Fare yumurtalık epigenomu ve transkriptomunun hücreye özgü eşleştirilmiş sorgulaması
24 Şubat 2023
Bu protokolde, çevirici ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yöntemi ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, bir Cyp17a1-Cre fare hattına geçilen NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomunun ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için optimize edilmiştir.
Bu yöntem, hücre sıralamaya gerek kalmadan nükleik asitleri belirli yumurtalık hücre popülasyonlarından aynı fareden izole etmek için bir teknik sağlar. Bu teknik, spesifik hücre popülasyonlarının çeşitli koşullar altında nasıl değiştiğini belirlemeye yardımcı olabilir. Örneğin, yaşlanma ile.
Bu tekniğin temel avantajı, hücre sıralamasına gerek kalmadan belirli bir yumurtalık hücre tipinden eşleştirilmiş epigenomik ve transkriptomik analize izin vermesidir. Bu, verimi önemli ölçüde artırır, maliyeti düşürür ve yumurtalık dokusundan hücre tipine özgü analiz yaparken özel ekipman ihtiyacını ortadan kaldırır. Burada amacımız, kadın infertilitesinin tedavisinde etkileri olan üreme yaşlanmasından önce yumurtalık yaşlanması ile ortaya çıkan hücre tipine özgü değişiklikleri tanımlamaktır.
Bu yöntem, hücre tipine özgü Cre sürücüsünün mevcut olduğu vücut sistemlerindeki herhangi bir hücre tipine uygulanabilir. Bu tekniğin en zor kısmı, ilgilendiğiniz hücre tipi için uygun bir Cre hattı seçmektir. Hücre özgüllüğünün kapsamlı bir şekilde doğrulanması önerilir.
Başlamak için, ötenazi fareden 500 mikrolitre çekirdek lizis tamponunda bir yumurtalık toplayın ve kendiliğinden açılan mikro makas kullanarak yumurtalıkları tampon içinde sekiz parçaya bölün. Kıyılmış yumurtalık ve lizis tamponunu buz üzerinde bir cam sıçrama homojenizatörüne aktarın ve yumurtalığı gevşek havaneli A.Sıçrama homojenizatörü yıkama havanesine 400 mikrolitre lizis tamponu ekleyin A.Ve ardından yumurtalığı sıkı havane B ile 10 ila 20 kez homojenize edin. Homojenatı iki mililitrelik yuvarlak bir alt tüpe aktarın ve ayrılmamış doku ve kan damarlarını çıkarmak için dört santigrat derecede 1,5 dakika boyunca 200 g'da santrifüj.
30 mikrometrelik bir hücre süzgecini 100 mikrolitre lizis tamponu ile önceden ıslattıktan sonra, süpernatantı süzgeçten 15 mililitrelik bir konik tüpe filtreleyin. Karışımı içeren çekirdekleri iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Çekirdek peletini 250 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponunda, orta ila yüksek hızda kısa bir süre vorteks yaparak yeniden askıya alın. 1,5 mililitre lizis tamponu ekleyerek hacmi 1,75 mililitreye çıkarın. Yavaşça karıştırın ve çekirdek süspansiyonunu beş dakika boyunca buz üzerinde dinlendirin.
Çekirdekleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 g'da santrifüjleme yoluyla peletleyin. Ve çekirdek topağını rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın. Çekirdek peletini tamamen yeniden askıya almak için peleti 200 mikrolitre buz soğuk depolama tamponunda ve vorteksinde kısaca askıya alın.
Askıya alınmış peletin %10'unu çıkış yönündeki analiz için giriş çekirdeği numunesi olarak ayırın. Askıya alınmış çekirdek paletini alın ve buz gibi soğuk nükleer arıtma tamponu veya NPB ile hacmi iki mililitreye çıkarın. Her numune için iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe 30 mikrolitre yeniden askıya alınmış boncuk ekleyin.
Ardından bir mililitre NPB ekleyin ve pipetleme ile iyice askıya alın. Boncukları ayırmak için tüpü manyetik rafa bir dakika boyunca yerleştirin. Süpernatantı atın ve tüpü mıknatıstan çıkarın.
Yıkanmış manyetik boncukları bir mililitre NPB'de tekrar askıya alın. Toplam üç yıkama için yıkama adımını tekrarlayın. Ve son yıkamadan sonra, boncukları NPB'nin ilk hacminde yeniden askıya alın.
Yıkanmış boncukların 30 mikrolitresini nükleer süspansiyonun iki mililitresine ekleyin ve pipetleyerek ve tüpü yavaşça ters çevirerek boncuk çekirdeği karışımını iyice askıya alın. Tüpleri soğuk bir odada veya buzdolabında düşük hızda 30 dakika boyunca dönen bir karıştırıcıya yerleştirin ve giriş örneklerini aynı koşullarda boncuksuz olarak inkübe edin. Streptavidin boncuklarına bağlı biyotinile çekirdekleri çekirdeklerin negatif fraksiyonundan ayırmak için tüpleri çekirdek süspansiyonu ve boncuklarla mıknatısın üzerine üç dakika boyunca yerleştirin.
Supernatan'ı çıkarın. Negatif fraksiyonu iki mililitrelik taze bir tüpe geçirin ve buz üzerinde saklayın. Her pozitif fraksiyon tüpü için, tüpü mıknatıstan çıkarın ve içeriği bir mililitre NPB'de yeniden askıya alın.
Tüpü mıknatısın üzerine bir dakika boyunca yerleştirin ve süpernatanı atın. Pozitif fraksiyon boncuk çekirdeği karışımını 30 mikrolitre NPB'de tekrar askıya alın. Yumurtalık ve 100 mikrolitre homojenizasyon tamponunu bir cam sıçrama homojenizatörüne aktarın ve gevşek havaneli A.A yıkama havanesine 400 mikrolitre TRAP homojenizasyon tamponu ekleyin ve homojenatı iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
Homojenizatörü ilave bir mililitre TRAP homojenizasyon tamponu ile yıkayın ve yıkanan hacmi iki mililitrelik yuvarlak alt boruya aktarın. Homojenatı 12.000 g'da dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin. Ve temizlenmiş süpernatantı yeni iki mililitrelik yuvarlak bir alt tüpe aktarın.
Pelet atıldıktan sonra, temizlenmiş homojenatın 100 mikrolitresini yeni iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın ve buz üzerine girdi olarak ayırın. Temizlenmiş homojenatın geri kalanını, bir uçtan uca karıştırıcıda dönerken, mililitre anti-GFP antikoru başına beş mikrogram ile dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Giriş örneğini aynı durumda inkübe edin.
Her numune için 50 mikrolitre protein G manyetik boncuklarını iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Boncuklara 500 mikrolitre düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve karıştırmak için yavaşça pipet yapın. Boncukları tüpün yan tarafına doğru toplamak için tüpü bir dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin.
Süpernatanı attıktan sonra, tüpü manyetik standdan çıkarın ve tüpe bir mililitre düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Karıştırmak için yavaşça pipet yapın. Yine, tüpü manyetik standın içine yerleştirin ve toplam üç yıkama için adımı tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, boncukları düşük tuzlu yıkama tamponunun ilk hacminde tekrar askıya alın. Yeniden askıya alınmış yıkanmış boncukları antijen numunesi antikor karışımına aktarın ve uçtan uca bir karıştırıcıda dönerken gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Giriş örneklerini eşdeğer koşullarda bir gecede inkübe edin.
Bundan sonra, pozitif fraksiyonu veya manyetik boncukları hedef ribozomlar RNA ile negatif fraksiyondan veya süpernatanttan manyetik standı kullanarak 2.5 ila 3 dakika ayırın. Negatif fraksiyonu aspire edin. İki mililitrelik taze bir yuvarlak alt tüpe yerleştirin ve buzun üzerine koyun.
Pozitif fraksiyonlu tüpe 500 mikrolitre yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipet yapın. Boncukları ayırmak için tüpü bir dakika boyunca buz üzerinde tutulan manyetik bir standın üzerine yerleştirin. Süpernatanı attıktan sonra, tüpü mıknatıstan çıkarın ve toplam üç yıkama için adımı tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, boncukları 3.5 mikrolitre 2-merkaptoetanol ile desteklenmiş 350 mikrolitre RNA lizis tamponunda yeniden askıya alın. Dijital bir çalkalayıcıda 900 RPM'de 10 dakika karıştırırken tüpleri oda sıcaklığında inkübe edin. Boncukları, şimdi hedef ribozomlar RNA'yı içeren çözeltiden, oda sıcaklığında bir dakika boyunca manyetik bir stand ile ayırın.
Salınan pozitif fraksiyonu taze 1,5 mililitrelik bir tüpte toplayın. İmmünofloresan görüntüleme, Cyp17-Cre pozitif NuTRAP floks ve Cyp17-Cre negatif NuTRAP floks farelerin parafinize yumurtalıklarında yapıldı. EGFP proteini keçi anti-GFP primer antikoru ve Alexa 488 eşek anti-keçi sekonder antikoru kullanılarak boyandı ve çekirdekler DAPI ile boyandı.
Görüntüler floresan mikroskobunda 20x büyütmede çekildi. Giriş ve TRAP pozitif fraksiyon RNA'sı, Cyp17-Cre pozitif NuTRAP floks fare yumurtalıklarından izole edildi ve eşleştirilmiş bir son şekilde sıralandı. İfade edilen tüm genlerin ana bileşen analizi, ilk bileşendeki TRAP girişinin ve pozitif fraksiyonların ayrıldığını gösterdi.
Giriş ve pozitif fraksiyonlar arasındaki farklı şekilde eksprese edilen genlerin volkan grafiği burada gösterilmiştir. TRAP pozitif fraksiyonunun girdi ile karşılaştırılması, stroma / theca hücre belirteci genlerinin genel olarak zenginleşmesini ve TRAP pozitif fraksiyonundaki oosit, granüloza, immün ve düz kas hücresi belirteci genlerinin tükenmesini göstermiştir. Ayrışmamış kan damarlarını çıkarmak için nükleer süspansiyonun ilk santrifüjlenmesinden sonra, çekirdekler süpernatanttadır.
Süpernatantı tuttuğunuzdan ve peleti bu noktada attığınızdan emin olun. Bozulmamış yöntemi takiben, kromatin erişilebilirliği veya diğerleri arasında DNA modifikasyonları için testler de dahil olmak üzere çeşitli epigenomik teknikler uygulanabilir. TRAP yöntemini takiben, translatomu değerlendirmek için RT-qCPR veya RNA dizilimi yapılabilir.
Bu, NuTRAP yönteminin fare yumurtalıklarındaki ilk uygulamasıdır. Bu, yumurtalık yaşlanmasını veya kanserini incelemek için kullanılabilecek spesifik yumurtalık hücre tiplerinden yüksek verimli epigenomik ve transkriptomik analizlere izin verir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bir fare modelinde ovaryum transkriptomunun ve epigenomunun eşli sorgulanması için çeviri yapan ribozom afinite saflaştırma (TRAP) ve belirli hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemlerini optimize etmektedir. Bu yaklaşım, hücre ayırma işlemine gerek kalmadan belirli ovaryum hücre popülasyonlarının analiz edilmesine olanak tanıyarak, yaşlanma ile ilişkili hücre tipine özgü değişikliklerin anlaşılmasını kolaylaştırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre tipine özgü analiz
- Over yaşlanması
- Transkriptomik ve epigenomik inceleme
Arka Plan
- Yumurtalık yaşlanmasını anlamak, kadın infertilitesinin ele alınması için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler genellikle hücre ayıklama gerektirir ve bu durum işlem kapasitesini sınırlayabilir.
- Bu teknik, aynı fareden alınan yumurtalıkları analiz etmek için optimize edilmiş bir yol sunar.
Kullanılan Yöntemler
- Optimize edilmiş TRAP ve INTACT yöntemleri
- Cyp17a1-Cre hattı ile çaprazlanmış NuTRAP fare modeli
- Tek yumurtalık toplama ve nükleer izolasyon için spesifik protokoller
Temel Sonuçlar
- Transkriptomik ve epigenomik verilerin eşleştirilmiş analizini mümkün kılmıştır.
- Yumurtalıklarda yaşlanma ile ilgili hücre tipine özgü değişiklikleri ortaya çıkarmıştır.
- Bu yöntemin çeşitli hücre tipleri genelinde daha geniş uygulama potansiyelini doğrulamıştır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, spesifik over hücresi popülasyonlarından nükleik asitlerin izolasyonunda etkinlik göstermektedir.
- Bu yaklaşım, kadın üreme sağlığına odaklanan çalışmalar için önemli çıkarımlara sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Hücre tipi çözünürlüğünde yumurtalık epigenomunun ve transkriptomunun eş zamanlı sorgulanması, yumurtalık yaşlanması ve hastalıklarının mekanizmalarının anlaşılmasındaki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. TRAP ve INTACT yöntemlerinden yararlanan NuTRAP modeli, hücre ayıklamaya gerek kalmadan yüksek kapasiteli, hücreye özgü nükleik asit profillemesi sağlayarak hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltmada öngörüsel güvenilirliği destekler. Bu yetenek, reprodüktif biyoloji ve translasyonel biyobelirteç keşfindeki portföy kararlarıyla doğrudan ilgilidir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Yumurtalık yaşlanması ve hastalıklarının temelinde yatan hücre tipine özgü moleküler değişimlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Belirli hücre popülasyonlarındaki epigenomik ve transkriptomik durumları birbirine bağlayarak fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Stromal hücrelerin yumurtalık fenotiplerine katkılarını izole ederek mekanistik risk azaltımını kolaylaştırır.
- Reprodüktif senesansla ilişkili hedeflerin geliştirilmesinde öngörü güvenini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Ardışık sekanslama ve moleküler analizler için valide edilmiş, hücreye özgü nükleik asit örnekleri sağlar.
- Hücre ayıklama ihtiyacını ortadan kaldırarak işlem hacmini artırır ve operasyonel karmaşıklığı azaltır.
- Kantitatif transkriptomik ve epigenomik okumalar için biyolojik materyalin tekrarlanabilir şekilde hazırlanmasına olanak tanır.
- Cre sürücü hatları kullanarak yumurtalık hücre tipleri genelinde analiz standardizasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel biyobelirteç geliştirme için moleküler profillemeyi hastalıkla ilişkili over hücresi popülasyonlarıyla hizalar.
- Hücre tipi çözünürlüklü moleküler analizi destekleyerek, keşiften preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Over yaşlanması ve infertiliteye olan hücreye özgü katkıları netleştirerek translasyonel hipotezlerin riskini azaltır.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu yöntem, tek bir yumurtalıktan hücre tipine özgü moleküler profilleme imkanı sağlayarak, hem erken keşif hem de translasyonel araştırma iş akışlarını desteklemekte ve böylece keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe entegre olmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Over yaşlanması ve hastalık modellerinde hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını kolaylaştırır.
- Tarama: İleriki sekanslama ve moleküler analizler için tekrarlanabilir, kantitatif nükleik asit örnekleri sağlar.
- Analitik: Hücre popülasyonlarının sağlam istatistiksel karşılaştırması için eşleştirilmiş transkriptomik ve epigenomik veriler sunar.
- Translasyonel Araştırma: Üreme biyolojisinde biyobelirteç hizalamasını ve hastalıkla ilişkili model validasyonunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Mevcut bir Cre sürücüsüne sahip herhangi bir hücre tipine uyarlanabilir ve araştırma programları genelinde geniş uygulama imkanı sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücre tipine özgü çalışmalarda öngörü güvenilirliğini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Hücre ayırma işlemini ortadan kaldırarak iş akışlarını kolaylaştırır, işlem kapasitesini ve tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Yüksek içerikli, hücreye özgü moleküler analizlere olanak sağlayarak devam/durdur kararlarını ve sermaye verimliliğini geliştirir.
- Portföy Etkisi: Over ve üreme araştırmalarında hedeflerin ve modellerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Cre-lox genetiği konusunda uzmanlık ve hücre tipi spesifitesinin doğrulanması gereklidir.
- Standart moleküler biyoloji enstrümantasyonuna ve sekanslama altyapısına erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilirlik ve veri karşılaştırılabilirliği için ekipler arası titiz bir standardizasyon gereklidir.
- Hedeflenen hücre popülasyonları için mevcut Cre sürücü hatları olan model sistemlere uyarlanabilir.
- İlgilenilen hücre tipi için uygun Cre hatlarının mevcudiyetine ve doğrulanmasına bağlıdır.
