Name: Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin, transgenik Plasmodium berghei sporozoit üretim yöntemini kullanarak sıtma biyolojisini ve aşı geliştirme çalışmalarını nasıl ilerletebilirsiniz. Bu protokol parazit-birlikte yaşayan etkileşimleri anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından SPK'ya AI168307 desteklenmiştir.  UGA CTEGD Akış Sitometrisi Çekirdeğine ve UGA CTEGD Mikroskopi Çekirdeğine teşekkür ederiz. Ayrıca Ash Pathak, Anne Elliot ve UGA Sporocore personelinin protokolü optimize etmedeki katkılarını da takdir ediyoruz. Değerli içgörüler, tartışmalar ve GFP 11 ve GFP 1-10 içeren ana plazmitler için Dr. Daichi Kamiyama'ya teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Kurup laboratuvarı üyelerine sürekli destekleri, sabırları ve teşvikleri için teşekkür ederiz.

Laboratuvarımızda omurgalı hayvanlarla ilgili tüm araştırmalar, Georgia Üniversitesi hayvan kullanım yönergelerine ve protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. P. berghei ile enfekte farelerin üretimi
<ol><li>Vahşi tip P. berghei parazitleri kullanarak erkek veya dişi, 6-8 haftalık C57BL / 6 (B6) farelerinde kan evresi enfeksiyonunu başlatın. Bunu yapmak için, 400 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sulandırılan dondurularak saklanmış P. berghei ile enfekte olmuş kanı (2 x 105 enfekte RBC'ler) intraperitoneal olarak bir veya iki donör fareye aktarın (i.p.).</li>
	<li>Enfeksiyondan 5 gün sonra (d.p.i.) donör farelerden retro-orbital kanama yoluyla toplanan taze kanı iki saf B6 faresine aktarın. Bunu yapmak için, 200 μL kan toplayın, 300 μL PBS ile sulandırın ve alıcı farelere 200 μL ip enjekte edin. Bu zaman noktasında donörlerde paraziteminin %2-%5 olduğundan emin olun19,20.</li>
	<li>Parazitemiyi daha önce tarif edildiği gibiizleyin 19,20, alıcılarda 2 d.p.i.'den başlayarak. Parazitemi %3-5 (yaklaşık 5 d.p.i.) arasında değiştiğinde, alıcı farelere ötenazi yapın ve ardından kardiyak ponksiyon veya retro-orbital kanama yoluyla kan toplayın. Fareleri karbondioksit inhalasyonu ve ardından servikal çıkık kullanarak veya kurumsal yönergelere göre ötenazi yapın. NOT: Parazitemi %5'i aştığında, çoklu enfekte eritrositlerin prevalansının artması nedeniyle transfeksiyon etkinliği azalabilir.</li>
</ol>2. Kültürde şizont üretimi
<ol><li>Adım 1.3'te enfekte farelerden kan toplayın (iki fareden toplamda yaklaşık 2 mL) steril bir ortamda 5 mL Alsever çözeltisine (Malzeme Tablosuna bakınız). Steril koşullar altında 2.1'den 3.12'ye kadar olan adımları gerçekleştirin. NOT: Steril koşullar arasında eldiven giymek, eldiven ve yüzeyleri %70 etanol ile silmek, steril sarf malzemeleri ve malzemeler kullanmak ve bir biyogüvenlik kabini içinde çalışmak yer alır.</li>
	<li>Kanı oda sıcaklığında (RT) 450 x g'da 8 dakika santrifüj edin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 10 mL tam RPMI ortamında (% 20 fetal sığır serumu [FBS] ve% 1 penisilin-streptomisin, v / v ile RPMI 1640) yeniden süspanse edin.</li>
	<li>RT'de 450 x g'da 8 dakika santrifüjleyin. Peletin 25 mL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edilmesi ve filtre kapaklı bir T75 kültür şişesine aktarılması.</li>
	<li>Hücreleri 16 saat askıda tutmak için hafifçe sallarken 36.5 °C ve% 5CO2'de bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>16 saatlik zaman noktasında, schizont gelişimini kontrol edin. Bunu yapmak için, 500 μL numune toplayın, 8 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin, peleti 10 μL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve ince bir kan yayması hazırlayın. Kan yaymasını Giemsa boyası19 ile boyayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve şizontların sıklığını belirleyin (Şekil 1).</li>
	<li>Optimum transfeksiyon verimliliği için, parazitlerin% 60-70'i şizont aşamasında olmalıdır. Bu eşikten daha azı belirlenirse, adım 2.4'teki gibi kültürlemeye devam edin ve devam etmeden önce yukarıdaki eşiğin geçildiğinden emin olmak için her saat kontrol edin.</li>
</ol>3. Plasmodium şizontlarının transfeksiyonu
<ol><li>50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 1.44 mL 1.5 M NaCl ve 5.6 mL 0.15 M NaCl ile 13 mL yoğunluk gradyan stok ortamını (Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden oluşturarak bir gradyan santrifüjleme tamponu hazırlayın.</li>
	<li>25 mL kan kültürünü 50 mL'lik taze bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir gradyan sütunu oluşturmak için dar bir cam pipet kullanarak santrifüj tüpünün dibine 20 mL gradyan santrifüj tamponunu dikkatlice katmanlayın. Sıvı katmanlarını ve arayüzleri bozmamaya dikkat edin ve tampon ile ortam arasında net bir ayrım sağlayın.</li>
	<li>RT'de frensiz 450 x g'de 20 dakika santrifüjleyin. Bir Pasteur pipeti kullanarak, kültür ortamının ve gradyan santrifüj tamponunun arayüzünde bulunan şizont tabakayı15 dikkatlice çıkarın ve yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>İzole edilmiş şizontları tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve toplam hacmi 40 mL'ye getirin. RT'de 8 dakika boyunca 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Schizontları 10 mL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, bu çözeltinin 1 mL'sini her transfeksiyon için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve enfekte olmuş eritrositleri peletlemek için 5 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Yukarıdaki şekilde iki fareden türetilen enfekte RBC'ler, 10 ayrı transfeksiyona kadar kullanılabilir.</li>
	<li>RT'de 100 μL elektroporasyon tamponunu (elektroporasyon kitinden nükleofektör çözeltisi; Malzeme Tablosuna bakınız) 5 μg dairesel veya doğrusallaştırılmış hedef plazmit DNA (maksimum 10 μL hacme kadar) ile birleştirin, ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde her transfeksiyon için uygulanabilir. Transfeksiyon ve antibiyotik seçimi için bir kontrol olarak "plazmidsiz" bir numune dahil edilmelidir.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra süpernatanı adım 3.5'ten çıkarın ve enfekte olmuş RBC'leri hazırlanan nükleofektör çözeltisi + plazmit DNA'da (adım 3.6'dan itibaren) dikkatlice yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Süspansiyonu (nükleofektör çözeltisi + plazmid + şizontlar; maksimum 110 μL) elektroporasyon küvetlerine aktarın. Uygun bir nükleofektör programı kullanarak transfekt yapın (U-033, Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: 3.8 ile 3.10 arasındaki adımların RT'de gerçekleştirildiğinden emin olun.</li>
	<li>Küvete 100 μL tam RPMI ortamı ekleyin ve tüm çözeltiyi (şimdi 200 μL toplam hacim) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve RT'de tutun.</li>
	<li>Transfekte edilmiş parazitlerin 200 μL çözeltisini intravenöz olarak farelere enjekte edin (i.v.), transfeksiyon ile farelere son enjeksiyon arasındaki süreyi en aza indirmeye çalışın. NOT: Transfekte edilen şizontlar, protokolün verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için elektroporasyondan 5 dakikadan daha kısa bir süre sonra farelere enjekte edilir.</li>
</ol>4. Transfekte edilen parazitlerin seçimi
<ol><li>Enfeksiyonu doğrulamak için transfekte edilmiş şizontlarla aşılanan farelerde parazitemi seviyelerini günlük 2 d.p.i.'den kontrol edin.</li>
	<li>Enfeksiyon doğrulandıktan sonra, ilacın içme suyunda oral yoldan verilmesini kullanarak ilaç seçimine başlayın. NOT: Plazmid için seçilebilir ilaç belirteci olarak pirimetamin kullanılmıştır. Bu durumda, 250 mL temiz suya 17.5 mg pirimetamin ilave edildi (son konsantrasyon 70 mg / L). Ek olarak, pirimetamin içeren suyun fareler tarafından yeterli tüketimini teşvik etmek için bu suya 10 g şeker ilave edildi.</li>
	<li>Pirimetamin tedavisinin başlamasından 6 gün sonra başlayarak, 5 μl kanla yapılan kan yaymalarını kullanarak parazitemiyi her iki günde bir izleyin. 15 gün sonra saptanabilir parazitlerin olmaması, transfeksiyonun başarısız olduğunu gösterir; Bu durumda, yeni bir deneme için işlemi adım 1.1'den yeniden başlatın.</li>
	<li>Parazitemi en az% 1'e ulaştığında, kan evresi parazit stoklarının oluşturulması için parazitleri saf B6 farelerine aktarın. Yeni enfekte olmuş farelerde parazitemi %2-5'e ulaşana kadar seçime devam edin, bu noktada stoklar oluşturun ve bunları kriyoprezervasyonyapın 21.</li>
</ol>5. Sivrisineklerin transgenik çizgilerle enfeksiyonu
<ol><li>B6 farelerini, seçilen parazitleri içeren 200 μL kanla enfekte edin (2 x 105 enfekte RBC/fare, i.v.). Sivrisinek besleme ve enfeksiyon gününde bu farelerde parazitemiyi belirleyin. % 2 -% 5 arasındaki parazitemi, sivrisineklerin enfeksiyonu için idealdir. Doğrulandıktan sonra, enfeksiyonu hemen 5.2-5.4 adımlarına göre dişi Anopheles stephensi sivrisineklerine aktarın). NOT: Enfeksiyon için sivrisinek içeren kuluçka makineleri 20.5 °C'de, %80 nemde ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsünde tutulmalıdır (ışıklar 07:00 - 07:00 saatleri arasında açıktır).</li>
	<li>Sivrisinek enfeksiyonundan bir gün önce, hem erkek hem de dişi sivrisinekleri içeren kafesin üzerine, 37 °C'ye ısıtılmış suyla doldurulmuş ince bir plastik mesane veya eldiven gibi bir ısı kaynağı yerleştirerek dişi sivrisinekleri ayırın. Isı kaynağına çekilen dişi sivrisinekleri bir böcek aspiratörü kullanarak çıkarın ve bunları enfeksiyon için ayrı, daha küçük bir kafese aktarın. NOT: Erkek sivrisinekler, biraz küçültülmüş vücut boyutları ve tüylü antenleri ile dişi sivrisineklerden ayırt edilebilir.</li>
	<li>Enfekte farelere genel anestezik enjekte edin (ör.% 2 tribromoetanol / avertin). Her farenin ayak pedini sıkıca sıkıştırarak tam anestezi sağlayın. Reaksiyona girmezlerse, yeterince yatıştırılırlar ve enfeksiyonu sivrisineklere aktarmaya hazırdırlar.</li>
	<li>Anestezi uygulanmış fareleri, sternal yaslanma altında kafesli dişi sivrisineklerin üzerine (adım 5.2'den itibaren) yerleştirin. Sivrisinek beslemesi için en büyük yüzey alanını sağlamak için ön ve arka bacakları manuel olarak açın. Enfekte fareleri her kafesin üzerinde toplam 15 dakika bırakın ve farelerin uyanık olmadığından emin olmak için her 5 dakikada bir kontrol edin. Beslenme tamamlandıktan sonra, fareleri servikal çıkık kullanarak veya kurumsal hayvan kullanım protokolüne göre ötenazi yapın ve güvenli bir şekilde atın.</li>
</ol>6. Sporozoitlerin toplanması
<ol><li>Başarılı enfeksiyonu ve sivrisineklerde Plasmodium gelişimini doğrulamak için yaklaşık 10 d.p.i.'de sivrisinek orta bağırsaklarını ookistler açısından kontrol edin. Forseps kullanarak terminal karın segmentini çıkararak sivrisinek orta bağırsaklarını karından izole edin. Ookistlerin varlığı için orta bağırsakları polarize ışık altında görselleştirin22.</li>
	<li>Yabani tip sporozoitlerin, enfekte farelerle beslendikten 18-21 gün sonra sivrisineklerin tükürük bezlerinde bulunması beklenir. 18. günde, sporozoit sayılarını değerlendirmek için 5-10 sivrisineği inceleyin. NOT: Sivrisinekler etanolde yıkanır ve öldürülür. Daha sonra, ölü sivrisinekler diseksiyondan önce kalıntıları gidermek için PBS ile iki kez yıkanır.</li>
	<li>Sporozoitleri izole etmek ve saymak için, forseps veya ince bir diseksiyon iğnesi kullanarak sivrisinek göğsüne basınç uygularken sivrisineğin başını dikkatlice çıkarın. Tükürük bezleri çıkarılan kafaya yapışık kalır (Şekil 2).</li>
	<li>Tükürük bezlerindeki ek sivrisinek kalıntılarını çıkarın ve 400 μL sivrisinek diseksiyon ortamı içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin (Dulbecco'nun %1 fare serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren modifiye Ealge ortamı [DMEM]; bkz.</li>
	<li>İzole edilen tükürük bezlerini 30 G iğneli bir şırıngadan 15-20 kez geçirerek bozun. Sivrisinek diseksiyon ortamındaki bozulmuş tükürük bezlerinin 10 μL'sini bir hemositometreye yerleştirin ve sayın. Farelere enjeksiyon, hücre kültürlerine aşılama veya uzun süreli kriyoprezervasyon için istenen sivrisinek diseksiyon ortamı veya PBS konsantrasyonunda yeniden süspanse edin23,24.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geneva%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Geneva.</a> World Health Organization. , 1(2020).</li>
<li>Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria%3A+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Malaria: biology and disease.</a> Cell. 167 (3), 610-624 (2016).</li>
<li>Crompton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+immunity+in+man+and+mosquito%3A+insights+into+unsolved+mysteries+of+a+deadly+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease.</a> Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).</li>
<li>Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-erythrocytic+vaccines+against+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Pre-erythrocytic vaccines against malaria.</a> Vaccines. 8 (3), 400(2020).</li>
<li>Balu, B., Adams, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+transfection+technologies+for+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Advancements in transfection technologies for Plasmodium.</a> International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).</li>
<li>Rodriguez, A., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+parasites+accelerate+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transgenic parasites accelerate drug discovery.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).</li>
<li>Voorberg-vander Wel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+fluorescent+Plasmodium+cynomolgi+reporter+line+reveals+in+vitro+malaria+hypnozoite+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation.</a> Communications Biology. 3, 7(2020).</li>
<li>Christian, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+transgenic+parasites+and+host+reporters+to+dissect+events+that+promote+interleukin-12+production+during+toxoplasmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis.</a> Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).</li>
<li>Montagna, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+export+during+liver+infection+of+the+malaria+parasite+augments+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity.</a> mBio. 5 (4), e01321(2014).</li>
<li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites-recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).</li>
<li>Siciliano, G., Alano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlightening+the+malaria+parasite+life+cycle%3A+bioluminescent+Plasmodium+in+fundamental+and+applied+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 391(2015).</li>
<li>Othman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+transgenic+parasites+in+malaria+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">The use of transgenic parasites in malaria vaccine research.</a> Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).</li>
<li>Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+genetically+arrested+parasites+%28GAPs%29+for+a+precision+malaria+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198(2017).</li>
<li>Otto, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+rodent+malaria+parasite+genomes+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression.</a> BMC Biology. 12, 86(2014).</li>
<li>Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+and+drug+selection+of+genetically+transformed+blood+stages+of+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei.</a> Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).</li>
<li>Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+gametocyte+culture+and+mosquito+infection+through+artificial+membrane+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).</li>
<li>Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+large-scale+isolation+of+Plasmodium+berghei+sporozoites+from+infected+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes.</a> The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).</li>
<li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046(2016).</li>
<li>Bailey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline%3A+the+laboratory+diagnosis+of+malaria.+General+Haematology+Task+Force+of+the+British+Committee+for+Standards+in+Haematology%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology.</a> British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).</li>
<li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+literature+review+of+microscopy+methods+reported+in+malaria+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).</li>
<li>de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+berghei+ANKA+%28PbA%29+infection+of+C57BL%2F6J+mice%3A+a+model+of+severe+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).</li>
<li>Musiime, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+that+a+real+oocyst%3F+Insectary+establishment+and+identification+of+Plasmodium+falciparum+oocysts+in+midguts+of+Anopheles+mosquitoes+fed+on+infected+human+blood+in+Tororo%2C+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda.</a> Malaria Journal. 18 (1), 287(2019).</li>
<li>Marques-da-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+type+I+interferon+signaling+in+hepatocytes+controls+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria.</a> Cell Reports. 40 (3), 111098(2022).</li>
<li>Bowers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+Plasmodium+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of Plasmodium sporozoites.</a> Pathogens. 11 (12), 1487(2022).</li>
<li>Zander, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1-like+plasmodium-specific+memory+CD4%2B+T+cells+support+humoral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity.</a> Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Laboratuvarımızda birkaç transgenik P. berghei paraziti hattı oluşturmak için yukarıdaki protokolü kullandık. P. berghei için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu protokolü transgenik P. yoelii sporozoitleri üretmek için de başarıyla kullandık. Transfekte edilen şizontları farelere enjekte ettikten sonra, parazitler tipik olarak en geç 3 d.p.i. plazmid kontrolü de dahil olmak üzere tüm gruplarda. Elektroporasyonu takiben parazitlerin yaşayabilirliğini sağlamak için sadece parazitemi tespit edil...

İlaç geliştirme ve sıtmanın önlenmesi ve tedavisine yönelik araştırmalardaki ilerlemelere rağmen, sıtmanın küresel hastalık yükü yüksek olmaya devam etmektedir. Her yıl yarım milyondan fazla insan sıtmadan ölüyor ve en yüksek ölüm oranları Sahra altı Afrika gibi sıtmanın endemik olduğu bölgelerde yaşayan çocuklar arasında görülüyor1. Sıtmaya, paraziti tükürük bezlerinde taşıyan dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla insanlara bulaşan parazit Plasmodium neden olur. Plasmodium'un enfeksiyöz aşaması - sporozoitler - bir kan yemeği sırasında omurgalı konakçıların derisinde birikir ve eritrositleri enfekte etmeden önce zorunlu gelişime (eritrosit öncesi sıtma oluşturan) maruz kaldıkları karaciğer hücrelerini enfekte etmek için kan dolaşımından geçer. Eritrositlerin enfeksiyonu sıtmanın kan evresini başlatır ve hastalıkla ilişkili morbidite ve mortalitenin tamamından sorumludur 2,3.
Plasmodium'un eritrositik gelişiminin zorunlu doğası, onu profilaktik aşı ve ilaç geliştirme çabaları için çekici bir hedef haline getirmiştir4. Pre-eritrositik sıtmanın biyolojisinin yanı sıra karaciğer evresini hedef alan aşıların veya ilaçların geliştirilmesini incelemek için bir ön koşul, Plasmodium sporozoitlerine erişimdir. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş Plasmodium sporozoitleri üretme yeteneğimiz, bu tür araştırma çabalarının başarısında etkili olmuştur 5,6,7,8,9. Floresan veya ışıldayan raportör proteinleri eksprese eden Transgenik Plazmodyum hatları, gelişimlerini in vivo ve in vitro olarak izlememize izin verdi 10,11. Plasmodium'daki çoklu genlerin silinmesi yoluyla üretilen genetik olarak zayıflatılmış parazitler (GAP'ler) de en umut verici aşı adaylarından bazılarıdır12,13.
Kemirgen ve insan olmayan primat sıtma modelleri, Plasmodium türleri arasındaki biyoloji ve yaşam döngüsündeki benzerlikler nedeniyle insan sıtmasında konak-parazit etkileşimlerinin mekanizmalarını anlamamıza yardımcı olmuştur14. Kemirgenleri enfekte eden, ancak insanları enfekte etmeyen Plasmodium türlerinin (örneğin, P. berghei) kullanımı, tüm parazit yaşam döngüsünün sürdürülmesine ve kontrollü, biyogüvenlik seviyesi 1 ortamında karaciğer evresi sıtmanın incelenmesi için enfeksiyöz sporozoitlerin üretilmesine izin verir. Transgenik kan evresi Plasmodium parazitlerinin15, sivrisineklerin16 enfeksiyonu ve sporozoitlerin17 izolasyonu için çeşitli ayrı protokoller zaten mevcuttur. Burada, örnek olarak yeni transgenik suş PbGFP11'i kullanarak, transgenik P. berghei sporozoitlerini üretmek ve izole etmek için bu metodolojileri birleştiren kapsamlı bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. PbGFP 11, süper klasör yeşil floresan proteinin (GFP) 11. β iplikçiğini, GFP11'i, konakçı hepatositlerde üretilen parazitoforöz vakuole (PV) aktarır. PbGFP 11, sitoplazmada (Hepa GFP 1-10 hücreleri) GFP 1-10 fragmanını (GFP 1-10) oluşturan kalıntıları eksprese eden transgenik hepatositler (Hepa1-6 arka planı) ile birlikte kullanılır. PbGFP11, kendi kendini tamamlama ve fonksiyonel GFP ve yeşil floresan sinyalinin18 yeniden oluşturulması yoluyla konakçı hepatositlerde PV lizizini bildirir. GFP 11'in, ortaya çıkan floresan sinyalini geliştirmek için PbGFP11'de yedi tandem dizisinden oluşan bir dizi olarak kodlandığını unutmayın. PbGFP11 sporozoitlerini sitoplazmik boya CellTrace Violet (CTV) ile boyadıktan sonra parazitleri izleyebiliriz. Bu tür CTV ile boyanmış hücre içi parazitlerin parçalanması, CTV'nin konak hücre sitoplazmasına sızmasına ve konak hücrenin boyanmasına neden olur. Plasmodium PV ve/veya konakçı hepatositlerdeki parazitin parçalanmasını görselleştirmeye ve ayırt etmeye ek olarak, bu sistem, bu yolların moleküler bileşenlerinin genetik veya terapötik bozulması yoluyla, bu süreçlerden herhangi birinden sorumlu bağışıklık yollarını incelemek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>30 G x 1/2 "Şırınga iğnesi</td><td>Exel international</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>Alsever'in çözümü</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>A3551-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Temel Parazit Nükleofektör Kiti 2</td><td>Lonza</td><td>VMI-1021</td><td></td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromoetanol)</td><td>TCI America</td><td>T1420</td><td></td></tr><tr><td>Kan alma tüpleri</td><td>BD bioscience</td><td>365967</td><td>Serum toplama için</td></tr><tr><td>C-Chip tek kullanımlık hematositometre</td><td>INCYTO</td><td>DHC-N01-5</td><td></td></tr><tr><td>CellVeiw Hücre Kültürü Kabı</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627860</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5425</td><td>Eppendorf</td><td>5405000107</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5910R</td><td>Eppendorf</td><td>5910R</td><td>Gradyan santrifüjleme için</td></tr><tr><td>Delta Vision II - Ters mikroskop sistemi</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Sigma</td><td>D5879-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>GenClone</td><td>25-525</td><td></td></tr><tr><td>GFP11 plazmid</td><td>Kurup Lab</td><td>pSKspGFP11</td><td>PL0017 plazmidinden üretilmiştir</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>48900-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Hepa GFP1-10 hücreleri</td><td>Kurup Lab</td><td>Hepa GFP1-10</td><td>Hepa 1-6 hücrelerinden üretilir (ATCC Cat# CRL-1830)</td></tr> <tr><td>Sivrisinek diseksiyon ortamı için kullanılan</td> <td>Fare Serumu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SX0420-5</td><td>Percoll çözeltisi için 1.5 M ve 0.15 M</td></tr><tr><td>Nükleofektör II</td><td>Amaxa Biosystems (Lonza)</td><td></td><td>RBC elektroporasyonu için kullanılan U-033 Programı</td></tr><tr><td>Pasteur pipeti</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (Yoğunluk gradyanı stok ortamı)</td> <td>Cytivia</td><td>17-0891-02</td><td>Protokoldeki ayrıntılar</td></tr><tr><td>PL0017 Plazmid</td><td>BEI Kaynakları</td><td>MRA-786</td><td></td></tr><tr><td>Pirimetamin (oral uygulama için)</td> <td>Sigma</td><td>46706</td><td>Hazırlık detayları: 2.5 mL DMSO'ya 17.5 mg Pirimetamin ekleyin. Girdap, tamamen çözülmesi gerekiyorsa; HCL kullanarak 225 mL dH2O'nun pH'ını 4'e ayarlayın. DMSO'ya Pirimetamin ekleyin ve 250 mL'ye getirin. Düzenli olarak ilaçlı su tüketimini teşvik etmek için 10 g şeker ekleyin. Pirimetamin ışığa duyarlıdır. Fareleri tedavi ederken koyu renkli şişe veya alüminyum folyo kaplı şişe kullanın.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>SoftWoRx mikroskopi yazılımı</td><td>Uygulamalı Hassasiyet</td><td>v6.1.3</td><td></td></tr></tbody></table>

genetiği değiştirilmiş plasmodium berghei sporozoitlerinin Üretilmesi

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Sıtma, parazit Plasmodium'un neden olduğu ölümcül bir hastalıktır ve dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla bulaşır. Omurgalı konakçıların derisinde sivrisinekler tarafından biriktirilen Plasmodium'un sporozoit aşaması, klinik sıtmaya başlamadan önce karaciğerde zorunlu bir gelişim aşamasına girer. Karaciğerdeki Plasmodium gelişiminin biyolojisi hakkında çok az şey biliyoruz; sporozoit aşamasına erişim ve bu tür sporozoitleri genetik olarak değiştirme yeteneği, Plasmodium enfeksiyonunun doğasını ve karaciğerde ortaya çıkan bağışıklık tepkisini incelemek için kritik araçlardır. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitlerinin üretimi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Kan evresi P. berghei'yi genetik olarak değiştiriyoruz ve bu formu kan yemeği aldıklarında Anofel sivrisineklerini enfekte etmek için kullanıyoruz. Transgenik parazitler sivrisineklerde geliştikten sonra, in vivo ve in vitro deneyler için parazitin sporozoit aşamasını sivrisinek tükürük bezlerinden izole ediyoruz. Yeşil floresan protein (GFP) alt birimi 11'i (GFP11) eksprese eden yeni bir P. berghei suşunun sporozoitlerini üreterek protokolün geçerliliğini gösteriyoruz ve karaciğer evresi sıtmanın biyolojisini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Şizontların sıklığını ve gelişimini belirlemek, yeterli sayıda canlı parazitin transfeksiyon için en uygun aşamada olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Olgunlaşmamış şizontlar, RBC'nin tüm hücre içi boşluğunu doldurmayan daha az merozoitin varlığı ile tamamen olgun şizontlardan ayırt edilebilir (Şekil 1B). Kültürlenmiş kandan kan yayması yapılırken, enfekte olmuş eritrositlerin kırılabileceğini ve bunun da kan yaymasında serbest, hücre dışı merozoitlerin gözlenmesine neden olabilece...

Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Şu anda karaciğerin plazmodyum enfeksiyonunun biyolojisi hakkında sınırlı bir anlayışa sahibiz. Bu protokol, organizmanın biyolojisi ile ilgili bazı kritik soruları yanıtlamaya yardımcı olan birçok transgenik hat oluşturmamıza yardımcı oldu. Sıtma enfeksiyonu ile mücadele etmek için yeni araçlar ve yaklaşımlar geliştirmek için parazit ve biyolojisi hakkında temel bir anlayış gereklidir.Burada tanımladığımız transgenez yöntemi, organizmanın yanı sıra konakçının bazı temel ve karmaşık biyolojisini deşifre etmemize yardımcı oldu. Bu prosedürü gösteren laboratuvar müdürüm Carson Bowers olacak. P.Bergehei ile enfekte olmuş fareleri ürettikten ve ötenazi yaptıktan sonra, enfekte olmuş iki fareden iki mililitre kanı steril bir ortamda beş mililitre Elsevier solüsyonuna toplayın.Kanı oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 450 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 10 mililitre tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu tekrar santrifüjleyin ve peleti 25 mililitre tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin.Hücre süspansiyonunu bir filtre kapaklı bir T75 kültür şişesine aktarın ve hücreleri süspansiyonda tutmak için hafifçe çalkalayarak inkübe edin. İnkübasy

generating-genetically-modified-plasmodium-berghei-sporozoites

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Anofel stephensi sivrisinekler, sıtma yaşayan Hindistan ve Asya'da vektörleri. Bu video bu türün sivrisinek sıtma karşı direnç kazandırırlar transgenlerin microinjections gerçekleştirmek için teknik göstermektedir. Bu video gösterdi metodoloji diğer sivrisinek türlerinin mikroenjeksiyon teknikleri uygulanabilir.

Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl...

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Bu videoda, floresan raportör proteini kodlayan plazmit DNA'sını tavuk Eimeria parazitinin sporozoit formuna iletmek için elektroporasyon tabanlı bir transfeksiyon prosedürü olan nükleofeksiyonu açıklıyoruz.

Parazit Formlarının Nükleofeksiyonu: Floresan Protein Kodlayan Plazmitleri Sporozoit Çekirdeğine Vermek için Elektroporasyon Tabanlı Bir Transfeksiyon Yöntemi

Bu video, serebral sıtmanın deneysel bir fare modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Plasmodium berghei ile enfekte dişi sivrisineklerden izole edilen sporozoitler, kısıtlanmış bir farenin kuyruk damarlarına enjekte edilir, bu da kan-beyin bariyerinin bozulmasına ve beyin iltihabına yol açarak serebral sıtmaya neden olur. Bu enfekte fare modeli, serebral sıtma ile ilişkili in vivo mikrovasküler patolojiyi incelemek için değerli bir araç sunar.

Konakçı sivrisinek türevli sporozoitler kullanılarak deneysel serebral sıtmanın bir fare modelinin oluşturulması

Bu video, bir fare modelini canlı zayıflatılmış sporozoitlerle bağışıklamak için bir testi göstermektedir. Radyasyonla zayıflatılmış Plasmodium sporozoitler, farenin kulağının sırt tarafına enjekte edilir. Her iki kulakta birden fazla yere enjeksiyonlardan sonra, farenin iyileşmesine izin verilir.

Bir Fare Modelinde Canlı Zayıflatılmış Sporozoitlerle İntradermal Bağışıklama

Burada, Plasmodium sporozoitlerinin intradermal enjeksiyonunu takiben fare derisinden miyeloid hücreleri izole etmek ve lenf düğümünü boşaltmak için bir protokol açıklıyoruz. Toplanan hücrelerin akış sitometrisi, cildi karakterize etmek ve parazite karşı drenaj lenf nodu inflamatuar yanıtını karakterize etmek için güvenilir bir test sağlar.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Deneysel serebral sıtmanın bir fare modelini tarif ediyoruz ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak inflamatuar ve mikrovasküler patolojinin in vivo olarak nasıl izlenebileceğini gösteriyoruz.

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Biz glmSoluşturmak için bir yöntem tarif- Plasmodium falciparum CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak koşullu devirme mutantlar dayalı.

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Plasmodium cinsel gelişimi sivrisinek orta bağırsağında meydana gelir. Parazitin cinsel aşamalarını hedeflemek, bulaşmayı engellemek için umut verici bir stratejidir. Zigot oluşumundan sonra nanolusiferaz eksprese eden transgenik bir P. berghei olan Ookluc'u geliştirdik ve iletim bloke edici bileşiklerin yüksek verimli taramasını sağladık. Bu makale, Ookluc kullanarak tarama yöntemlerini detaylandırmaktadır.

Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı

Öğrenin, transgenik Plasmodium berghei sporozoit üretim yöntemini kullanarak sıtma biyolojisini ve aşı geliştirme çalışmalarını nasıl ilerletebilirsiniz. Bu protokol parazit-birlikte yaşayan etkileşimleri anlamanıza yardımcı olur.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Daha fazla video keşfet