Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Şu anda karaciğerin plazmodyum enfeksiyonunun biyolojisi hakkında sınırlı bir anlayışa sahibiz. Bu protokol, organizmanın biyolojisi ile ilgili bazı kritik soruları yanıtlamaya yardımcı olan birçok transgenik hat oluşturmamıza yardımcı oldu. Sıtma enfeksiyonu ile mücadele etmek için yeni araçlar ve yaklaşımlar geliştirmek için parazit ve biyolojisi hakkında temel bir anlayış gereklidir.

Burada tanımladığımız transgenez yöntemi, organizmanın yanı sıra konakçının bazı temel ve karmaşık biyolojisini deşifre etmemize yardımcı oldu. Bu prosedürü gösteren laboratuvar müdürüm Carson Bowers olacak. P.Bergehei ile enfekte olmuş fareleri ürettikten ve ötenazi yaptıktan sonra, enfekte olmuş iki fareden iki mililitre kanı steril bir ortamda beş mililitre Elsevier solüsyonuna toplayın.

Kanı oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 450 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 10 mililitre tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu tekrar santrifüjleyin ve peleti 25 mililitre tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu bir filtre kapaklı bir T75 kültür şişesine aktarın ve hücreleri süspansiyonda tutmak için hafifçe çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, numunenin 500 mikrolitresini toplayın. Peletin 10 mikrolitre tam RPMI ortamında santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin.

Sonra, ince bir kan lekesi hazırlayın. Kan yaymasını Giemsa boyası ile boyayın ve şizontların sıklığını belirleyin. Optimum transfeksiyon verimliliği için, parazitlerin% 60 ila 70'i şizont aşamasında olmalıdır.

50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 13 mililitre yoğunluk gradyan stok ortamını yeniden oluşturarak bir gradyan santrifüjleme tamponu hazırlayın. 25 mililitre kan kültürünü 50 mililitrelik taze bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, bir gradyan sütunu oluşturmak ve tampon ile ortam arasında net bir ayrım sağlamak için dar bir cam pipet kullanarak santrifüj tüpünün dibine 20 mililitre gradyan santrifüj tamponunu dikkatlice katmanlayın.

Hazırlanan tamponu ve ortamı oda sıcaklığında ara vermeden 450 G'de 20 dakika santrifüjleyin. Bir mera pipeti kullanarak, kültür ortamının ve gradyan santrifüj tamponunun arayüzündeki şizont tabakasını dikkatlice çıkarın. Yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne yerleştirin.

İzole edilmiş şizontları tam RPMI ortamında tekrar süspanse edin ve toplam hacmi 40 mililitreye yükseltin. Süpernatanı santrifüjledikten ve attıktan sonra, şizontu 10 mililitre tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra bu çözeltinin bir mililitresini her transfeksiyon için 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve enfekte olmuş hücreleri beş saniye boyunca 16.000 G'de santrifüjleme yoluyla peletleyin.

Daha sonra, oda sıcaklığında 100 mikrolitre elektroporasyon tamponunu, 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde beş mikrogram hedef plazmit DNA ile birleştirin. Enfekte olmuş hücreleri santrifüjledikten sonra, süpernatanı çıkarın ve hazırlanan nükleoefektör çözeltisi artı plazmit DNA'daki hücreleri dikkatlice yeniden süspanse edin. Ardından süspansiyonu elektroporasyona, küvetlere aktarın ve uygun bir nükleofektör programı kullanarak transfekte edin.

Ardından, küvete 100 mikrolitre tam RPMI ortamı ekleyin. Tüm çözeltiyi 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Aşılamadan iki gün sonra günlük olarak transfekte edilmiş şizont ile aşılanan farelerde parazitemi seviyelerini doğrulayın.

Enfeksiyon doğrulandıktan sonra, ilacı ağızdan vererek ve ad libitum verilen suyu içerek ilaç seçimine başlayın. Pirometimin tedavisinin başlamasından altı gün sonra başlayarak kan yaymalarını kullanarak parazitemiyi izleyin. Parazitemi en az% 1'e ulaştığında, kan evresi parazit stokları oluşturmak için parazitleri saf B6 farelerine aktarın.

Parazitemi %2 ila %5'e ulaştığında, stoklar oluşturun ve bunları dondurarak saklayın. Sivrisinek enfeksiyonundan bir gün önce, hem erkek hem de dişi sivrisineklerin bulunduğu kafesin üzerine 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış suyla dolu bir eldiven yerleştirerek dişi sivrisinekleri ayırın. Isı kaynağına çekilen dişi sivrisinekleri çıkarmak için bir böcek aspiratörü kullanın ve enfeksiyon için daha küçük bir kafese aktarın.

Sivrisinek beslenmesi ve enfeksiyonu gününde, enfekte B6 farelerinde parazitemiyi belirleyin. %2 ile %5 arasındaki parazitemi, sivrisinek enfeksiyonu için idealdir. Parazitemi doğruladıktan sonra, anestezi uygulanmış fareleri sternal yaslanma altında kafesli dişi sivrisineklerin üzerine yerleştirerek enfeksiyonu dişi sivrisineklere aktarın.

Sivrisinek beslemesi için en büyük yüzey alanını sağlamak için ön ve arka bacakları manuel olarak açın. Enfekte fareleri her kafeste 15 dakika bırakın ve farelerin uyanık olmadığından emin olmak için her beş dakikada bir kontrol edin. Beslenme tamamlandıktan ve fareler ötenazi yapıldıktan sonra, kurumun yönergelerine uyarak onları güvenli bir şekilde atın.

Sivrisineklerde başarılı bir enfeksiyonu doğrulamak için, enfeksiyondan 10 gün sonra terminal karın segmentini forseps ile çıkararak sivrisineklerin orta bağırsaklarını izole edin. Ardından, ookistlerin varlığını tespit etmek için orta bağırsakları polarize ışık altında görüntüleyin. Enfeksiyondan 18 gün sonra, mevcut sporozoitlerin sayısını değerlendirmek için beş ila 10 sivrisineği inceleyin.

Sporozoitleri izole etmek ve saymak için, göğsüne forseps veya ince bir diseksiyon iğnesi ile basınç uygularken sivrisinek başını dikkatlice çıkarın. Tükürük bezleri çıkarılan kafaya bağlı kalacaktır. Daha sonra, tükürük bezlerinden ek sivrisinek kalıntılarını çıkarın ve bunları 400 mikrolitre sivrisinek diseksiyon ortamı içeren bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.

Daha sonra izole edilmiş tükürük bezlerini 15 ila 20 kez 30 gauge iğneli bir şırıngadan geçirerek bozun, Daha sonra sivrisinek diseksiyon ortamındaki bozulmuş tükürük bezlerinin 10 mikrolitresini bir hemositometreye yerleştirin ve sayın. Son olarak, tükürük bezlerini, farelere enjeksiyon veya uzun süreli kriyo-koruma için istenen sivrisinek diseksiyon ortamı veya PBS konsantrasyonunda yeniden askıya alın. Mikroskopi gibi, parazitlenmiş fare kan kültürlerinde olgun ve olgunlaşmamış P.berghei schizont'u gösteren görüntüler sunulmaktadır.

Diseksiyon sırasında tükürük bezleri hala sağlam olan bir sivrisinek kafasının mikroskopi görüntüleri ve disseke tükürük bezinin daha düşük ve daha yüksek büyütmeler altında gösterilmesi gibi. PB, GFP 11 ile enfekte olmuş HEPA GFP bir ila 10 konakçı hücrede yeşil floresan sinyalinin üretilmesi, parazitoforöz vakuolün parçalanmasını gösterdi. Degrade arayüzünü bozmadan keson katmanını dikkatlice kaldırmak önemlidir.

Ayrıca, sporların ışık izolasyonu sırasında tükürük bezlerini kafa ile birlikte güvenilir bir şekilde çıkarmak biraz pratik gerektirir. İzolasyonu takiben, transgenik sporozoitler kriyo-korunabilir veya in vivo veya in vitro enfeksiyon çalışmaları için taze olarak kullanılabilir.