan Kullanarak Yumurtalık Kanseri Hücrelerinde Replikasyon Stresinin Ölçülmesi

Drosophila oogenezi, mitokondriyal proliferasyon ve kalıtım çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor. Bu el yazması, Drosophila yetişkin yumurtalıklarındaki replikasyon yapan mitokondriyal DNA'yı (mtDNA) 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile etiketlemek için kullanılan ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır, bu da daha önce tartışmalı olan mitokondriyal kalıtımla ilişkili mekanizmaların ortaya çıkarılmasını kolaylaştırmaktadır.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

Öğrenin, X kromozomal anormallikli kadınlarda yumurtalık hücrelerinin X kromozom içeriğini floresan in situ hibridizasyon ile analiz etme yöntemlerini. Bu teknikler üreme potansiyeli araştırmaları için temel oluşturur.

Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanarak Yumurtalık Hücrelerinde X Kromozomal Anormalliklerinin Araştırılması

Daha fazla video keşfet