Name: Canlı Tek Hücreleri İzole Etmek için Pankreas Doku Diseksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Öğrenin, pankreas dokusundan canlı tek hücreleri izole etmek için basit ve etkili bir doku dissosiasyon protokolü. Bu yöntem, pankreas tümörleri ve ön malign lezyonların incelenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Veri analizindeki yardımları için Dr. Avital Sarusi-Portuguez'e ve daha önceki bir çalışmada protokolün oluşturulmasındaki yardımları için Dr. Dror Kolodkin-Gal'e teşekkür ederiz. Parnas laboratuvarının tüm geçmiş ve şimdiki üyelerine teşekkür ederiz. Dr. Gillian Kay ve Dr. Michael Kanovsky'ye editörlükteki yardımları için teşekkür ederiz. Bu proje, İsrail Bilim Vakfı hibesinden (No. 526/18 OP), Alex U. Soyka Programından ve İsrail Kanser Araştırma Fonu'ndan (Araştırma Kariyeri Geliştirme Ödülü) bir hibe almıştır.

İbrani Üniversitesi (Kudüs, İsrail) ve Hadassah Tıp Merkezi'nin (Kudüs, İsrail) ortak etik komitesi (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi), hayvan refahı için çalışma protokolünü onayladı (MD-18-15417-5 "Farelerde pankreas kanserinde doku dinamikleri") ve burada sunulan protokol, hayvan testleri ve araştırmaları için ilgili tüm etik düzenlemelere uygundur. İbrani Üniversitesi, Laboratuvar Hayvanları Bakımı Uluslararası akredite enstitüsünün Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu için bir Dernektir.
NOT: Fare suşu stoğu #007908, stok #019378 ve stok #008179 Jackson'ın laboratuvarından elde edilmiştir. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) fareleri, yukarıdaki suşları geçerek yaratıldı. Çalışma için her iki cinsiyetten 6 hafta ile 15 ay arasındaki fareler kullanıldı. Tamoksifen, tozun mısır yağında çözülmesiyle hazırlandı. Yetişkin farelere (6-8 haftalık, dişiler ve erkekler), 0. ve 2. günlerde 400 mg / kg'lık bir dozda deri altından tamoksifen enjekte edildi ve enjeksiyondan sonra haftada iki kez incelendi. Tümörleri dahili olarak yerleştirildikleri için ölçmek mümkün değildi; Bu nedenle etik protokole göre anormal klinik bulgular gözlenirse ötenazi uygulandı. Fareler, tamoksifen indüksiyonu sonrası, izofluran ve servikal çıkık kullanılarak farklı zaman noktalarında ötenazi yapıldı.
1. Pankreas diseksiyonu
NOT: Ekstraksiyon sırasında optimum verim ve iyi hücre canlılığı sağlamak için hızlı diseksiyon kritiktir. Pankreas izolasyonu için gereken süreyi kısaltmak için, fareye ötenazi yapılmadan önce tüm alet ve ekipmanların buz üzerinde hazır olması gerekir.
<ol><li>Fareyi CO2 asfiksi ile ötenazi yapın ve servikal çıkık kullanarak doğrulayın. Bu adımdan itibaren tüm işlemler steril diseksiyon aletleri ile yapılmalıdır.</li>
	<li>Fareyi sabitleyin ve karnına% 70 etanol püskürtün. Makas ve forseps ile genital bölgede 2,5 cm'lik V şeklinde bir kesi yapın ve karın boşluğunu tamamen açmak için yukarı doğru ilerleyin.</li>
	<li>Farenin sol tarafındaki mideyi bulun. Dalağa yakın olan pankreası bulun. Pankreası iki forseps kullanarak (yırtılmadan) mide ve duodenumdan ayırın. Pankreası ince bağırsak, jejunum ve ileumdan ayırmaya devam edin.</li>
	<li>Pankreası farenin sağ tarafına hareket ettirin. Pankreas ve bağlı dalağı tamamen ayırmak için pankreas ve göğüs boşluğu arasında kalan bağlantıları forseps ile ayırın.</li>
	<li>Pankreası çıkarın ve buz üzerinde bir Petri kabında inceleme için yayın. NOT: Hücresel kontaminasyonu önlemek için bu adım sırasında sadece pankreasın çıkarılmasına ve pankreas ile birlikte mezenterik yağ dokusunun veya diğer bitişik dokuların çıkarılmamasına özen gösterilmelidir.</li>
</ol>2. Pankreasın enzimatik ve mekanik ayrışması
<ol><li>Aşağıdaki arabellekleri önceden hazırlayın.<ol><li>Ayrışma tamponu 1: Her numune için 4 mL tripsin C + 6 mL fosfat tamponlu salin (PBS) (bakınız Tablo 1).</li>
		<li>Ayrışma tamponu 2: 9 mL Hanks' dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 1x; % 4 sığır serum albümini (BSA); 1 mL kollajenaz P (10 mg/mL); 200 μL tripsin inhibitörü (10 mg/mL); ve 200 μL DNaz I (10 mg / mL) (bakınız Tablo 1).</li>
		<li>Yıkama tamponu: 50 mL HBSS 1x; 2 g BSA; 1 mL tripsin inhibitörü (10 mg / mL); ve 1 mL DNaz 1 (10 mg / mL).</li>
		<li>Enzim aktivitesi durdurma çözeltisi:% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve 150 g DNaz I (0.2 mg / mL) içeren HBSS 1x.</li>
	</ol></li>
	<li>Pankreası buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Pankreası HBSS 1x'te% 10 FBS'de durulayın. Yağ dokusu yüzer ve pankreas batar. Bu, hala pankreasa bağlı olan kirletici beyaz yağ dokusunu görselleştirmenin ve hızlı bir şekilde çıkarmanın kolay bir yoludur.</li>
	<li>Fare pankreas dokusunu buz üzerinde 5 mL HBSS 1x içeren steril bir Petri kabına aktarın. Noyes makası ve neşter kullanarak pankreası 1 ila 3 mm'lik3 küçük parçalar halinde kesin (Şekil 2A). Birden fazla numune olması durumunda, numuneler %10 FBS/HBSS 1x'te buz üzerinde tutulmalıdır.</li>
	<li>Dokuları bir santrifüj tüpüne aktarın. 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücre parçalarını ve kan hücrelerini çıkarmak için süpernatanı aspire edin ve atın.</li>
	<li>% 0.02 tripsin C-% 0.05 EDTA içeren ayrışma tamponu 1'deki parçaları, çalkalama (180 rpm) ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Hemen %10 FBS/Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM) ile yıkayın. 4 °C'de 350 g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Peleti 10 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek ve bir sonraki ayrışma adımından önce 4 °C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyerek tekrar yıkayın.</li>
	<li>Pankreası ayrışma tamponu 2'de 37 ° C'de çalkalama (180 rpm) ile 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>15 dakika sonra, pankreas parçalarını küçülen boyuttaki steril pipetlerde (25, 10 ve 5 mL serolojik pipetler) 10 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik ayrışma gerçekleştirin ve 37 ° C'ye geri getirin.<ol><li>5 dakika sonra, mekanik ayrışmayı tekrarlayın ve tek hücreli süspansiyon miktarına göre ayrışmayı izlemek için ışık mikroskobu kullanın. Genellikle bu aşamada, süspansiyonun% 90'ından azı izole edilmiş tek hücrelerden oluşuyorsa, daha uzun bir inkübasyon süresine ihtiyaç vardır. Hücre canlılığını izlemek için tripan mavisini kullanın.</li>
		<li>İnkübasyona devam edin ve her 5 dakikada bir ayrışmayı tespit etmek için örnekler alın. NOT: Toplam inkübasyon süresi dokuya bağlıdır ve numuneler arasında değişebilir. İnkübasyon ve doku ayrışması, hücrelerin %90'ı tek hücrelere ayrıldığında veya canlılıkta bir azalma tespit edildiğinde sona ermelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Pankreas dokusu iyice ayrıştıktan sonra (pankreas parçalarının kaybolmasına ve çözeltinin artan bulanıklığına karşılık gelir) (Şekil 2), enzim aktivitesi durdurma çözeltisi ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayarak enzimatik reaksiyonu durdurun. Bu adımdan itibaren hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 70μm'lik bir naylon ağdan geçirin ve mikroskop altında hücre canlılığını kontrol edin. Daha küçük boyutlarda naylon ağ, hücre canlılığını azaltabilir.</li>
	<li>Peletin tekrar süspanse edilmesi ve 5-10 mL buz gibi soğuk tamponlu yıkama solüsyonu ile yıkanması. Hücreleri sayın.</li>
	<li>Birkaç kırmızı kan hücresi gözlenirse, hücrelere oda sıcaklığında 2 dakika boyunca kırmızı kan hücresi lizis tamponu uygulayın. Topaklanmaların gözlendiği durumlarda, numune adım 2.5'te açıklandığı gibi tripsin ile tekrar muamele edilmelidir. Canlılık, mikroskop altında tripan mavisi ile tespit edilir ve canlılık% 80'den azsa, canlı hücreler, MACS MS sütunları ile manyetik olarak aktive edilen hücre sıralama (MACS) ölü hücre çıkarma kiti kullanılarak izole edilmelidir (bkz. Tablo 1).</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+single-cell+RNA-seq+highlights+intra-tumoral+heterogeneity+and+malignant+progression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cell Research. 29 (9), 777(2019).</li>
<li>Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+progression+in+the+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetic progression in the pancreatic ducts.</a> The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).</li>
<li>Schlesinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+of+pancreatic+preinvasive+lesions+and+cancer+reveal+acinar+metaplastic+cells%27+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity.</a> Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).</li>
<li>Kolodkin-Gal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senolytic+elimination+of+Cox2-expressing+senescent+cells+inhibits+the+growth+of+premalignant+pancreatic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions.</a> Gut. 71 (2), 345-355 (2021).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li>
<li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li>
<li>Bernard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+pancreatic+cancer+precursors+demonstrates+epithelial+and+microenvironmental+heterogeneity+as+an+early+event+in+neoplastic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression.</a> Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).</li>
<li>Moncada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+microarray-based+spatial+transcriptomics+and+single-cell+RNA-seq+reveals+tissue+architecture+in+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas.</a> Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptome+profiling+of+pancreatic+cancer+identifies+multicellular+dynamics+associated+with+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment.</a> Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).</li>
<li>Cui Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+drivers+and+transitional+cell+populations+cooperate+with+the+microenvironment+in+untreated+and+chemo-resistant+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Bu yazıda pankreas dokusu dissosiyasyonu için bir protokol sunuyoruz. Protokol basittir, kullanımı kolaydır ve katı tümörler de dahil olmak üzere malignite süreci sırasında farklı aşamalarda canlı tek hücreleri pankreas dokusundan izole etmek için bir araç sağlar. Önceki çalışmalarda, pankreası sindirmek için farklı tipte kollajenazlar kullanılmıştır 8,9. Kollajenaz D gibi çok güçlü bir kollajenaz kullanmak, büyük bir bağışıklık hücresi popülasyonu ve daha düşük ...

Pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) en agresif kanser tiplerinden biridir1. Klinik kanıtlar, PDAC'nin uzun yıllar boyunca asiner hücreler de dahil olmak üzere ekzokrin sistem hücrelerinden geliştiği ve KRAS proto-onkogen2'deki mutasyonlar tarafından yönlendirildiği fikrini desteklemektedir.
Pankreas tümörleri birçok farklı hücre tipini içerir ve kötü huylu hücrelerin tümör kütlesinin sadece %20-50'sini oluşturduğu gösterilmiştir3. Farklı hücre tipleri epitel hücreleriyle etkileşime girer, dönüşümlerini destekler ve tümör oluşumunu ve büyümesini arttırır. Erken olaylar, pankreatik intraepitelyal neoplazi (PanIN'ler) adı verilen ve bazı durumlarda PDAC4'e dönüşebilen mikroskobik lezyonlara yol açan asiner metaplaziye neden olur.
Bu etkileşimleri araştırmak ve önemli sinyalleri hedeflemek için kritik bir ihtiyaç vardır. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi), gen ekspresyonunu tek hücre çözünürlüğünde ortaya çıkaran, böylece epitel hücrelerinin geçirdiği değişiklikleri izleyen ve böylece pankreas kanseri gelişiminin araştırılmasını sağlayan güçlü bir yöntemdir. 
Tek hücrelere doku diseksiyonu ve sindirimi, bir scRNA-seq deneyinin ilk aşamasıdır. Pankreas dokusu sindirimini özellikle zorlaştıran çeşitli faktörler vardır: i) asiner hücreler pankreasın %90'ından fazlasını oluşturur ve asiner hücreler, RNA tabanlı kütüphanelerin kalitesini düşüren proteazlar ve RNazlar dahil olmak üzere büyük miktarlarda sindirim enzimleri içerir; (ii) asiner hücreler çok hassastır ve standart protokoller kullanılırsa parçalanabilir; (iii) Asiner hücreler çok yüksek seviyelerde az sayıda gen eksprese ederler. Bu nedenle, bu hücreler deney sırasında parçalanırsa, bu, diğer hücrelerin gözlemlenen gen ekspresyon profilini kirletebilir; (iv) tümörlerden elde edilen pankreas dokusu desmoplastiktir, bu da hücrelere zarar vermeden diseksiyonu zorlaştırır. Bu nedenle, tüm hücre tiplerinin yüksek canlılığının korunması gerekli olsa da, asiner hücrelerin büyük sayısı ve duyarlılığı ek karmaşıklık katar. Bu faktörler, scRNA-seq deneyleri için gerekli olduğu gibi, %80'den fazla canlı olan ve kümelenme içermeyen tek hücreli bir süspansiyonun elde edilmesinde zorluklar yaratır. 
Burada, sık doku monitörizasyonunun yanı sıra tripsin C ve kollajenaz P kullanan bir protokol geliştirdik. Bu, scRNA-seq deneylerinin başarısını desteklemek için yüksek canlılığı korurken tek hücrelere ayrışmayı destekler 5,6.

<table><tbody><tr><td>Reaktif veya Kaynak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 & m naylon örgü ve nbsp;</td><td>Corning</td><td>kedisi##431751</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>kedisi# A7906</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz P</td><td>Roche</td><td>kedisi# 11213857001</td><td></td></tr><tr><td>Kritik Ticari Test</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>kedisi#MBD0015</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>kedisi# 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Deneysel Modeller: Organizmalar/ Suşlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Güney Amerika</td><td>ThermoFisher</td><td>Kedi # 10270106</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Biyolojik endüstriler</td><td>kedi # 02-018-1A & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>KRASLSL-G12D fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>JAX008179</td><td></td></tr><tr><td>MACS ölü hücre temizleme kiti</td><td>Milteny Biotec</td><td>kedi # 130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biyolojik endüstriler</td><td>kedi # 02-023-1A & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER mice</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>JAX019378</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdDomates fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>JAX007908</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin C-EDTA %0.05</td> <td>Biyolojik endüstriler</td><td>cat# 03-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin inhibitör</td><td>Roche</td><td>kedisi#T6522</td><td></td></tr></tbody></table>

canlı tek hücreleri İzole etmek için pankreas doku diseksiyonu

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

Pankreas iki ana sistem içerir: hormonları üreten ve salgılayan endokrin sistem ve pankreasın yaklaşık% 90'ını oluşturan ve sindirim enzimleri üreten ve salgılayan hücreleri içeren ekzokrin sistem. Sindirim enzimleri pankreas asiner hücrelerinde üretilir, zimojen adı verilen veziküllerde depolanır ve daha sonra metabolik süreçleri başlatmak için pankreas kanalı yoluyla duodenuma salınır. Asiner hücreler tarafından üretilen enzimler hücreleri öldürebilir veya hücresiz RNA'yı parçalayabilir. Ek olarak, asiner hücreler kırılgandır ve ortak ayrışma protokolleri çok sayıda ölü hücre ve hücresiz proteaz ve RNaz ile sonuçlanır. Bu nedenle, pankreas dokusu sindirimindeki en büyük zorluklardan biri, sağlam ve canlı hücrelerin, özellikle asiner hücrelerin geri kazanılmasıdır. Bu makalede sunulan protokol, bu ihtiyacı karşılamak için geliştirdiğimiz iki adımlı bir yöntemi göstermektedir. Protokol, normal pankrea, pre-malign lezyonları içeren pankreaları veya çok sayıda stromal ve immün hücre içeren pankreas tümörlerini sindirmek için kullanılabilir.

Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada5, bir fare modeli kullanarak PDAC geliştirmenin erken aşamalarını keşfetmek için yukarıda açıklanan protokolü uyguladık. Fare, tamoksifen enjeksiyonundan sonra asiner hücrelerde yapısal olarak aktif KRAS ekspresyonuna izin veren Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7 kasetlerini içerecek şekilde genetik olarak tasarlanmıştır. 
Servikal çıkıktan sonra (fare etik...

Pankreas metaplastik hücreleri, pankreas tümörlerine yol açan kötü huylu hücrelerin öncüleridir. Bununla birlikte, sağlam canlı pankreas hücrelerini izole etmek zordur. Burada pankreas dokusu ayrışması için etkili bir yöntem sunuyoruz. Hücreler daha sonra tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) veya iki veya üç boyutlu birlikte kültürleme için kullanılabilir.

Canlı Tek Hücreleri İzole Etmek için Pankreas Doku Diseksiyonu

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

Gösterilen pankreas dokusu ayrışma protokolü basittir ve katı tümörler de dahil olmak üzere malignite süreci sırasında farklı aşamalarda canlı tek hücreleri pankreas dokusundan izole etmek için bir araç sağlar. Sağlam ve canlı asiner hücrelerin geri kazanılması büyük bir zorluktur. Protokol, normal pankreata, pre-malign lezyonlara sahip pankreas veya çok sayıda stromal ve immün hücre içeren pankreas tümörlerinden canlı tek hücreleri kurtarabilir.İnsan pankreas tümörlerini veya iltihaplı pankreasını incelemek için bu protokolün kullanılması, yeni biyobelirteçler ve tedaviler bulmak için bu hastalıkların araştırılmasına yardımcı olabilir. Yöntemin kullanımı kolaydır ve minimum uygulama ile istenen sonuçları sağlayabilir. Bu video, protokolün küçük ayrıntılarını görüntülemenize yardımcı olacaktır.Diseksiyona başlamadan önce tüm alet ve ekipmanları buz üzerinde hazır tutunuz. Ötenazi fareyi sabitledikten sonra, karnına% 70 etanol püskürtün. Makas ve forseps kullanarak, hayvanın genital bölgesinde 2,5 santimetrelik V şeklinde bir kesi yapın ve karın boşluğunu tamamen açmak için yukarı doğru ilerleyin.Farenin sol tarafındaki mideyi ve dalağın yakınındaki pankreası bulun. İki forseps kullanarak pankreası mide ve duodenumdan yırtılmadan ayırın. Pankreası ince bağırsak, jejunum ve ileumdan ayırın ve ayırın.Pankreası sağ tarafa hareket ettirin ve pankreas ile göğüs boşluğu arasındaki kalan bağlantıları forseps ile ayırarak pankreası ve bağlı dalağı tamamen ayırın. Dikkatlice, pankreası mezenterik yağ veya diğer bitişik dokular olmadan çıkarın ve buz üzerinde bir Petri kabında incelenmek üzere yayın. Metinde bahsedilen bileşimi takiben, ayrışma tamponları 1 ve 2'yi hazırlayın, tamponu yıkayın ve enzim aktivitesini durduran çözeltiyi önceden yıkayın.Pankreası buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve% 10 fetal sığır serumu veya FBS ve Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS ile durulayın. Yağ yüzer ve pankreas batar. Bu, hala pankreasa bağlı olan kirletici beyaz yağ dokusunu görselleştirmenin ve hızlı bir şekilde çıkarmanın kolay bir yoludur.Daha sonra, fare pankreas dokusunu beş mililitre HBSS içeren steril bir Petri kabında kesene kadar buz üzerinde aktarın ve saklayın. Noyes makası ve neşter kullanarak pankreası bir ila üç milimetreküplük küçük parçalar halinde kesin. Dokuları bir santrifüj tüpüne aktardıktan sonra, beş dakika boyunca 350G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Hücre parçalarını ve kan hücrelerini çıkarmak için süpernatanı aspire edin ve atın. % 0.02 tripsin-C ve% 0.05 EDTA içeren ayrışma tamponu 1'deki parçaları çalkalama ile 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca yeniden askıya alın. Hemen% 10 FBS ve Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium veya DMEM ile yıkayın ve 350G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.Peleti 10 mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek ve bir sonraki ayrışma adımından önce beş dakika boyunca daha önce olduğu gibi santrifüjleyerek tekrar yıkayın. Pankreası ayrışma tamponu 2'de 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca dakikada 180 dönüşte çalkalama ile inkübe edin. 15 dakika sonra, steril serolojik pipetler kullanarak pankreas parçalarını 10 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik ayrışma gerçekleştirin.25, 10 ila 5 mililitreden başlayarak azalan pipetler kullanarak tekrarlayın. Numuneyi 37 santigrat dereceye getirmek için inkübe edin. Süspansiyondaki tek hücre miktarına göre ayrışmayı izlemek için ışık mikroskobu kullanın.Tripan mavisi kullanarak hücre canlılığını izleyin. İnkübasyona devam edin ve her beş dakikada bir numune alarak ayrışmayı kontrol edin. Hücrelerin %90'ı tek hücrelere ayrılana kadar inkübe edin.Pankreas dokusu, pankreas parçalarının kaybolması ve çözeltinin artan bulanıklığı ile gösterilen iyice ayrıştıktan sonra, enzim aktivitesi durdurma çözeltisi ile dört santigrat derecede beş dakika boyunca iki kez yıkayarak enzimatik reaksiyonu durdurun. Bu adımdan itibaren hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun. Hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir naylon ağdan geçirin.Daha küçük bir naylon ağ boyutu, hücre canlılığını azaltabilir. Mikroskop altında hücre canlılığını kontrol edin. Hücreleri saymadan önce peleti 5 ila 10 mililitre buz gibi soğuk tamponlu yıkama solüsyonuyla yeniden süspanse edin ve yıkayın.Birkaç kırmızı kan hücresi gözlenirse, hücrelere oda sıcaklığında iki dakika boyunca kırmızı kan hücresi lizis tamponu uygulayın. Topaklanmaların gözlendiği durumlarda, numuneler daha önce tarif edildiği gibi tripsin ile tekrar muamele edilmelidir. Canlılık %80'den azsa, canlı hücreler manyetik olarak aktive edilen hücre ayırma veya MACS MS sütunlu MACS ölü hücre temizleme kiti kullanılarak izole edilmelidir.İzole edilen pankreas dokusunun kırmızı rengi, asiner hücrelerde tdTomato ekspresyonundan kaynaklanmıştır. Ayrışmanın erken bir aşamasında, az sayıda izole hücre ve çok sayıda küme vardı. Daha sonra, canlı hücre sayısını azaltmaktan kaçınarak izole canlı hücreler elde edildi.Daha uzun inkübasyon, hücrelerin canlılığını azalttı. tdTomato pozitif hücreleri, floresanla aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak tahmin edildi. Nazik Ayrışma Protokolü, istenen hücre tiplerinin hücre sıralamasının takip edilmesine izin veren yüksek canlılık ile çoklu hücre tiplerinin geri kazanılmasını destekledi.Canlı hücreden ölü hücreye sayım bir hematiometre kullanılarak yapıldı. Donmuş pankreas kesitlerinin floresan görüntüleri, tdTomato pozitif asiner hücrelerini gösterdi. Tek hücreli RNA dizilimi, tüm zaman noktalarından rezeke edilen her dokuda floresanla aktive edilen hücre sıralamasında tespit edilen tüm hücre tiplerinin tespitini doğruladı.Asiner hücrelerde karboksipeptidaz1 veya CPA1 ekspresyonu incelenmiştir, bu da diğer hücre tiplerinin transkriptomu ile minimum kontaminasyonu gösterir. Daha uzun inkübasyon sürelerinin hücrelerin canlılığını azalttığına dikkat etmek önemlidir, bu nedenle numuneyi izlemek ve mikroskop altında birkaç dakikada bir dokunun ayrışmasını ve hücre canlılığını gözlemlemek önemlidir. Hücre izolasyon protokolü, tek hücreli RNA dizilimi, hücrelerin kültürlenmesi veya organoidler için bir başlangıç materyali olarak kullanılabilir.Bu teknik, pankreas kanserinin nasıl geliştiğini keşfetmeye ve iltihaplı veya kanserli dokuya sızan hücreler arasındaki etkileşimleri araştırmaya olanak tanır.

pancreatic-tissue-dissection-to-isolate-viable-single-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Langerhans Adacıkları olarak da adlandırılan pankreas adacıkları, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik işlevler için hormonlar üreten bir endokrin hücre kümesidir. Bu protokol, ekzokrin pankreas dokusunu sindirmek için önce Ampulla of Vater yoluyla kollajenaz perfüze ederek pankreas adacıklarını izole etmek için bir yöntemi ve adacıkları farelerden saflaştırmak için basitleştirilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüjünü açıklar.

Kollajenaz Perfüzyonu ile Pankreas Adacıkları İzolasyonu: Pankreas Adacığı Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzimatik Bir Yöntem

Lazer mikrodisseksiyon parankiminde dakika miktarlarda seçili hücrelerin iyileşme sağlayan bir tekniktir. Burada Transkriptomik çalışmaları için kullanılacak cerrahi yöntemlerle alınan insan pankreas adacık elde etmek için bir protokol açıklar. Tüm protokol böylece toplama kolaylaştırılması insan beta hücrelerinin içsel otofloresansı, geliştirir.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Burada, mezenkimal hücrelerin izolasyonu odaklanan embriyo, neonatal ve yetişkin fare doku pankreas mikro-hücrelerin izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, pankreas gelişimi, fonksiyon ve kanser oluşumunda düzenleyen dış sinyaller aydınlatmak için hücre gen ekspresyonu ve protein salgılanmasının profil sağlar.

Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases tek hücreli RNA sıralama tarafından takip endokrin hücrelerden yalıtım için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, analizleri sağlar pankreatik endokrin lineage gelişimi, heterojen ve transcriptomic dinamikleri hücre.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Bu protokol, fare endotel hücrelerinin tüm pankreastan izolasyonunu tanımlar.

Fare Pankreas Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Öğrenin, pankreas dokusundan canlı tek hücreleri izole etmek için basit ve etkili bir doku dissosiasyon protokolü. Bu yöntem, pankreas tümörleri ve ön malign lezyonların incelenmesine yardımcı olur.

Canlı Tek Hücreleri İzole Etmek için Pankreas Doku Diseksiyonu

Daha fazla video keşfet