Poli-Transfeksiyonlu Hücre Durumu Tanımlama Devrelerinin Hızlı Gelişimi
24 Şubat 2023
Karmaşık genetik devrelerin tasarlanması, test edilmesi ve optimize edilmesi zaman alıcıdır. Bu işlemi kolaylaştırmak için, memeli hücreleri, devre bileşenlerinin çoklu stokiyometrilerinin tek bir kuyuda test edilmesine izin verecek şekilde transfekte edilir. Bu protokol, deneysel planlama, transfeksiyon ve veri analizi adımlarını özetlemektedir.
Protokolümüz, biyolojik parçalar arasındaki ilişkileri anlamayı daha kolay ve hızlı hale getirir. Parçaların birçok oran metrik kombinasyonunun davranışını tek bir kuyucukta test edebiliriz. Bu teknik, araştırmacıların devre bileşenleri arasındaki karmaşık ilişkileri, geleneksel yaklaşımlardan daha fazla deneysel verimlilikle daha kapsamlı bir şekilde karakterize etmelerini sağlar.
Bu yöntem, sentetik biyoloji ve herhangi bir biyolojik soru için uygulanabilir, çıktının akış sitometrisi ile ölçülebildiği farklı transfekte gen seviyelerine yanıt olarak bir hücredeki davranış değişikliklerini araştırır. Renk kontrolü yok, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, neon yeşil kontrol, tüm renk kontrolü, poli-transfeksiyon karışımı bir ve poli-transfeksiyon karışımı iki olarak etiketlenmiş 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerini bir kenara bırakarak her DNA agregası için tüpler hazırlamaya başlayın. Renk kontrolü, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, neon yeşili kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerine 36 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin, ardından her bir poli-transfeksiyon karışımına bir ve poli-transfeksiyon karışımı iki tüpe 18 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin.
Daha sonra, renk kontrol tüpüne 600 nanogram dolgu plazmidi, mKO2 renk kontrol tüpüne 300 nanogram mKO2 ve 300 nanogram dolgu plazmidi ekleyin ve TagBFP renk kontrol tüpüne 300 nanogram TagBFP ve 300 nanogram dolgu plazmidi ekleyin. Neon yeşili renk kontrol tüpüne 300 nanogram kurucu neon yeşili ve 300 nanogram dolgu plazmidi ekleyin, ardından tüm renk kontrol tüpüne her mKO2, TagBFP, kurucu neon yeşili ve 300 nanogram dolgu plazmidinin 100 nanogramını ekleyin. Poli-transfeksiyon karışımına bir tüp, 150 nanogram mKO2, 75 nanogram muhabir neon yeşil plazmid ve 75 nanogram dolgu plazmidi ekleyin.
Poli-transfeksiyon karışımına iki tüp, 150 nanogram TagBFP, 75 nanogram L7Ae plazmid ve 75 nanogram dolgu plazmidi ekleyin. Tamamlandığında, 216 mikrolitre indirgenmiş serum ortamını 9.48 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ile birleştirerek 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde transfeksiyon ana karışımını oluşturun. Bir kenara koymadan önce yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.
Renk kontrolü, tek renk kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerine 1,58 mikrolitre arttırıcı reaktif ekleyin ve her bir poli-transfeksiyon karışım tüpüne 79 mikrolitre arttırıcı reaktif ekleyin. Pipetleyerek her tüpü ayrı ayrı karıştırın. Renk kontrolü yok, tek renk kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerine 37,58 mikrolitre transfeksiyon master karışımı ekleyin ve kuvvetli bir şekilde pipetleme yaparak karıştırın.
Daha sonra, her bir poli-transfeksiyon karışım tüpüne 18,79 mikrolitre transfeksiyon ana karışımı ekleyin ve her tüpü kuvvetli pipetleme ile iyice karıştırın. Renksiz, tek renk ve tüm renk kontrolleri için her bir transfeksiyon karışımının 65.97 mikrolitresini ilgili kuyucuklara pipetleyerek transfeksiyon karışımlarını kuyucuklara dağıtın, daha sonra poli-transfeksiyon karışımının 32.98 mikrolitresini bir tanesini poli-transfeksiyon kuyusuna aktarın ve plakayı hızlı ama nazik bir şekilde sıkı bir şekilde döndürerek kompleksleri etkili bir şekilde dağıtın, düz bir yüzey boyunca deseni figüre edin, daha sonra poli-transfeksiyonun 32.98 mikrolitre pipeti, ikisini aynı poli-transfeksiyon kuyusuna karıştırın ve plakayı aynı şekilde döndürün. Hücreleri iki gün boyunca inkübe edin.
Transfeksiyon belirteçlerinin floresansını okumak için akış sitometrisi yapın ve her hücre için muhabir çıktısı yapın. Videoda gösterilen poli-transfeksiyondan farklı olarak iyi gerçekleştirilen bir ko-transfeksiyon, TagBFP ve EYFP arasında sıkı bir korelasyon gösterir ve birlikte verilen plazmidleri ifade eder. Buna karşılık, kötü gerçekleştirilen bir ko-transfeksiyon, iki plazmid arasında zayıf bir korelasyon gösterir.
İyi gerçekleştirilen poli-transfeksiyon, iki boyutlu uzayın iyi bir şekilde kapsandığını ve floresan proteinler arasındaki herhangi bir spektral kanamanın iyi bir şekilde telafi edildiğini gösterdi. Düşük sayıda canlı hücreye sahip poli-transfeksiyon verilerinin, analiz için her bir kutuda yeterli sayıda hücre bulunan yeterli sayıda kutuya bölünmesi zordu. Düşük transfeksiyon verimliliğine sahip bir çoklu transfeksiyon, analiz için iki boyutlu alanın seyrek kaplanmasına neden oldu.
Çıkış ekspresyonu üzerindeki etkili DNA oranı, ayrı transfeksiyon karışımlarına bir baskılayıcı protein, mKO2 ile L7Ae ve TagBFP ile neon yeşili bir çıkış proteini yerleştirilerek test edildi. Neon yeşili ifadesi daha sonra mKO2 ve TagBFP'nin farklı seviyelerinde izlendi. Bu devre için ko-transfeksiyon ve poli-transfeksiyon sonuçları karşılaştırıldı.
Daha önce gösterilen DNA parçalarını birleştiren 11 ayrı ko-transfeksiyonun sonuçları tek bir veri kümesinde harmanlandı ve poli-transfeksiyon verileriyle karşılaştırıldı. Çıkış raportörünü baskılayan L7Ae'nin doz yanıt eğrilerinin karşılaştırılması, bin başına medyan çıkış seviyesinin ko-transfeksiyon ve poli-transfeksiyon verileri arasında çok benzer olduğunu göstermiştir. Bir hücre tipi sınıflandırıcısını optimize etmek için başarılı bir poli-transfeksiyon uygulaması gösterilmiştir.
HeLa hücrelerinde ve HEK olmayan hücrelerde bulunan mikro RNA-21, BM3R1'in ekspresyonunu yıkmak için hareket eder, çünkü BM3R1, devre çıkışı mKO2'nin üretimini bastırır. Bir hücrede mikro RNA 21 bulunduğunda, mKO2 ekspresyonu açılacaktır. Gal4-VP16 miktarı, düşük BM3R1 seviyelerinde mKO2 ekspresyonunu ayarlar.
Her devre bileşeni farklı bir floresan işaretleyici ile birlikte teslim edildi. Bu poli-transfeksiyon, her hücrenin her devre bileşeninin ne kadarını aldığını ölçer. mKO2, MIR21'de üretilir, HeLa hücreleri üretir, ancak HEK hücrelerinde üretilmez.
mKO2 çıkışı, bu devre bileşenlerini, belirli bir hücre tarafından alınan her devre bileşeninin miktarını belirtmek için farklı floresan muhabirlerle ayrı transfeksiyon karışımlarında teslim ettikten sonra analiz edildi. Bu alt örnekleme, bu oranda, HEK293'ü HeLa hücrelerine karşı sınıflandırırken, birlikte transfekte edilen devrenin% 91 özgüllük,% 62 duyarlılık ve% 77 doğruluk oranına sahip olduğunu öngörmüştür. Bu protokoldeki en yaygın ağrı noktası, her transfeksiyon karışımında sıkı bir korelasyon olmamasıdır.
Bu nedenle, arttırıcı reaktifi ekledikten hemen sonra transfeksiyon tüplerini kuvvetlice karıştırmayı unutmayın ve daha sonra lipit içeren transfeksiyon karışımı eklendikten sonra transfeksiyon tüplerini karıştırma ve pipetleme konusunda nazik olun Bu prosedürdeki genetik bileşenler, çeşitli ortamlarda işleyiş performansları hakkındaki soruları cevaplamak için diğer genetik bileşenlerle değiştirilebilir. Bu yöntem, hücre sınıflandırıcıları, geri besleme ve ileri besleme denetleyicileri, iki kararlı motifler ve daha fazlası gibi genetik devreleri hızla geliştirmiştir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, karmaşık genetik devrelerin tasarımını ve testini, devre bileşenlerinin birden fazla stokiyometrisinin tek bir kuyu içinde test edilmesine izin vererek basitleştirir. Araştırmacılar, biyolojik parçaların ve bunların çeşitli transfekte edilen gen seviyelerine tepki olarak gösterdikleri davranışların arasındaki ilişkileri verimli bir şekilde karakterize edebilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sentetik Biyoloji
- Genetik Mühendisliği
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Karmaşık genetik devreler tasarlamak ve optimize etmek zordur.
- Geleneksel yöntemler genellikle zaman alıcıdır ve daha az verimlidir.
- Akış sitometrisi, transfekte edilen genlerin çıktısını ölçebilir.
- Bu protokol, deneysel verimliliği artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Birden fazla genetik devre bileşeninin testini kolaylaştırmak.
- Biyolojik parçaların ilişkilerini daha iyi anlamak.
- Devre davranışlarının kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Memeli hücrelerin çeşitli DNA agregatları ile transfeksiyonu.
- Farklı kontroller ve karışımlar için mikro santrifüj tüplerinin hazırlanması.
- Optimal transfeksiyon koşulları için azaltılmış serum ortamının kullanımı.
- Akış sitometrisi ile çıktıların ölçülmesi.
Ana Sonuçlar
- Tek bir kuyuda birden fazla stokiyometrinin verimli bir şekilde test edilmesi.
- Bileşenler arasındaki karmaşık ilişkiler hakkında daha iyi anlama sağlar.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla daha büyük deneysel verimlilik.
- Çeşitli biyolojik sorulara uygulanabilirlik.
Sonuçlar
- Bu yöntem, genetik devrelerin tasarımını ve testini basitleştirir.
- Devre davranışlarının daha kapsamlı bir analizini sağlar.
- Araştırmacılar, farklı gen seviyelerinin etkisini etkili bir şekilde araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Poly-transfection enables rapid, high-throughput optimization of mammalian genetic circuits by allowing simultaneous testing of multiple DNA stoichiometries in a single well. This approach accelerates the design-build-test cycle for cell state identification circuits, supporting predictive confidence and functional target validation in early discovery. The method streamlines portfolio triage by providing robust quantitative data for complex synthetic biology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of genetic circuit component relationships in mammalian cells.
- Supports functional de-risking and target validation by quantifying circuit behavior across diverse stoichiometries.
- Facilitates rapid hypothesis testing for cell classifier and regulatory motif development.
- Provides actionable data for prioritizing circuit designs with optimal specificity and sensitivity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cell-based systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via flow cytometry for robust assay standardization.
- Enables high-throughput evaluation of circuit performance in a single-pot format.
- Supports scalable optimization of multi-component genetic constructs for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell state identification circuits with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Provides quantitative specificity, sensitivity, and accuracy metrics for preclinical model selection.
- Reduces mechanistic ambiguity in circuit-driven cell classification and functional readouts.
- Supports risk-adjusted advancement of synthetic biology assets into preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
Poly-transfection integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid optimization of genetic circuits for downstream translational and preclinical workflows.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification by mapping circuit output to DNA input ratios.
- Screening: Provides reproducible, quantitative flow cytometry data for assay readiness and platform reuse.
- Analytics: Enables binning and statistical comparison of circuit performance across multiple conditions in a single experiment.
- Translational Research: Supports alignment of circuit outputs with disease-relevant cell states and biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, generalizable workflow for rapid optimization of diverse genetic circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic circuit optimization.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable transfection and analysis workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of synthetic biology assets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and flow cytometry analysis.
- Demands access to high-throughput flow cytometry and robust data analytics infrastructure.
- Necessitates rigorous mixing and pipetting protocols to ensure reproducibility across transfection mixes.
- May require adaptation of fluorescent markers and circuit components for different cell types or model systems.
- Dependent on sufficient transfection efficiency and live cell numbers for robust statistical analysis.
