İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi
February 24th, 2023
Bu protokol, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde DNA hasarı onarım proteinlerini değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Burada kapsamlı kaplama ve boyama yöntemlerinin yanı sıra ayrıntılı, objektif niceleme prosedürleri de bulunmaktadır.
DNA hasarı yanıtının incelenmesi, yeni hedefe yönelik tedavide yumurtalık kanseri potansiyel biyobelirteçlerinin patofizyolojisinin anlaşılmasında gereklidir. Bu teknik, numunenin bozulmadan kalmasına izin verir ve antijenlerin etki yerlerinde incelenmesine izin verir. Bu protokol hızlıdır ve immünofloresana uygun herhangi bir antijene uyarlanabilir.
Bu yöntem, kemoterapötik ve PARP inhibitörü direncinde rol oynayan yumurtalık kanseri ve DNA hasarı onarım süreçleri hakkında fikir verir. Bu yöntemler, 3D kültürlerin ve organoidlerin kullanımını içeren diğer çalışma alanlarına uygulanabilir. Başlamak için, 3B matrisini bozmadan medyayı ışınlanmış ve inkübe edilmiş organoidlerden aspire edin.
Daha sonra 300 mikrolitre PBS ile yıkayın. Organoidleri 10 dakika boyunca 300 mikrolitre% 2 paraformaldehit içinde sabitleyin. Sabitledikten sonra, organoidleri 300 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın ve beş dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
Daha sonra 300 mikrolitre geçirgenlik tamponu ekleyerek organoidi geçirgenleştirin. 20 dakikalık inkübasyondan sonra, tamponu çıkarın ve 300 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın. Organoidleri beş dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
Ardından, geçirgenlik adımını engellemek için 300 mikrolitre boyama tamponu ekleyin. Çalkalayıcıya 30 dakika boyunca yerleştirin ve bir pipet kullanarak boyama tamponunu aspire edin. Daha sonra boyama tamponunda seyreltilmiş 300 mikrolitre birincil antikor ekleyin.
16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, birincil antikor çözeltisini çıkarın. Çalkalayıcıda her biri beş dakika boyunca 300 mikrolitre boyama tamponu ile üç yıkama yapın.
Boyama tamponunda seyreltilmiş 300 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve 300 mikrolitre seyreltilmiş DAPI ekleyin. Çalkalayıcıya beş dakika boyunca yerleştirin.
Çalkalayıcıda her biri beş dakika boyunca 300 mikrolitre boyama tamponu ile üç yıkama yapın. Boyama tamponunu çıkarın ve hazne kızaklarıyla birlikte verilen sökme kitini kullanarak odaları ayırın. P200 pipet ucunun ucunu kesin ve organoid tırnak içeren her bir kuyuyu kaplayacak montaj ortamı eklemek için bunu kullanın.
Kabarcıklardan kaçınırken numunenin üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Şeffaf oje alın ve slaytı kapatmak için kapak camının kenarlarına boyayın. Bir saat sertleşmesine izin verin ve ardından 20 santigrat dereceye yerleştirin.
Daldırma yağı ile 63X objektif kullanarak konfokal mikroskop kullanarak görüntüler elde edin. Bu protokolü kullanarak, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri, ışınlamadan önce ve sonra DNA hasarı onarım proteinleri için boyandı ve DNA hasarının bir belirteci olan gama H2AX ve homolog rekombinasyon onarımı için bir belirteç olan RAD51 gibi biyobelirteçler için değerlendirildi. Replikasyon stresinin bir belirteci olan RPA, homolog olmayan enjonktüre edici bir belirteç olan 53BP1 ve GS2 faz hücre döngüsü belirteci Geminin de bu teknik kullanılarak değerlendirildi.
BME tırnakları depolimerize olma eğilimindedir, bu nedenle sabitleme ve aspirasyondan sonra çok dikkat etmek hayati önem taşır. Organoidlerin hasarını ve DNA hasar yanıtını monte etme yeteneğini belirlemek için antijenlerin analiz edilmesi, kemoterapötik direncin değerlendirilmesinde yardımcı olabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, hastalardan elde edilen over kanseri organollerinde DNA hasar onarım proteinlerini değerlendirmek için yöntemleri belirtmektedir. Kapsamlı plazma ve boyama tekniklerinin yanı sıra nesnel kantitasyon prosedürlerini içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Over kanseri araştırması
- DNA hasar yanıtı
- Organoid teknolojisi
Arka Plan
- DNA hasar yanıtını anlamak, over kanseri patofizyolojisi için kritik öneme sahiptir.
- Bu çalışma, hedefe yönelik terapi için potansiyel biyobelirteçleri araştırmaktadır.
- Protokol, antijenlerin işlevsel konumlarında incelenmesine olanak tanır.
- İmmünofloresan için uygun çeşitli antijenlere uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Over kanserinde DNA hasar onarım süreçlerini araştırmak.
- Kemosentetik ve PARP inhibitörü direncine ilişkin içgörüler sağlamak.
- 3D kültürler ve organoller içeren diğer çalışmalar için uygulanabilir yöntemler geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- 3D matrisi bozmadan ışınlanmış ve kuluçkaya bırakılmış organollerden ortamı aspirasyonu.
- Antijen incelemesi için immünofloresan kullanımı.
- Çeşitli antijenler için hızlı ve uyarlanabilir protokollerin uygulanması.
- Analizler için nesnel kantitasyon prosedürlerinin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Over kanserinde DNA hasar onarım mekanizmalarına ilişkin içgörüler.
- Kemosentetiklere direnç mekanizmalarının tanımlanması.
- Protokolün farklı antijenlere uyarlanabilirliğinin gösterilmesi.
- Yöntemlerin diğer çalışma alanlarına uygulanması potansiyeli.
Sonuçlar
- Protokol, over kanserinde DNA hasar yanıtının incelenmesi için değerli bir araç sağlar.
- Tedavi direnci mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Yöntemler, organoller içeren çeşitli araştırma bağlamlarına geniş ölçüde uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Visualizing DNA damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids using immunofluorescence enables high-content, spatially resolved biomarker analysis in disease-relevant 3D models. This approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for therapeutic strategies addressing chemoresistance. Integrating these assays at the discovery and preclinical interface supports risk-adjusted portfolio decisions in oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of DNA repair pathways and functional target validation in clinically relevant 3D tumor models.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing protein recruitment and colocalization after genotoxic stress.
- Facilitates identification of predictive biomarkers for chemotherapeutic and PARP inhibitor resistance.
Screening & Assay Development
- Establishes validated immunofluorescence workflows for quantitative protein foci analysis in organoids.
- Delivers reproducible, high-sensitivity readouts for downstream screening of DNA repair modulators.
- Enables standardization of imaging and automated foci quantification for scalable assay deployment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomarker evaluation with disease-relevant 3D models, improving translational continuity.
- Supports preclinical assessment of drug response and resistance mechanisms in patient-derived systems.
- Provides a platform for evaluating temporal and spatial dynamics of DNA repair proteins in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence assay positions within the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational biomarker validation in ovarian cancer research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of DNA repair function and pathway engagement in intact organoids.
- Screening: Provides quantitative, reproducible foci counts for comparative analysis of treatment conditions.
- Analytics: Supports automated image analysis and statistical comparison of protein localization and colocalization.
- Translational Research: Connects in vitro findings to patient-relevant resistance mechanisms and biomarker profiles.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other antigens and 3D disease models for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of resistance.
- Operational Value: Standardizes immunofluorescence workflows for reproducibility and scalability in 3D models.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking biomarker dynamics to therapeutic response.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets and resistance-modifying strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D organoid culture and immunofluorescence imaging.
- Demands access to confocal microscopy and automated image analysis software.
- Necessitates careful handling to preserve organoid integrity during processing.
- Standardization across teams is essential for reproducible quantitative outputs.
- Adaptation to other tumor types or antigens may require protocol optimization.
