Name: Poli-Transfeksiyonlu Hücre Durumu Tanımlama Devrelerinin Hızlı Gelişimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Öğrenin, poli-transfeksiyon yöntemiyle memeli hücrelerinde çoklu genetik devre bileşenlerinin davranışlarını tek bir kuyucukta nasıl karakterize edebilirsiniz. Bu yöntem, sentetik biyolojide devre tasarımını hızlandırır ve akış sitometrisiyle çıktı ölçümü sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Poli-transfeksiyon yönteminin geliştirilmesine ve hücre sınıflandırıcılarına uygulanmasına öncülük eden veya katkıda bulunan eski Weiss Lab üyelerine teşekkür etmek isteriz: Jeremy Gam, Bre DiAndreth ve Jin Huh; Daha fazla yöntem geliştirme/optimizasyona katkıda bulunan diğer Weiss laboratuvar üyeleri: Wenlong Xu, Lei Wang ve Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard ve Patrick Donahue ve Hailey Edelstein da dahil olmak üzere grup üyeleri, çoklu transfeksiyonu test etmek ve geri bildirim sağlamak için; ve Prof. Nika Shakiba bu makaleyi davet ettiği ve geri bildirimde bulunduğu için. Ulusal Sağlık Enstitüleri'ne [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] de teşekkür ederiz; Ulusal Bilim Vakfı [1745645]; Bu çalışmayı finanse etmek için NCI'den Kanser Merkezi Desteği (çekirdek) Hibe [P30CCA14051, kısmen] ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [P50GM098792].

NOT: Tablo 1 ve Tablo 2 bu protokol için önemli referanslar olarak hizmet vermektedir. Tablo 1 , reaksiyonlar için reaktif ölçeklemesini gösterir ve Tablo 2 , protokolde (üst yarı) açıklanan örnek bir poli-transfeksiyon ve olası bir takip deneyi (alt yarı) için DNA oranı aritmetiğini gösterir.
1. Hücrelerin transfeksiyon için hazırlanması
<ol><li>Protokolü başlatmadan önce insan embriyonik böbrek (HEK293) hücrelerinin kültürünün% 60 -% 80 oranında akıcı olduğundan emin olun. Bunu yapmak için, 2 gün önce 100 mm x 15 mm doku kültürü Petri kabında 1 x 106 hücre tohumlayın ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Protokolümüz HEK293 hücrelerine odaklansa da, diğer hücre tipleri ikame edilebilir.</li>
	<li>Ortamı ve hücreleri aşağıda açıklandığı gibi transfeksiyonlar için hazırlayın.<ol><li>Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) çözeltisinin en az 20 mL'sini% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA; bakınız Malzeme Tablosu) ile 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın. En az 2.4 mL Tripsin ve 2.4 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın. Ön ısıtma serum ortamını ~ 16 ° C'ye düşürdü. NOT: Tüm doku kültürü çalışmaları bir biyogüvenlik kabininde özenle yapılmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>DMEM çözeltisindeki hücreleri aşağıda açıklandığı gibi yeniden askıya alın.<ol><li>Mevcut medyayı aspire edin ve elden çıkarın. Hücreleri yıkamak için HEK293 hücre kültürüne 2 mL PBS dağıtın. PBS'yi aspire edin ve bertaraf edin.</li>
		<li>HEK293 hücre kültürüne 2 mL Tripsin dağıtın. Petri kabını 37 ° C'de bir inkübatöre 3 dakika boyunca veya hücreler artık yemeğe yapışmayana kadar yerleştirin. Çanağı biyogüvenlik kabinine geri koyun ve plakaya 8 mL DMEM çözeltisi dağıtarak hücre çözeltisini seyreltin.</li>
		<li>Çözeltiyi birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Tüm medyayı aspire edin ve 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri pelet haline getirmek için 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Medyayı aspire edin (hücreleri aspire etmemeye özen göstererek) ve atın. Hücreleri 5 mL DMEM çözeltisi içinde tekrar askıya alın, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.</li>
	<li>Otomatik bir hücre sayacı kullanarak geçerli hücre konsantrasyonunu tahmin edin ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir). Altı kuyucuğu (bu örnekte) 1 x 105 hücreli 24 delikli bir plakaya (50.000 hücre/cm2 tohumlama yoğunluğu için) tohumlayın.</li>
	<li>DMEM çözeltisini 500 μL'ye kadar ekleyin (önce kuyucuklara DMEM çözeltisi ekleyin) ve ardından işlem başına bir kuyucuğu aşağıdaki gibi etiketleyin: renk kontrolü yok, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, NeonGreen kontrolü, tüm renk kontrolü ve çoklu transfeksiyon 1. TagBFP, mKO2 ve NeonGreen kontrol kuyuları, poli-transfeksiyona dahil olan tüm floresan proteinleri için tek renkli kontrollerdir.</li>
</ol>2. Transfeksiyon yapılması
<ol><li>Her DNA agregası için tüpler hazırlayın. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini bir kenara bırakın ve tüpleri şu şekilde etiketleyin: renk kontrolü yok, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, NeonGreen kontrolü, tüm renk kontrolü, çoklu transfeksiyon karışımı 1 ve poli-transfeksiyon karışımı 2.<ol><li>Renk kontrolü, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, NeonGreen kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerine 36 μL azaltılmış serum ortamı ekleyin. Poli-transfeksiyon karışımı 1 ve poli-transfeksiyon karışımı 2 tüplerinin her birine 18 μL indirgenmiş serum ortamı ekleyin. NOT: Plazmid konsantrasyonlarının 150 ng/μL olduğu varsayılmaktadır.</li>
		<li>Renk kontrol tüpüne 600 ng dolgu plazmidi ekleyin. mKO2 renk kontrol tüpüne 300 ng mKO2 ve 300 ng dolgu plazmidi ekleyin. TagBFP renk kontrol tüpüne 300 ng TagBFP ve 300 ng dolgu plazmidi ekleyin.</li>
		<li>NeonGreen renk kontrol tüpüne 300 ng yapısal NeonGreen plazmid ve 300 ng dolgu plazmidi ekleyin. Tüm renk kontrol tüpüne mKO2, TagBFP ve kurucu NeonGreen'in her biri 100 ng ve ayrıca 300 ng dolgu plazmidi ekleyin.</li>
		<li>Poli-transfeksiyon karışımı 1 tüpüne 150 ng mKO2 ekleyin. Poli-transfeksiyon karışımı 1 tüpüne 75 ng muhabir NeonGreen plazmid ve 75 ng dolgu plazmidi ekleyin.</li>
		<li>Poli-transfeksiyon karışımı 2 tüpüne 150 ng TagBFP ekleyin. Poli-transfeksiyon karışımı 2 tüpüne 75 ng L7ae plazmid ve 75 ng dolgu plazmidi ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>216 μL indirgenmiş serum ortamını 9,48 μL transfeksiyon reaktifi ile birleştirerek 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde transfeksiyon ana karışımını oluşturun (reaktif oranları ve reaksiyon ölçeklemesi için Tablo 1'e bakınız). Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın ve bir kenara koyun.</li>
	<li>Renk kontrolü, tek renk kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerinin her birine 1,58 μL arttırıcı reaktif ekleyin. Poli-transfeksiyon karışım tüplerinin her birine 79 μL arttırıcı reaktif ekleyin. Pipetleyerek her tüpü ayrı ayrı karıştırın.</li>
	<li>Transfeksiyon ana karışımını DNA içeren her tüpe ekleyin.<ol><li>Renk kontrolü olmayan, tek renk kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerinin her birine 37,58 μL transfeksiyon ana karışımı ekleyin. Pipetleyerek her tüpü ayrı ayrı karıştırın.</li>
		<li>Poli-transfeksiyon karışım tüplerinin her birine 18.79 μL transfeksiyon ana karışımı ekleyin. Pipetleyerek her tüpü ayrı ayrı karıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfeksiyon karışımlarını kuyucuklara dağıtın.<ol><li>Pipet, renksiz, tek renk ve tüm renk kontrolleri için her transfeksiyonun 65,97 μL'sini ilgili kuyucuklara karıştırır.</li>
		<li>Poli-transfeksiyonun 32.98 μL'lik pipeti, 1'i poli-transfeksiyon kuyusuna karıştırın ve kompleksleri etkili bir şekilde dağıtmak için plakayı düz bir yüzey boyunca sıkı bir şekilli sekiz şekilli desende hızlı ama nazikçe döndürün. Daha sonra, poli-transfeksiyonun 32.98 μL'lik pipeti, 2'yi aynı poli-transfeksiyon kuyusuna karıştırır ve plakayı aynı şekilde döndürür.</li>
	</ol></li>
	<li>Plakayı 37 ° C'de,% 5 CO2 ile ve sallamadan, 48 saatlik bir süre boyunca bir inkübatöre yerleştirin. NOT: Hücre canlılığını arttırmak için, hücre ortamı transfeksiyondan sonra her 6 saatte bir değiştirilebilir (bu her zaman gerekli olmasa da ve HEK293 hücreleri ve türevleri ile, ortamı değiştirirken hücreleri plakadan ayırmamaya dikkat edilmelidir).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td colspan="3">Miktar</td>
			<td colspan="3">Ölçekleme</td>
		</tr><tr><td>DNA karışımı için azaltılmış serum ortamı</td>
			<td colspan="3">Kontrol tüpü başına 36 μL, poli-transfeksiyon tüpü başına 18 μL</td>
			<td colspan="3">0,05 μL Pipetlemeyi hesaba katmak için %10-20 ekstra hacimle tüp başına azaltılmış serum ortam/ng DNA'sı</td>
		</tr><tr><td>DNA</td>
			<td colspan="3">Tüp başına 300-600 ng</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>P3000</td>
			<td colspan="3">Kontrol tüpü başına 1.58 μL, poli-transfeksiyon tüpü başına 0.79 μL</td>
			<td colspan="3">Tüp başına 0,0022 μL P3000/ng DNA, %10-20 ekstra</td>
		</tr><tr><td>Lipo master mix için azaltılmış serum ortamı</td>
			<td colspan="3">Kontrol tüpü başına 36 μL, poli-transfeksiyon tüpü başına 18 μL</td>
			<td colspan="3">0,05 μL, serum ortam/ng toplam DNA'sını azalttı ve pipetlemeyi hesaba katmak için %10-20 ekstra hacim sağladı</td>
		</tr><tr><td>Transfeksiyon ve arttırıcı reaktif</td>
			<td colspan="3">Kontrol tüpü başına 1.58 μL, poli-transfeksiyon tüpü başına 0.79 μL</td>
			<td colspan="3">0.0022 μL Lipofectamine 3000/ng DNA, %10-20 ekstra ile</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Transfeksiyonlar için reaktif ölçekleme. Tablo, tek bir kuyucukta bulunan DNA miktarı için dahil edilecek reaktifin doğru oranını göstermektedir. Bu, reaksiyonları etkili bir şekilde ölçeklendirmek ve ana karışımlar oluşturmak için kullanılabilir. Reaktif miktarları% 20'lik bir fazlalık içerecek şekilde ölçeklendirilmiştir.
3. Hücrelerin akış sitometrisi için hazırlanması
<ol><li>DMEM çözeltisinin en az 4,2 mL'sini önceden 37 °C'ye ısıtın. En az 4.2 mL Tripsin ve 4.2 mL PBS'yi 37 °C'ye kadar önceden ısıtın. Floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) tampon çözeltisini kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de tutun.</li>
	<li>Topaklanmayı azaltmak için FACS tampon çözeltisindeki hücreleri (PBS% 1 BSA, 5 mM etilendiamintetraasetik asit [EDTA] ve% 0.1 sodyum azid [NaN3] ile desteklenmiş; Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden askıya alın.<ol><li>Mevcut medyayı her bir kuyucuğa aspire edin ve bertaraf edin. Hücreleri yıkamak için her bir kuyucuğa 5 mL PBS dağıtın. PBS'yi aspire edin ve bertaraf edin.</li>
		<li>Her bir kuyucuğa 5 mL Tripsin dağıtın. Plakayı 3 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin veya hücreler artık yemeğe yapışmayana kadar. Plakayı biyogüvenlik kabinine geri koyun ve her bir kuyucuğa 5 mL DMEM çözeltisi dağıtarak hücre çözeltilerini seyreltin.</li>
		<li>Her bir kuyucuk için, çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek karıştırın. Her kuyu için, tüm medyayı aspire edin ve 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri pelet haline getirmek için 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Medyayı aspire edin, hücreleri aspire etmemeye ve atmamaya özen gösterin. Her tüpte, hücreleri 5 mL FACS tampon çözeltisi içinde yeniden askıya alın, yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.</li>
	<li>Her hücre süspansiyon çözeltisini bir süzgeçten geçirin (kümeleri çıkarmak için) ayrı akış sitometrisi konik tüplerine geçirin. Bu tüpleri buz üzerinde en fazla 1 saat tutun ve mümkün olan en kısa sürede akış sitometrisi yapın.</li>
</ol>4. Akış sitometrisinin yapılması
NOT: Bir akış sitometresinin çalıştırılması, gerekli görevler hakkında uygun eğitim ve bilgi gerektirir. Yazılım ve ekipman değişiklik gösterebileceğinden ve kullanıcıların genel olarak eğitilmesi gerektiğinden, bu bölüm gerçekleştirilmesi yararlı olan belirli işlemleri ifade eder.
<ol><li>İlk olarak, hücre özelliklerini seçmek ve anormalliklerden (agregalar, döküntüler vb. Dahil) kaçınmak için dolgu plazmid kontrolü (renk kontrolü yok) ile transfekte edilen hücreleri inceleyin. Hücreleri ayırt etmek için birçok parametre kombinasyonu olsa da, ayırt edici özellikleri görselleştirmek için iyi bir yol olarak aşağıdaki üç genel seçeneği kullanın.<ol><li>İleri saçılma alanına (doğrusal ölçek) karşı yan saçılma alanına (tercih/hücre tipi başına log veya doğrusal ölçek) bakın.</li>
		<li>Yan saçılma yüksekliğine (günlük ölçeği) ve yan saçılma genişliğine (doğrusal ölçek) bakın.</li>
		<li>İleri saçılma genişliğine (doğrusal ölçek) karşı ileri saçılma yüksekliğine (doğrusal ölçek) bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Ardından, tek renk denetimlerine bakın. Cihaz voltajlarını ayarlamak için tüm renk kontrolünü kullanın, böylece her floresan proteininden gelen sinyaller eşdeğer rastgele floresan birimlerine (a.u.) normalleştirilir. Ardından, kompanzasyon matrisini ayarlamak için kullanılan her floresan proteini için tek renk kontrollerini çalıştırın ve bu da taşma düzeltmesine izin verir. NOT: İdeal olarak, floresan değerlerinin tam dinamik aralığı görünür olmalıdır. Floresan protein sinyallerinin daha da normalleştirilmesi, standartlaştırılmış birimlere (örneğin, eşdeğer floresein molekülleri [MEFL'ler; bakınız Beal ve ark.15]) dönüştürülerek yapılabilir. Analiz sırasında MEFL dönüşümünü etkinleştirmek için gökkuşağı kalibrasyon boncuklarını çalıştırın. Bu kalibrasyon aynı zamanda cihazdan cihaza ve günlük sinyal değişimini azaltmak için de yararlıdır16.</li>
	<li>Poli-transfeksiyon numune tüpünü çalıştırın. NOT: Mümkün olduğunda, 1.000 x 10^ (^ = karışımlar) hücrelerin çalıştırılması önerilir, çünkü daha yüksek boyutlu çoklu transfeksiyonların analiz sırasında daha fazla kutuya bölünmesi gerekir ve her bölmenin istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar yapmak için yeterli hücreye (ideal olarak >10) ihtiyacı vardır.</li>
</ol>5. Deney sonrası analiz gerçekleştirme
<ol><li>Başlangıçta, doğru sonuçlar elde etmek için kontrollerden (ve varsa boncuklardan) gelen verileri kullanın. Canlı hücre geçidi (yukarıda özetlenen kapıları kullanarak), telafi ve otomatik floresan düzeltmesi gerçekleştirmek için mevcut yazılım araçlarından birini kullanın. NOT: Genellikle hem grafiksel bir kullanıcı arayüzüne hem de ön işleme aşaması ve çoklu transfeksiyon analizi için uygun bir python kütüphanesine sahip özel MATLAB kodunu (örneğin, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis veya Cytoflow17) kullanırız.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Yöntem</td>
			<td>Karmaşık</td>
			<td>ng Floresan Marker</td>
			<td>ng L7ae (fraksiyon)</td>
			<td>ng Reporter (kesir)</td>
			<td>ng Dolgu DNA'sı (fraksiyon)</td>
			<td>Toplam (ng)</td>
		</tr><tr><td>Poli-transfeksiyon 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>Poli-transfeksiyon 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>25 (1/6)</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>25(1/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Protokolde gösterilen poli-transfeksiyon için DNA miktarları ve ayarlanmış plazmid oranları ile örnek bir takip deneyi. Tablonun üst yarısı, basit bir poli-transfeksiyon deneyinde kullanılan plazmidlerin bileşimini göstermektedir. Alt yarı, plazmid oranlarını, gen ekspresyon modülatörünün muhabirine göre daha optimal bir 1: 5 oranında olduğu varsayımsal bir konsantrasyon alanını daha iyi alt örneklemek için ayarlayan güncellenmiş bir deneyin bileşimini gösterir ve bu oran etrafında örneklemek için daha fazla transfekte hücre verir.

<ol><li>Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+circuits+and+cellular+decision-making+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).</li>
<li>Sayeg, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+designed+microRNA-based+genetic+classifiers+target+specific+neurons+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).</li>
<li>Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Input+RNAi-based+logic+circuit+for+identification+of+specific+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.</a> Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).</li>
<li>Nissim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+RNA-based+immunomodulatory+gene+circuits+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy.</a> Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).</li>
<li>Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+dual-promoter+integrator+for+targeting+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells.</a> Molecular Systems Biology. 6, 444(2010).</li>
<li>Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+regulatory+effect+size+of+cis-acting+genetic+variation+using+allelic+fold+change%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change.</a> Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).</li>
<li>Prochazka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete-to-analog+signal+pluripotent+stem+cells+conversion+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modularity%2C+context-dependence%2C+and+insulation+in+engineered+biological+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits.</a> Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).</li>
<li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design%3A+Engineering+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li>
<li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%27poly-transfection%27+method+for+rapid%2C+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+tunable+signal+processing+in+mammalian+cells+via+engineered+covalent+modification+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles.</a> Nature Communications. 13 (1), 1720(2022).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).</li>
<li>DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERSIST+platform+provides+programmable+RNA+regulation+using+CRISPR+endoRNases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases.</a> Nature Communications. 13 (1), 2582(2022).</li>
<li>Frei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+mitigation+of+gene+expression+burden+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 4641(2020).</li>
<li>Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+fast%2C+high-precision+characterization+of+synthetic+biology+devices.+Computer+Science+and+Artificial+Intelligence+Laboratory+Technical+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Massachusetts+institute+of+technology%22%5BJournal%5D)">A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report.</a> Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).</li>
<li>Beal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+measurement+precision+requirements+for+effective+engineering+of+genetic+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).</li>
<li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoflow%3A+A+Python+toolbox+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+gene+expression+with+synthetic+upstream+open+reading+frames%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).</li>
<li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 818(2019).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li>
<li>Wroblewska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+synthetic+circuits+with+RNA+binding+proteins+for+RNA-only+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).</li>
<li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).</li>
<li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mining+of+prokaryotic+repressors+for+orthogonal+logic+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li>
</ol>

R.W., Strand Therapeutics ve Replay Bio'nun kurucu ortaklarındandır; R.W. ve R.J., hücre tipi sınıflandırıcı ile ilgili geçici bir patent başvurusunda bulundu.

Bilgisayar destekli tasarım (CAD), breadboard ve 3D baskı gibi hızlı prototipleme yöntemleri mekanik, elektrik ve inşaat mühendisliği disiplinlerinde devrim yarattı. Belirli bir zorluğa yönelik birçok olası çözümü hızlı bir şekilde arama yeteneği, bir alandaki ilerlemeyi büyük ölçüde hızlandırır. Poli-transfeksiyonun, genetik devrelerin hızlı prototiplenmesini sağlayan biyolojik mühendislik için benzer bir teknoloji olduğuna inanıyoruz. Ek olarak, diğer hızlı prototipleme teknolojileri, birden fazla olası çözümün uygulam...

Memeli sentetik biyolojisi alanı, kültürlenmiş hücre hatlarında basit duyu ve tepki parçaları geliştirmekten, teşhis ve terapötiklerdeki gerçek dünyadaki zorlukları ele almak için karmaşık gen ağlarının optimizasyonuna kadar hızla ilerlemiştir1. Bu sofistike devreler, mikroRNA profillerinden sitokinlere ve küçük moleküllü ilaçlara kadar biyolojik girdileri algılayabilir ve transistörler, bant geçiş filtreleri, geçiş anahtarları ve osilatörler dahil olmak üzere mantık işleme devrelerini uygulayabilir. Ayrıca kanser, artrit, diyabetve daha birçok 1,2,3,4,5 gibi hastalıkların hayvan modellerinde umut verici sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, bir devrenin karmaşıklığı arttıkça, bileşenlerinin her birinin seviyelerini optimize etmek giderek daha zor hale gelir.
Özellikle yararlı bir genetik devre türü, hücresel durumları algılamak ve bunlara yanıt vermek için programlanabilen bir hücre sınıflandırıcıdır. Belirli hücresel durumlarda protein veya RNA çıktılarının seçici üretimi, hücrelerin ve organoidlerin farklılaşmasını yönlendirmek ve programlamak, hastalıklı hücreleri ve / veya istenmeyen hücre tiplerini tanımlamak ve yok etmek ve terapötik hücrelerin işlevini düzenlemek için güçlü bir araçtır 1,2,3,4,5 . Bununla birlikte, memeli hücrelerinde, hücre durumlarını çoklu hücresel RNA ve / veya protein türlerinden doğru bir şekilde sınıflandırabilen devreler oluşturmak oldukça zor olmuştur.
Bir hücre sınıflandırma devresi geliştirmenin en çok zaman alan adımlarından biri, devre içindeki sensörler ve işleme faktörleri gibi bireysel bileşen genlerinin göreceli ekspresyon seviyelerini optimize etmektir. Devre optimizasyonunu hızlandırmak ve daha sofistike devrelerin inşasına izin vermek için, son çalışmalar optimal kompozisyonları ve topolojileri tahmin etmek için hücre sınıflandırıcı devrelerinin ve bileşenlerinin matematiksel modellemesini kullanmıştır 6,7. Bu şimdiye kadar güçlü sonuçlar göstermiş olsa da, matematiksel analiz, devredeki bileşen genlerinin giriş-çıkış davranışını sistematik olarak karakterize etme ihtiyacı ile sınırlıdır ve bu da zaman alıcıdır. Ayrıca, karmaşık genetik devrelerde bağlama bağlı sayısız problem ortaya çıkabilir ve bu da tam bir devrenin davranışının bireysel parça karakterizasyonlarına dayanan tahminlere meydan okumasına neden olabilir 8,9.
Hücre durumu sınıflandırıcıları gibi karmaşık memeli devrelerini daha hızlı geliştirmek ve test etmek için laboratuvarımız, plazmid ko-transfeksiyon protokollerinin bir evrimi olan poli-transfeksiyon10 adı verilen bir teknik geliştirdi. Ko-transfeksiyonda, çoklu plazmid DNA türleri, pozitif yüklü bir lipit veya polimer reaktifi ile birlikte kompleksleştirilir, daha sonra hücrelere korelasyonlu bir şekilde verilir (Şekil 1A). Poli-transfeksiyonda, plazmidler reaktif ile ayrı ayrı komplekslenir, böylece her transfeksiyon kompleksinden gelen DNA, hücrelere ilişkisiz bir şekilde iletilir (Şekil 1B). Bu yöntemi kullanarak, transfekte popülasyondaki hücreler, farklı devre bileşenleri taşıyan iki veya daha fazla DNA yükünün oranlarının sayısız kombinasyonuna maruz kalır.
Her hücreye verilen devre bileşenlerinin oranlarını ölçmek için, bir poli-transfeksiyon içindeki her transfeksiyon kompleksi, kompleksin hücresel alımı için bir vekil görevi gören yapısal olarak ifade edilen bir floresan muhabiri içerir. Bir memeli hücresi içinde aktif olan herhangi bir element içermeyen dolgu DNA'sı, tek bir transfeksiyon kompleksinde bir hücreye verilen floresan muhabirin ve devre bileşenlerinin nispi miktarını ayarlamak için kullanılır ve tartışmada daha ayrıntılı olarak tartışılır. Weiss laboratuvarında kullanılan dolgu DNA'sının bir örneği, bir sonlandırıcı dizisi içeren, ancak promotor, kodlama dizisi vb. İçermeyen bir plazmiddir. Farklı devre bileşenleri oranlarına sahip hücreler daha sonra gen devresi fonksiyonu için en uygun oranları bulmak için karşılaştırılabilir. Bu da, devre bileşenlerini genetik entegrasyon için tek bir vektörde (örneğin, bir lentivirüs, transpozon veya iniş pedi) birleştirirken optimum gen ekspresyon seviyelerine ulaşmak için promotörleri ve diğer devre elemanlarını seçmek için yararlı tahminler verir. Bu nedenle, sezgiye dayalı olarak veya zaman alıcı bir deneme yanılma süreci yoluyla devre bileşenleri arasındaki oranları seçmek yerine, poli-transfeksiyon, tek hazneli bir reaksiyonda genetik parçalar arasındaki çok çeşitli stokiyometrileri değerlendirir.
Laboratuvarımızda çoklu transfeksiyon, hücre sınıflandırıcıları, geri besleme ve besleme kontrolörleri ve iki kararlı motifler dahil olmak üzere birçok genetik devrenin optimizasyonunu sağlamıştır. Bu basit ama güçlü yöntem, memeli hücrelerindeki karmaşık genetik devreler için tasarım döngülerini önemli ölçüde hızlandırır. Poli-transfeksiyon o zamandan beri çok boyutlu giriş-çıkış transfer fonksiyonlarını yüksek çözünürlükte10'da ortaya çıkarmak, hücre durumu sınıflandırması 11 için alternatif bir devre topolojisini optimize etmek ve çeşitli yayınlanmış12,13 ve devam eden projeleri hızlandırmak için birkaç genetik devreyi karakterize etmek için kullanılmıştır.
Burada, bir genetik devreyi hızlı bir şekilde optimize etmek için çoklu transfeksiyon kullanma iş akışını açıklıyor ve tasvir ediyoruz (Şekil 2). Protokol, yüksek kaliteli poli-transfeksiyon verilerinin nasıl oluşturulacağını ve poli-transfeksiyon protokolünde ve veri analizinde birkaç yaygın hatadan nasıl kaçınılacağını göstermektedir (Şekil 3). Daha sonra, basit devre bileşenlerini karakterize etmek için poli-transfeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterir ve bu süreçte, poli-transfeksiyon sonuçlarını ko-transfeksiyona karşı karşılaştırır (Şekil 4). Son olarak, poli-transfeksiyon sonuçları kanser sınıflandırıcı devresinin optimizasyonunu göstermektedir (Şekil 5).

<table><tbody><tr><td>15 mL Corning Falcon konik tüpler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu petri kabı</td><td>Tercih</td><td></td> edilen herhangi bir şirket <td>(Pirojenik olmayan, Steril, RNase, DNaz, DNA ve Pirojen İçermez)</td></tr> <tr><td>Sığır serum albümini</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Tercih</td><td></td> edilen herhangi bir şirket <td>15 mL Falcon tüplerini 300 rcf'ye</td></tr> <tr><td>maruz bırakabilirKontes 3 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflow</td><td>Ticari olmayan yazılım paketi</td><td></td><td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>Hücre tipiniz için doğru ortamı kullanın</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>HEK hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Deneyleriniz için ilgili hücre tipini kullanın. HEK hücreleri çok verimli bir şekilde transfekte etme eğilimindedir.</td></tr><tr><td>HeLa hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-12401</td><td>Deneyleriniz için ilgili hücre tipini kullanın.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 ve P3000 arttırıcı</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>L3000001</td><td>Hücre tipiniz için doğru reaktifi kullanın; Transfeksiyon ve Arttırıcı Reaktif</td></tr><tr><td>LSRFortessa akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri, 1.5 mL</td><td>Tercih</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>edilen herhangi bir şirketOpti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>azaltılmış serum ortamı</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Gökkuşağı kalibrasyon boncukları</td><td>Spherotech</td><td>URCP-100-2H</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>VWR</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

poli-transfeksiyonlu hücre durumu tanımlama devrelerinin hızlı gelişimi

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

Memeli genetik devreleri, çok çeşitli hastalık durumlarını algılama ve tedavi etme potansiyelini göstermiştir, ancak devre bileşenlerinin seviyelerinin optimizasyonu zorlu ve emek yoğun olmaya devam etmektedir. Bu süreci hızlandırmak için laboratuvarımız, geleneksel memeli transfeksiyonunun yüksek verimli bir uzantısı olan poli-transfeksiyonu geliştirdi. Poli-transfeksiyonda, transfekte popülasyondaki her hücre esasen farklı bir deney yapar, devrenin davranışını farklı DNA kopya numaralarında test eder ve kullanıcıların tek bir pot reaksiyonunda çok sayıda stokiyometriyi analiz etmelerine izin verir. Şimdiye kadar, tek bir hücre kuyucuğundaki üç bileşenli devrelerin oranlarını optimize eden poli-transfeksiyonlar gösterilmiştir; Prensip olarak, aynı yöntem daha büyük devrelerin geliştirilmesi için de kullanılabilir. Poli-transfeksiyon sonuçları, geçici devreler için DNA'nın ko-transfekt'e optimal oranlarını bulmak veya kararlı hücre hatlarının oluşturulması için devre bileşenleri için ekspresyon seviyelerini seçmek için kolayca uygulanabilir.
Burada, üç bileşenli bir devreyi optimize etmek için poli-transfeksiyonun kullanımını gösteriyoruz. Protokol, deneysel tasarım ilkeleriyle başlar ve poli-transfeksiyonun geleneksel ko-transfeksiyon yöntemlerine nasıl dayandığını açıklar. Daha sonra, hücrelerin poli-transfeksiyonu gerçekleştirilir ve birkaç gün sonra akış sitometrisi ile takip edilir. Son olarak, veriler, belirli bileşen oranlarına sahip hücrelerin alt kümelerine karşılık gelen tek hücreli akış sitometri verilerinin dilimleri incelenerek analiz edilir. Laboratuvarda, hücre sınıflandırıcılarını, geri besleme ve besleme denetleyicilerini, iki kararlı motifleri ve daha fazlasını optimize etmek için poli-transfeksiyon kullanılmıştır. Bu basit ama güçlü yöntem, memeli hücrelerindeki karmaşık genetik devreler için tasarım döngülerini hızlandırır.

Şekil 1'de, ko-transfeksiyonu poli-transfeksiyonla karşılaştırıyoruz. Bir ko-transfeksiyonda, tüm plazmidler aynı transfeksiyon karışımında verilir, bu da herhangi bir hücrenin aldığı her plazmidin miktarı arasında yüksek korelasyon ile sonuçlanır (Şekil 1A). Her hücreye verilen toplam plazmidlerin sayısı önemli ölçüde değişmekle birlikte, popülasyondaki bireysel hücrelerdeki iki muhabir proteinin floresansı iyi ilişkilidir, bu da iki plazmidin oldukça sabit bir...

Karmaşık genetik devrelerin tasarlanması, test edilmesi ve optimize edilmesi zaman alıcıdır. Bu işlemi kolaylaştırmak için, memeli hücreleri, devre bileşenlerinin çoklu stokiyometrilerinin tek bir kuyuda test edilmesine izin verecek şekilde transfekte edilir. Bu protokol, deneysel planlama, transfeksiyon ve veri analizi adımlarını özetlemektedir.

Poli-Transfeksiyonlu Hücre Durumu Tanımlama Devrelerinin Hızlı Gelişimi

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

Protokolümüz, biyolojik parçalar arasındaki ilişkileri anlamayı daha kolay ve hızlı hale getirir. Parçaların birçok oran metrik kombinasyonunun davranışını tek bir kuyucukta test edebiliriz. Bu teknik, araştırmacıların devre bileşenleri arasındaki karmaşık ilişkileri, geleneksel yaklaşımlardan daha fazla deneysel verimlilikle daha kapsamlı bir şekilde karakterize etmelerini sağlar.Bu yöntem, sentetik biyoloji ve herhangi bir biyolojik soru için uygulanabilir, çıktının akış sitometrisi ile ölçülebildiği farklı transfekte gen seviyelerine yanıt olarak bir hücredeki davranış değişikliklerini araştırır. Renk kontrolü yok, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, neon yeşil kontrol, tüm renk kontrolü, poli-transfeksiyon karışımı bir ve poli-transfeksiyon karışımı iki olarak etiketlenmiş 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerini bir kenara bırakarak her DNA agregası için tüpler hazırlamaya başlayın. Renk kontrolü, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, neon yeşili kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerine 36 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin, ardından her bir poli-transfeksiyon karışımına bir ve poli-transfeksiyon karışımı iki tüpe 18 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin.Daha sonra, renk kontrol tüpüne 600 nanogram dolgu plazmidi, mKO2 renk kontrol tüpüne 300 nanogram mKO2 ve 300 nanogram dolgu plazmidi ekleyin ve TagBFP renk kontrol tüpüne 300 nanogram TagBFP ve 300 nanogram dolgu plazmidi ekleyin. Neon yeşili renk kontrol tüpüne 300 nanogram kurucu neon yeşili ve 300 nanogram dolgu plazmidi ekleyin, ardından tüm renk kontrol tüpüne her mKO2, TagBFP, kurucu neon yeşili ve 300 nanogram dolgu plazmidinin 100 nanogramını ekleyin. Poli-transfeksiyon karışımına bir tüp, 150 nanogram mKO2, 75 nanogram muhabir neon yeşil plazmid ve 75 nanogram dolgu plazmidi ekleyin.Poli-transfeksiyon karışımına iki tüp, 150 nanogram TagBFP, 75 nanogram L7Ae plazmid ve 75 nanogram dolgu plazmidi ekleyin. Tamamlandığında, 216 mikrolitre indirgenmiş serum ortamını 9.48 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ile birleştirerek 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde transfeksiyon ana karışımını oluşturun. Bir kenara koymadan önce yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.Renk kontrolü, tek renk kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerine 1,58 mikrolitre arttırıcı reaktif ekleyin ve her bir poli-transfeksiyon karışım tüpüne 79 mikrolitre arttırıcı reaktif ekleyin. Pipetleyerek her tüpü ayrı ayrı karıştırın. Renk kontrolü yok, tek renk kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerine 37,58 mikrolitre transfeksiyon master karışımı ekleyin ve kuvvetli bir şekilde pipetleme yaparak karıştırın.Daha sonra, her bir poli-transfeksiyon karışım tüpüne 18,79 mikrolitre transfeksiyon ana karışımı ekleyin ve her tüpü kuvvetli pipetleme ile iyice karıştırın. Renksiz, tek renk ve tüm renk kontrolleri için her bir transfeksiyon karışımının 65.97 mikrolitresini ilgili kuyucuklara pipetleyerek transfeksiyon karışımlarını kuyucuklara dağıtın, daha sonra poli-transfeksiyon karışımının 32.98 mikrolitresini bir tanesini poli-transfeksiyon kuyusuna aktarın ve plakayı hızlı ama nazik bir şekilde sıkı bir şekilde döndürerek kompleksleri etkili bir şekilde dağıtın, düz bir yüzey boyunca deseni figüre edin, daha sonra poli-transfeksiyonun 32.98 mikrolitre pipeti, ikisini aynı poli-transfeksiyon kuyusuna karıştırın ve plakayı aynı şekilde döndürün. Hücreleri iki gün boyunca inkübe edin.Transfeksiyon belirteçlerinin floresansını okumak için akış sitometrisi yapın ve her hücre için muhabir çıktısı yapın. Videoda gösterilen poli-transfeksiyondan farklı olarak iyi gerçekleştirilen bir ko-transfeksiyon, TagBFP ve EYFP arasında sıkı bir korelasyon gösterir ve birlikte verilen plazmidleri ifade eder. Buna karşılık, kötü gerçekleştirilen bir ko-transfeksiyon, iki plazmid arasında zayıf bir korelasyon gösterir.İyi gerçekleştirilen poli-transfeksiyon, iki boyutlu uzayın iyi bir şekilde kapsandığını ve floresan proteinler arasındaki herhangi bir spektral kanamanın iyi bir şekilde telafi edildiğini gösterdi. Düşük sayıda canlı hücreye sahip poli-transfeksiyon verilerinin, analiz için her bir kutuda yeterli sayıda hücre bulunan yeterli sayıda kutuya bölünmesi zordu. Düşük transfeksiyon verimliliğine sahip bir çoklu transfeksiyon, analiz için iki boyutlu alanın seyrek kaplanmasına neden oldu.Çıkış ekspresyonu üzerindeki etkili DNA oranı, ayrı transfeksiyon karışımlarına bir baskılayıcı protein, mKO2 ile L7Ae ve TagBFP ile neon yeşili bir çıkış proteini yerleştirilerek test edildi. Neon yeşili ifadesi daha sonra mKO2 ve TagBFP'nin farklı seviyelerinde izlendi. Bu devre için ko-transfeksiyon ve poli-transfeksiyon sonuçları karşılaştırıldı.Daha önce gösterilen DNA parçalarını birleştiren 11 ayrı ko-transfeksiyonun sonuçları tek bir veri kümesinde harmanlandı ve poli-transfeksiyon verileriyle karşılaştırıldı. Çıkış raportörünü baskılayan L7Ae'nin doz yanıt eğrilerinin karşılaştırılması, bin başına medyan çıkış seviyesinin ko-transfeksiyon ve poli-transfeksiyon verileri arasında çok benzer olduğunu göstermiştir. Bir hücre tipi sınıflandırıcısını optimize etmek için başarılı bir poli-transfeksiyon uygulaması gösterilmiştir.HeLa hücrelerinde ve HEK olmayan hücrelerde bulunan mikro RNA-21, BM3R1'in ekspresyonunu yıkmak için hareket eder, çünkü BM3R1, devre çıkışı mKO2'nin üretimini bastırır. Bir hücrede mikro RNA 21 bulunduğunda, mKO2 ekspresyonu açılacaktır. Gal4-VP16 miktarı, düşük BM3R1 seviyelerinde mKO2 ekspresyonunu ayarlar.Her devre bileşeni farklı bir floresan işaretleyici ile birlikte teslim edildi. Bu poli-transfeksiyon, her hücrenin her devre bileşeninin ne kadarını aldığını ölçer. mKO2, MIR21'de üretilir, HeLa hücreleri üretir, ancak HEK hücrelerinde üretilmez.mKO2 çıkışı, bu devre bileşenlerini, belirli bir hücre tarafından alınan her devre bileşeninin miktarını belirtmek için farklı floresan muhabirlerle ayrı transfeksiyon karışımlarında teslim ettikten sonra analiz edildi. Bu alt örnekleme, bu oranda, HEK293'ü HeLa hücrelerine karşı sınıflandırırken, birlikte transfekte edilen devrenin% 91 özgüllük,% 62 duyarlılık ve% 77 doğruluk oranına sahip olduğunu öngörmüştür. Bu protokoldeki en yaygın ağrı noktası, her transfeksiyon karışımında sıkı bir korelasyon olmamasıdır.Bu nedenle, arttırıcı reaktifi ekledikten hemen sonra transfeksiyon tüplerini kuvvetlice karıştırmayı unutmayın ve daha sonra lipit içeren transfeksiyon karışımı eklendikten sonra transfeksiyon tüplerini karıştırma ve pipetleme konusunda nazik olun Bu prosedürdeki genetik bileşenler, çeşitli ortamlarda işleyiş performansları hakkındaki soruları cevaplamak için diğer genetik bileşenlerle değiştirilebilir. Bu yöntem, hücre sınıflandırıcıları, geri besleme ve ileri besleme denetleyicileri, iki kararlı motifler ve daha fazlası gibi genetik devreleri hızla geliştirmiştir.

rapid-development-cell-state-identification-circuits-with-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Yeşil floresan protein geninin keşfinden bu yana, floresan proteinler moleküler hücre biyolojisini etkilemiştir. Bu protokol, genetik mühendisliği yoluyla farklı floresan proteinlerin ekspresyonunun, tek tek hücreleri barkodlamak için nasıl kullanıldığını açıklar. Prosedür, çoğullanmış uygulamalar için ideal olan bir hücre karışımındaki farklı popülasyonların izlenmesini sağlar.

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

In vitro transkripsiyon reaksiyonlarını düzenlemek için yeni bir DNA bağlı T7 RNA polimerazının mühendisliğini anlatıyoruz. Protein sentezi ve karakterizasyonu için adımları tartışıyoruz, kavram kanıtı transkripsiyonel düzenlemeyi doğrulıyoruz ve moleküler bilgi işlem, teşhis ve moleküler bilgi işlemedeki uygulamalarını tartışıyoruz.

Programlanabilir In vitro Transkripsiyon ve Moleküler Hesaplama için DNA-Bağlı RNA Polimeraz

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

İyi karakterize edilmiş genetik parçalar, yeni genetik devrelerin tasarımı için gereklidir. Burada, genetik parçaları hızlı bir şekilde karakterize etmek için uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz. Yöntemimiz, hücresiz lizatları, klonlamayı önlemek için lineer DNA'yı ve verimi artırmak ve reaksiyon hacimlerini azaltmak için akustik sıvı işlemeyi birleştirerek maliyeti ve zamanı azaltır.

Genetik Parçaların Hücresiz Sistemlerle Hızlı Karakterizasyonu

Mevcut protokol, 2i ve LIF ortamı ile kültür sırasında fare embriyonik kök hücrelerinin ters poli-transfeksiyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, geleneksel ileri transfeksiyon protokollerinden daha yüksek canlılık ve verimlilik sağlarken, aynı zamanda plazmit oranlarının tek kap optimizasyonunu da sağlar.

Nükleik Asit Oranlarının Hızlı Araştırılması için Optimize Edilmiş Bir Fare Embriyonik Kök Hücre Tabanlı Ters Poli-Transfeksiyon Tekniği

Öğrenin, poli-transfeksiyon yöntemiyle memeli hücrelerinde çoklu genetik devre bileşenlerinin davranışlarını tek bir kuyucukta nasıl karakterize edebilirsiniz. Bu yöntem, sentetik biyolojide devre tasarımını hızlandırır ve akış sitometrisiyle çıktı ölçümü sağlar.

Poli-Transfeksiyonlu Hücre Durumu Tanımlama Devrelerinin Hızlı Gelişimi

Daha fazla video keşfet