Name: Domuz Beyin Dokusundan Tübülin Veriminin Optimize Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Öğrenin, domuz beyin dokusundan %99 saflıkta tübülin izolasyonu ve polimerizasyon aktivitesinin in vitro değerlendirilmesi yöntemini. Bu protokol, nörobiyoloji ve ilaç tasarımı çalışmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Nöral Dokudan Verimli Tübülin İzolasyonu

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
<li>Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+microtubule+protein+from+beef+brain+and+comparison+of+the+assembly+requirements+for+neuronal+microtubules+isolated+from+beef+and+hog%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog.</a> Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).</li>
<li>Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+and+associated+high+molecular+weight+proteins+from+porcine+brain+and+characterization+of+microtubule+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro.</a> Ann NY Acad Sci. 253, 1 The Biology o 107-132 (1975).</li>
<li>Weisenberg, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+formation+in+vitro+in+solutions+containing+low+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations.</a> Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).</li>
<li>Roychowdhury, S., Gaskin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+assembly-competent+tubulin+from+brain+microtubule+protein+preparations+using+a+fast-performance+liquid+chromatography+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure.</a> J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).</li>
<li>Weingarten, M. D., Suter, M. M., Littman, D. R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+depolymerization+products+of+microtubules+from+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain.</a> Biochemistry. 13 (27), 5529-5537 (1974).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nat Protoc. 14 (5), 1634-1660 (2019).</li>
<li>Jacobs, M., Huitorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-associated+nucleoside+diphosphokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase.</a> Eur J Biochem. 99 (3), 613-622 (1979).</li>
<li>Munguía, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+native+M.+vogae+and+H.+contortus+tubulin+by+TOG+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography.</a> Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+ExpPurif%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+%CE%B1-+and+%CE%B2-tubulin+from+Echinococcus+granulosus%3A+Expression%2C+purification+and+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization.</a> Parasite. 25, 62(2018).</li>
<li>Ti, S. -C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+affinity+tag-free+recombinant+tubulin+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells.</a> STAR protoc. 1 (1), 100011(2020).</li>
<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+and+isotypes+from+limited+sources+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22JVisExp%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles.</a> JVisExp. (165), e61826(2020).</li>
<li>Sackett, D. L., Werbovetz, K. A., Morrissette, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+tubulin+from+nonneural+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolating tubulin from nonneural sources.</a> Methods Cell Biol. 95, 17-32 (2010).</li>
<li>Modig, C., Strömberg, E., Wallin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+stability+of+posttranslationally+modified+brain+microtubules+isolated+from+cold-temperate+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Different stability of posttranslationally modified brain microtubules isolated from cold-temperate fish.</a> Mol Cell Biochem. 130 (2), 137-147 (1994).</li>
<li>Fourest-Lieuvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+limited+volumes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Exp+Purif%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from limited volumes of cultured cells.</a> Protein Exp Purif. 45 (1), 183-190 (2006).</li>
<li>MacRae, T. H., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+assembly+in+vitro+of+tubulin+from+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Purification and assembly in vitro of tubulin from Trypanosoma brucei.</a> Biochem J. 265 (1), 87-93 (1990).</li>
<li>Lazar, I. GelAnalyzer 19.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.gelanalyzer.com">www.gelanalyzer.com</a> (2024).</li>
<li>Jansen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+microtubule-associated+protein+2c+%28MAP2c%29+phosphorylation+and+regulatory+protein+14-3-3%CE%B6-binding+sites+reveals+key+differences+between+MAP2c+and+its+homolog+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22JBiol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of microtubule-associated protein 2c (MAP2c) phosphorylation and regulatory protein 14-3-3ζ-binding sites reveals key differences between MAP2c and its homolog Tau.</a> JBiol Chem. 292 (24), 3-3 (2017).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+microtubule+associated+proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of microtubule associated proteins Tau and MAP2c: Similarities and differences.</a> Biomolecules. 9 (3), E105(2019).</li>
<li>Herzog, W., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+brain+microtubule-associated+proteins%3A+Isolation+of+two+different+proteins+which+stimulate+tubulin+polymerization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of brain microtubule-associated proteins: Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro.</a> Eur J Biochem. 92 (1), 1-8 (1978).</li>
<li>Castle, A. G., Crawford, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tubulin+from+pig+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of tubulin from pig platelets.</a> FEBS Lett. 51 (1), 195-200 (1975).</li>
<li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> Int J Mol Sci. 18 (10), E2207(2017).</li>
<li>Lafanechère, L., Job, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+tubulin+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">The third tubulin pool.</a> Neurochem Res. 25 (1), 11-18 (2000).</li>
<li>Arai, T., Ihara, Y., Arai, K., Kaziro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+bovine+brain+and+its+interaction+with+guanine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from bovine brain and its interaction with guanine nucleotides.</a> J Biochem. 77 (3), 647-658 (1975).</li>
<li>Mahaddalkar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigations+into+the+binding+mode+of+a+novel+noscapine+analogue%2C+9-%284-vinylphenyl%29+noscapine%2C+with+tubulin+by+biochemical+analyses+and+molecular+dynamic+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Structural investigations into the binding mode of a novel noscapine analogue, 9-(4-vinylphenyl) noscapine, with tubulin by biochemical analyses and molecular dynamic simulations.</a> J Biomol Struct Dyn. 35 (11), 2475-2484 (2017).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+6-Aryl-2-benzoyl-pyridines+as+tubulin+polymerization+inhibitors+with+potent+antiproliferative+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel 6-Aryl-2-benzoyl-pyridines as tubulin polymerization inhibitors with potent antiproliferative properties.</a> J Med Chem. 63 (2), 827-846 (2020).</li>
<li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferulin+C+triggers+potent+PAK1+and+p21-mediated+anti-tumor+effects+in+breast+cancer+by+inhibiting+Tubulin+polymerization+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Ferulin C triggers potent PAK1 and p21-mediated anti-tumor effects in breast cancer by inhibiting Tubulin polymerization in vitro and in vivo.</a> Pharmacol Res. 152, 104605(2020).</li>
<li>Sweetnam, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor+binding+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22JNat+Prod%22%5BJournal%5D)">The role of receptor binding in drug discovery.</a> JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).</li>
<li>Qi, Z. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+1-%28benzofuran-3-yl%29-4-%283%2C4%2C5-trimethoxyphenyl%29-1H-1%2C2%2C3-triazole+derivatives+as+tubulin+polymerization+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorg Chem. 94, 103392(2020).</li>
<li>Sáez-Calvo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triazolopyrimidines+are+microtubule-stabilizing+agents+that+bind+the+vinca+inhibitor+site+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin.</a> Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).</li>
<li>Bellocq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+assembly-competent+tubulin+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EurJ+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae.</a> EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL tüpler</td><td>---</td><td>---</td> <td>Ortak malzeme</td></tr><tr><td>10 mL tüpler</td><td>---</td><td>---</td> <td>Ortak malzeme</td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td>---</td><td>---</td> <td>Ortak malzeme</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ROTH</td><td>HN35.2</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.2</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Dounce cam homojenizatör</td><td>P-LAB</td><td>H244043</td><td>Homojenizatör</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ROTH</td><td>6908.1</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>PENTA</td><td>70390-11001</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>ROTH</td><td>6967.2</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Dereceli beherler</td><td>---</td><td>---</td><td>Ortak ekipman</td></tr><tr><td>Dereceli silindir</td><td>---</td><td>---</td><td>Ortak ekipman</td></tr><tr><td>GTP</td><td>MERCK</td><td>36051-31-7</td><td>Çok yüksek kaliteli</td></tr><tr><td>HCl</td><td>PENTA</td><td>19360-11000</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Doku taşımacılığı için izolasyonlu kutu</td> <td>------</td><td></td> <td>Ortak ekipman</td></tr><tr><td>Mutfak blender</td><td>Waring</td><td>7011HB</td><td>Cam veya plastik kap</td></tr><tr><td>Sıvı azot</td><td>---</td><td>---</td> <td>Ortak malzeme</td></tr><tr><td>MES&nbsp;</td><td>ROTH</td><td>6066.4</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERCK</td><td>814733&nbsp;</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>MgSO4</sub</td><td>>PENTA</td><td>43180-31000</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>PENTA</td><td>15650-11000</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Optima XPN100</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>A94469</td><td>Ultrasantrifüj</td></tr><tr><td>Fosfoselüloz sütunu</td><td>VWR</td><td>GENO786-1291</td><td>Boş sütun</td></tr><tr><td>Fosfoselüloz reçinesi</td><td>Yaratıcı - Biomart, inc</td><td>Fosfat-001C</td><td>İyon değiştirici reçine</td></tr><tr><td>BORULAR</td><td>ROTH</td><td>9156.2</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Sakkaroz</td><td>PENTA</td><td>24970-31000</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Teraziler</td><td>------</td><td> </td><td>Ortak ekipman</td></tr><tr><td>Makas</td><td>---</td><td>---</td> <td>Ortak ekipman</td></tr><tr><td>Kaşık&nbsp;</td><td>---</td><td>---</td> <td>Plastik veya cam</td></tr><tr><td>Ti45 rotor</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>339160</td><td>Ultrasantrifüj Cımbız için Rotor</td></tr><tr><td></td><td>---</td><td>---</td><td>Ortak ekipman</td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 basic</td><td>IKA</td><td>356 1000</td><td>Laboratuvar dağıtıcısı</td></tr><tr><td>Su banyosu 37 & derece; C</td><td>---</td><td>---</td> <td>Karıştırılmış</td></tr></tbody></table>

domuz beyin dokusundan tübülin veriminin optimize edilmesi

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

Ayırma ve saflaştırma adımları sırasında, SDS-PAGE elektroforezi için numuneler alındı ve daha sonra Coomassie-blue boyama kullanılarak analiz edildi (Şekil 2). Her numunenin 20 μL'si 10 μL Laemmli numune tamponu (188 mM Tris-HCl pH 6.8, %3 SDS (a/a), 0 gliserol (h/h), 0.01 bromofenol mavisi (a/a), β-merkaptoetanol) ile karıştırıldı ve 95 °C'de 15 dakika inkübe edildi. Her numunenin 4 μL'si .5 akrilamid SDS jel üzerine yüklendi ve indirgeme ve denatüre etme koşullarında jel başına 30 mA'lık sabit bir akım altında ayrıldı.
Sonuçlar, kirletici proteinlerde bir azalma ile birlikte nispi tübülin konsantrasyonunda artımlı bir artışı doğruladı. Ayrıca, ilk santrifüjlemede (adım 3.2.7) arıtılmış lizatta, bu adımın atlanmasına kıyasla önemli bir tubulin kaybı olmamıştır (Şekil 2A, B).
Protein konsantrasyonu üç bağımsız yöntem kullanılarak belirlendi: BCA testi, Bradford protein testi ve SDS-PAGE jel dansitometri analizi19 (Şekil 3). Tarif edilen prosedürü kullanarak toplam tübülin verimi, 250 g nöral dokudan 123 mg saflaştırılmış tübülin idi. Ölçümler sırasında, depolama tamponundaki yüksek DTT konsantrasyonunun BCA testi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu dikkate almak gerekir. Hem PEM tamponu hem de PBS tamponu, DTT ilavesiyle, arka plan emilimini yaklaşık 0.900 A595 arttırır, bu da BCA testinin kapasitesini önemli ölçüde azaltır (Şekil 3A). DTT'nin olumsuz etkisi, saf su ile on kez seyreltildikten sonra bile tespit edilebilir (veriler gösterilmemiştir). Bradford testi, dansitometri analizi ile onaylandığı gibi, depolama tamponundan etkilenmiş gibi görünmedi (Şekil 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig06large.jpg" target="_blank"></a>

Domuz Beyin Dokusundan Tübülin Veriminin Optimize Edilmesi

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we ...

optimizing-tubulin-yield-from-porcine-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Video, tümöre sızan periferik kan mononükleer hücrelerinin mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim kullanılarak bir fare beyninden izolasyonunu göstermektedir. Bunu, daha fazla analiz için bağışıklık hücrelerini toplamak için yoğunluk gradyan santrifüjlemesi takip eder.

Murin Beyninden Tümör İçeren Bağışıklık Hücrelerinin İzole Edilmesi

Bu video, kılcal damarların taze domuz beyinlerinden izolasyonunu göstermektedir. İşlem, meninkslerin çıkarılmasını, gri maddenin beyin dokusundan izole edilmesini, kılcal damarları izole etmek için gri maddenin homojenleştirilmesini ve filtrelenmesini ve son olarak kılcal damarları daha da saflaştırmak için enzimatik sindirimin kullanılmasını içerir.

Domuz beyninden kılcal damarların temizlenmesi

Bu video, ötenazi uygulanmış sıçanlardan beyin mikro damarlarını izole etme sürecini göstermektedir. Beynin diseksiyonunu, dokunun temizlenmesini ve mekanik sindirimi ve ardından mikro damarların saf fraksiyonunu izole etmek için tekrarlanan santrifüjlemeyi içerir.

Sıçan Beyninden Nörovasküler Ünitelerin İzolasyonuna Yönelik Bir Yöntem

Ribozom yapısı kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş olsa da, polizomların organizasyonu hala yeterince çalışılmamıştır. Bu bilgi eksikliğinin üstesinden gelmek için, burada memeli polizomlarının hava ve sıvıda atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile doğru görüntülenmesi için ayrıntılı bir hazırlık protokolü sunuyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Bu protokol, kemirgen beynin farklı hücresel bölmeler içinde Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS) etkinliğini verimli bir şekilde ölçmek için tasarlanmıştır. Kullanıcılar, aynı hayvanlarda nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonlar içinde çalışan UPS 'i inceleyebilir, bu karmaşık analizleri gerçekleştirmek için gereken zaman ve hayvan sayısını azaltır.

Subcellular Ubiquitin ölçümü-kemirgen beyinde proteasom aktivitesi

Biz murine serebral perisit lerin çıkarılması için bir protokol sıyoruz. Antibiyotiksiz zenginleştirme odaklı perisit çıkarma dayanarak, bu protokol, böylece kullanılan deneysel hayvan sayısını azaltarak, yüksek saflık ve yüksek verim sağlayan in vitro çalışmalar için değerli bir araçtır.

Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi

Bu protokol, polimerizasyon ve depolimerizasyon döngüleri kullanılarak kültürlü hücreler veya tek fare beyinleri gibi küçük/orta ölçekli kaynaklardan tübulin saflaştırmayı açıklar. Saflaştırılmış tubulin belirli izotiplerde zenginleştirilmiştir veya spesifik posttranslational modifikasyonlara sahiptir ve mikrotübül dinamiklerini ve etkileşimlerini incelemek için in vitro rekonsiyel testlerinde kullanılabilir.

Tubulin'in Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Tübülin polimerleri olan mikrotübüller, ökaryotik hücrelerde bir hücre iskeleti bileşeni olarak çok önemli bir rol oynar ve dinamik kararsızlıkları ile bilinir. Bu çalışma, çeşitli fare dokularındaki mikrotübüllerin stabilitesini değerlendirmek için mikrotübülleri kararlı mikrotübüllere, kararsız mikrotübüllere ve serbest tübüllere ayırmak için fraksiyonlamak için bir yöntem geliştirdi.

Fare Dokularında Kararlı Mikrotübülleri, Labil Mikrotübülleri ve Serbest Tübülleri Ayırmak için Kantitatif Mikrotübül Fraksiyonlama Tekniği

Omurgalı beyin dokusunu invaze eden glioblastoma (GBM) hücrelerinde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntülenmesine izin veren bir teknik sunuyoruz. Floresan etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile şeffaf bir zebra balığı beynine bağlanması, in situ kanser invazyonu sırasında sitoiskelet dinamiklerinin ölçülmesini sağlar.

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, domuz beyin dokusundan %99 saflıkta tübülin izolasyonu ve polimerizasyon aktivitesinin in vitro değerlendirilmesi yöntemini. Bu protokol, nörobiyoloji ve ilaç tasarımı çalışmaları için temel oluşturur.

Domuz Beyin Dokusundan Tübülin Veriminin Optimize Edilmesi

Daha fazla video keşfet