Geleneksel Çin Tıbbının Mekansal Metabolomunda Tanımlanan Metabolitlerin DESI-MSI Kullanılarak Görselleştirilmesi

Bu makalede temel olarak DESI-MSI kullanarak bitki örneklerinin hazırlanması ve görüntülenmesi için uygun maliyetli bir yöntem açıklanmaktadır ve azot üflendiğinde kolayca kırılabilen kuru dokularla ilişkili dezavantajların üstesinden gelebilir. Kök, kriyostat mikrotomu üzerinde kriyokesime tabi tutulurken, yaprak pahalı makine gerektiren veya sinyal yoğunluğunu kaybeden baskı ile hazırlandı. Yöntemimiz bu sınırlamaların üstesinden gelebilir.

Bu yöntem, abiyotik ve biyotik stres altındaki bitkilerde toksik maddelerin dağılımı ve hareketi gibi bitkilerin mekansal metabolomiğinde kullanılabilir. Başlamak için, iki yaşındaki bir salvia miltiorrhiza bitkisinden temizlenmiş kökleri ve yaprakları alın ve doğrudan yaklaşık üç ila beş milimetrelik bir kesit kalınlığında dilimleyin. Ardından, numuneyi çift taraflı bant kullanarak bir yapışma mikroskobu cam slaydına yapıştırın.

Numunenin üzerine başka bir mikroskop cam sürgüsü yerleştirin ve bunları sandviç gibi bir sızdırmazlık filmi ile sarın. Daha sonra, sandviç numunesini eksi 80 santigrat derecede en az dört saat dondurun, ardından eksi 75 ila eksi 82 santigrat derecede sıkışmış sıcaklık ve 2,5 ila 3,7 paskal'da vakum göstergesi ile iki saat boyunca bir hava vakumuna maruz bırakın. Analiz için, numuneleri soğuk hava deposundan çıkardıktan sonra, numuneyi matris uygulamasına tabi tutmadan önce numune yüzeyinde yoğuşmayı önlemek için bir kurutucuda oda sıcaklığına getirin.

Cihazların dedektör kurulumunu ve kütle kalibrasyonunu elektrosprey iyonizasyonunda veya ESI modunda uygulayın. Su asetonitrilinde lösin ve sefalin kullanarak bire bir oranında dedektör kurulumu yapın ve sodyum format ve su izopropanolü ile bire bir oranında kütle kalibrasyonu yapın. ESI kaynağını dışarı çıkarın ve DESI ünitesini kütle spektrometresine monte edin.

Azot gazı beslemesini DESI ünitesine bağlayın ve gaz basıncını yaklaşık 0,5 megapaskal olarak ayarlayın. Beş mililitrelik bir şırıngayı su metanolünde lösin ve sefalin ve formik asit ile bir ila dokuz oranında doldurun ve numunedeki kimyasalların iyonizasyonu için çözücü sağlamak üzere şırıngayı yüksek performanslı şırınga pompasına takın. Daha sonra, şırıngaya ve DESI püskürtücüye solvent sağlayan bir kılcal damar takın.

Solvent sağlayan kılcal damar, 75 mikrometre iç çapa ve 375 mikrometre dış çapa sahip standart bir kılcal damardır. Şırınga pompasını çalıştırın ve çözücünün sabit bir akışını ve spreyini elde etmek için demleme hızını dakikada iki mikrolitreye ayarlayın. Azot gazı valfini kapatın ve yaklaşık 15 saniye sonra açın.

Küçük bir damla çözücü sahneye üflenir ve çözücü akışı sabit bir durumdaysa sprey görülebilir. Ardından, püskürtücünün konumunu püskürtme açısı, XYZ ekseni, çıkıntı ve yükseklik açısından ayarlayın. Hassasiyet modunda yaklaşık bir kat 10 ila beşinci arasında bir sinyal yoğunluğu elde etmek üzere kütle spektrometresi sinyalini optimize etmek için kırmızı ve siyah işaretleyicileri referans olarak kullanın.

Püskürtücünün çıkıntısı sinyal yoğunluğunu etkileyen en önemli faktör olduğundan, nitrojen gazı korumasını beş milimetrelik bir anahtar kullanarak değiştirerek çıkıntıyı ayarlayın. Sprey yönü kütle görüntüsünün kalitesini etkiler. Bu nedenle, püskürtücüyü sprey düz olana kadar döndürün.

Tüm bu adımlardan sonra, kurulum denemeler için hazırdır ve normalde ilk kurulumdan sonra yaklaşık üç haftalık kullanılabilirlik için kararlıdır. DESI-MS görüntüleme için numune ön işlemine gerek yoktur. Ancak, mümkünse slaytlardaki fazla ortamı çıkarın.

Slayttaki örneğin görüntüsünü alın. Herhangi bir safsızlığı önlemek için numunenin yüzeyine dokunmadan, slaytı iki plaka konumuna sahip DESI sahnesindeki plaka konumuna yerleştirin, A ve B.Konuma sığması için standart slaytlar veya tam bir slayt kullanın. Tam bir slayt en fazla dört slayt barındırabilir ve bu nedenle deneyler için çok daha geniş bir alana sahiptir.

Yüksek tanımlı toplu görüntü işleme yazılımını açın. Al sekmesinde yeni bir plaka ayarlayın ve doğru plaka konumunu, A veya B'yi ve plaka türünü seçin. Görüntü Seçimi sayfasında, slaydın dört köşesini seçin ve ardından görüntü otomatik olarak doğru yöne ayarlanır.

MS parametrelerini ayarlamak için, deneme türünü, yalnızca üst iyonun algılanacağı yaygın olarak kullanılan DESI-MS modu olarak seçin. Ardından, cihaz bir deneyde yalnızca bir polarite kullanabileceğinden polariteyi pozitif veya negatif olarak seçin. Ardından, küçük miktarlarda kimyasallar hakkında daha fazla bilgi edinmek için hassasiyet modunu uygulayın.

Ardından, Desen sekmesinde tarama alanını tanımlamak için bir dikdörtgen çizin ve pikselin X ve Y boyutlarını eşit tutarak piksel boyutunu ayarlayın. Tarama hızını piksel boyutunun en fazla beş katına ayarlayın. Projeyi kaydedin ve MS edinme yazılımı için bir çalışma sayfası dışa aktarın.

Ardından, çalışma sayfasını MS edinme yazılımına aktarın ve yeni bir örnek liste olarak kaydedin. MS görüntü taramasını başlatmak için Çalıştırmayı Başlat'a basın ve daha fazla çalışma sayfası içe aktarılarak deneme kuyruğuna birden çok görüntü eklenebilir. Numunenin veri dosyasını toplu görüntü işleme yazılımına yükleyin ve DESI görüntü işleme parametrelerini ayarlayın.

İç kilit kütlesi için lösin ve sefalin kullanıldığından ve kilit kütlesi deneyin polaritesini tanımlayan tek nokta olduğundan, doğru kilit kütlesini ayarlamak çok önemlidir. Pozitif mod için 556.2772 ve negatif mod için 554.2620 olarak ayarlayın. Hedef kimyasalların bir listesini oluşturmak için, numunenin DESI görüntüsünü görselleştirmek üzere işlenen veri dosyasını yükleyin.

Belirli bir kimyasalın göreceli yoğunluğunu referansa almak üzere verileri toplam iyon kromatografisi ile normalleştirmek için Normalleştirme düğmesine tıklayın ve ardından farklı örnekler birbirleriyle karşılaştırılabilir. İlgi çekici bir bölge veya YG çizin ve örnek görüntüde birkaç kopya kopyalayın. Ardından tüm YG'leri seçin ve tüm YG'lerden MS bilgilerini çıkarmak için çok değişkenli analizi dışa aktarın.

Kök ve tüm yaprak kesitlerinin kütle spektrometrisi görüntülemesi, seçilen bileşiklerin uzamsal dağılımını gösterir. Her bir pikselin rengi, kütle-yük oranının göreceli yoğunluğunu temsil eder ve bu nedenle numune boyunca metabolit iyonunun doğal dağılımı ve bolluğu ile ilişkilendirilebilir. Hedef bileşiklerin, tanshinone IIA ve rosmarinik asidin dağılımı, kökün farklı bölgelerinde görülebilir.

Yaprak bölümlerinde tanshinol A bileşiği tespit edildi Tekrarlanabilirliği amaçlayan bir protokol olarak, en önemli şey, püskürtücünün konumunu çeşitli boyutlarda ayarlayarak sinyal yoğunluğunu optimize etmektir.