Name: Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Keşfedin endodermal hepatik organoid üretim protokolünü. Bu yöntemle iki haftada fonksiyonel eHEPO'lar oluşturabilir ve bir yıldan uzun süre kültürde tutabilirsiniz. Karaciğer biyolojisi ve rejeneratif tıp araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Huch, M., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Marsee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+definition+and+nomenclature+of+hepatic%2C+pancreatic%2C+and+biliary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+and+reproducible+production+of+liver+buds+entirely+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+organoids+for+the+analysis+of+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases.</a> JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).</li>
<li>Ramli, M. N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Akbari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+culture+of+endoderm-derived+hepatic+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Meisenheimer, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proluciferin+acetals+as+bioluminogenic+substrates+for+cytochrome+P450+activity+and+probes+for+CYP3A+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition.</a> Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).</li>
<li>Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+ADME+evaluation%3A+dialing+in+CYP+selectivity+with+luminogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).</li>
<li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminogenic+cytochrome+P450+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Luminogenic cytochrome P450 assays.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+liver+medicine+using+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-generation liver medicine using organoid models.</a> Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+organization+in+hepatocyte+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological organization in hepatocyte organoid cultures.</a> American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).</li>
<li>Shinozawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+drug-induced+liver+injury+screen+using+human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids.</a> Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatobiliary+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>37 &derece; C su banyosu</td><td>N&uuml; ve</td><td>210.NB9</td><td></td></tr><tr><td>37 &derece; C, %5 CO2 inkübatör</td><td>Memmert</td><td>INCO 153</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; m ve 40 &mikro; m Hücre süzgeci</td><td>Doğan</td><td>352350/ 352340</td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td>Sigma</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>A1AT</td><td>Abcam</td><td>AB166610</td><td>Seyreltme: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>A-83.01 (TGF-&beta; inhibitör)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>İzolatör</td><td>9,01,026</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkanlı Mikroskop Lamı</td><td>Histobond</td><td>C981040</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>AFP</td><td>Abcam</td><td>AB3980</td><td>Seyreltme: 1/25 (IHC)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>EMS</td><td>10200</td><td></td></tr><tr><td>ALB</td><td>Abcam</td><td>ab10241</td><td>Seyreltme: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Alexa Un 488 (Fare)</td><td>Davetli</td><td>A11001 Serisi</td><td>Seyreltme: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Un 488 (Tavşan)</td><td>Davetli</td><td>A110034</td><td>Seyreltme: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Un 594 (Fare)</td><td>Davetli</td><td>A11005 Serisi</td><td>Seyreltme: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa un 594 (Tavşan)&nbsp;</td><td>Davetli</td><td>A11037 Serisi</td><td>Seyreltme: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Amonyak Test Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK-310 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-202936 (İngilizce)</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviye Edici Gıdası 50x</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Temel kalıp</td><td>Sakura</td><td>4216</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik, SINIF II, GÜVENLİK KABİNİ</td><td>Termo</td><td>GÜVENLİ 2020</td><td></td></tr><tr><td>Kalibre edilmiş pipetler</td><td>Gilson'ın</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Merkezkaç</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Kolilglisilamidido-floresein</td><td>Corning</td><td>451041</td><td></td></tr><tr><td>Sitrat Tamponu pH 6.0</td><td>Biyo-optik</td><td>15-M103</td><td></td></tr><tr><td>CK-18</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-51582</td><td>Seyreltme: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>CK-19 Serisi</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6278</td><td>Seyreltme: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM880 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik kullanım eldivenleri ve göz koruması</td><td>Cryokit</td><td>5274</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Kriyoviyal tüpler</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Roche</td><td>11718096001</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5942 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8426 Serisi</td><td>Seyreltme: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Davetli</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Sigma500 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>ELISA kiti</td><td>Fortis yaşam bilimleri etil</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812 Gömme Kiti</td><td>EMS</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>Eozin Y %1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110332</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>Seyreltme: 1/11 (FACS)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1,00,98,32,511</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26010066</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin (FSK)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Dondurucu konteyner (Mr. Frosty)</td><td>Termo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Dondurucu Ortam</td><td>Gibco</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pastör pipeti</td><td>İzolatör</td><td>084.01.001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit %25, EM sınıfı</td><td>EMS</td><td>16210-1L</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare HRP</td><td>Termo Balıkçı</td><td>62-6520</td><td>Seyreltme: 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan HRP</td><td>Termo Balıkçı</td><td>31460</td><td>Seyreltme: 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Keçi Serumu</td><td>Gibco</td><td>162-10-072</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>Kırlangıç</td><td>HX86017674</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4&alfa;</td><td>Abcam</td><td>AB55223</td><td>Seyreltme: 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>Buz ve kuru buz</td><td>Ev yapımı</td><td>Ev yapımı</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör (65 &derece; C)</td><td>N&uuml; ve</td><td>EN 400 Standardı</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>Leu15 Gastrin I insan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Luminometre</td><td>Berthold Teknolojisi</td><td>LB 960 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Ana karışım&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>43676659</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrisi, hESC Onaylı</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrisi, fenol-kırmızı-içermez</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Axygen</td><td>321-02-501</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AKSİYO VERT A1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom bıçağı</td><td>Tüy</td><td>S35, C35</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>SC-05850</td><td></td></tr><tr><td>Çok kuyulu süspansiyon kültür plakaları</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,21,500</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi 100x</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-Asetilsistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Nötr Tamponlu Formalin %10</td><td>Tekkim</td><td>TK.60161.05001</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asit (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>EKİM</td><td>Doku-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetroksit</td><td>EMS</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo Testleri kit&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V9001 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Pap-kalem</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Parafin</td><td>Tekkim</td><td>TK.200661.01002</td><td></td></tr><tr><td>PAS leke kiti</td><td>Abcam</td><td>AB150680</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>be17-516</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Fosfotungustik asit</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>Pipet yardımı</td><td>Axygen</td><td>Motopet-1</td><td></td></tr><tr><td>Plaka okuyucu varioskan flaş&nbsp;</td><td>Termo</td><td>5250040</td><td></td></tr><tr><td>Antifade Mountant'ı Uzat</td><td>Davetli</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Propilen Oksit, EM sınıfı</td><td>EMS</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı PCR sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>7500 Hızlı&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan Aktivin A</td><td>R& D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan BMP7</td><td>Peprotech</td><td>120-03</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan EGF'si</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan FGF19</td><td>Peprotech</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan HGF'si</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Rho kinaz inhibitörü, Y-27632 dihidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase içermeyen 1,5 mL tüp</td><td>Axygen</td><td>31108101</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase içermeyen filtre uçları</td><td>Sarstedt</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>Döner Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM 2245</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Rspo1 koşullu ortam</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asıl slayt</td><td>Biyo-optik</td><td>15-MEQ001</td><td></td></tr><tr><td>Sorenson' s Fosfat Tamponu</td><td>EMS</td><td>11600-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Termo</td><td>BENIM DÖNÜŞÜM 6</td><td></td></tr><tr><td>Steril serolojik pipetler</td><td>Doğan</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kaseti</td><td>Leica</td><td>3802240</td><td></td></tr><tr><td>Düzelt -ici</td><td>Leica</td><td>EM TRIM2</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Termo Bilimsel</td><td>28314</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Ekspres Enzimi</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Uranilasetat</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Girdap</td><td>Termo</td><td>88880018</td><td></td></tr><tr><td>Wnt Vekil-Fc Füzyon Proteini</td><td>İmmünoHassas</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>16446</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Davetli</td><td>40-2200</td><td>Seyreltme: 1/400 (IF)</td></tr></tbody></table>

fonksiyonel endodermal hepatik organoidlerin Üretimi

Generation of Functional Endodermal Hepatic Organoids

İlk olarak, insan fibroblast hücreleri veya periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) hücreleri kültürlendi ve epizomal yeniden programlama yoluyla iPSC'lere dönüştürüldü. Taze nakavt serumu, sağlıklı iPSC'ler elde etmek için gerekliydi. Daha sonra, iPSC'ler% 50 -% 60 birleşme ile BMM kaplı kültür plakalarına ekildi. Küçük/orta büyüklükte iPSC kolonilerine sahip olmak, farklılaşma verimliliğini artırdı. Daha sonra, iPSC'ler 5 gün boyunca Activin A, Wnt3a ve R-spo1 faktörlerini içeren besiyeri ile kesin endoderm...

Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Organoid technology has allowed us to generate a variety of human organ-like mini structures, such as for the liver, brain, and intestine, in vitro. The ...

Araştırmamız, klinik öncesi çalışmalarda sağlıklı ve hastalıklı karaciğer dokularını yakından taklit ederek, ilaç etkinliği ve güvenlik testleri için insanla ilgili in vitro karaciğer modelleri geliştirmeyi amaçlamaktadır. Tam karaciğer karmaşıklığını yeniden üretmek, uzun vadeli işlevsellik elde etmek, protokolleri standartlaştırmak ve yüksek verimli uygulamalar için organoid üretimini ölçeklendirmek, organoid araştırmalarında büyük bir deneysel zorluk olmaya devam etmektedir. Yakın zamanda sağlıklı hepatik organoidlerden karaciğer fibrozunu modelledik ve hasta kaynaklı hücrelerden sitrüllinemi ve piruvat karboksilaz eksikliği dahil olmak üzere karaciğer nadir hastalık modelleri oluşturduk. Diğer yöntemlerden farklı olarak, eHEPO protokolümüz, fonksiyonel karaciğer organoidlerini hızlı ve geniş ölçekte sağlayarak, uzun vadeli işlevselliği ve tutarlı bir başlangıç popülasyonundan çoklu tahlilleri destekler.[Anlatıcı] Başlamak için, 15 mililitrelik konik bir tüpe 6 mililitre soğuk DMEM/F-12 ekleyin. Tüpe hemen 80 mikrolitre FOD bazal membran matrisi veya BMM ekleyin ve iyice karıştırın. Doku kültürü ile işlenmiş bir kuyucuk plakasını BMM solüsyonu ile kaplayın ve solüsyonu kuyu plakası yüzeyini kaplayacak şekilde dağıtın. Plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde en az bir saat inkübe edin. İndüklenebilir bir pluripotent kök hücre veya IPSC plakası alın ve IPSC'ye özgü ortamı aspire edin. Plakayı DMEM/F-12 veya DPBS ile durulayın ve 6 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna 1 mililitre spesifik enzim ekleyin. Bir dakika inkübe ettikten sonra enzimi aspire edin ve plakayı 37°C'de beş ila yedi dakika inkübe edin. Daha sonra, plakaya 1 mililitre önceden ısıtılmış IPSC ortamı ekleyin ve farklılaşmamış koloni agregalarını plakanın yüzeyinden ayırmak için yan tarafa hafifçe vurun. Süspansiyonu 5 mililitrelik bir serolojik pipetle hafifçe karıştırın ve ardından hücre süspansiyonunu istenen yoğunlukta BMM kaplı kuyucuğa tohumlayın. %70'lik bir birleşme noktasına ulaşmak için hücreleri üç ila beş gün boyunca 37°C'de inkübe edin. Farklılaşmaya başlamadan önce IPSC ortamını endoderm ortamıyla değiştirin. Hücreler, farklılaşmadan sonra hücre-hücre etkileşimini gösteren dikenli bir şekil kazanır. Endoderm hücrelerini PBS ile durulayın. 300 mikrolitre tripsin ekleyin. Ve hücreleri inkübatörde beş dakika inkübe edin. Hücrelere 3 mililitre soğuk DMEM/F-12 ekleyin ve tek hücreler oluşturmak için 1.000 mikrolitrelik filtre uçlarıyla pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti 10 mililitre FACS tamponu ile yıkayın. Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için, hücre süspansiyonunu beş dakika santrifüjlemeden önce hücreleri 100 mikrometrelik bir ağ süzgeci ve ardından 40 mikrometrelik bir ağ süzgeci ile süzün. 105 mikrolitre FACS tamponu ile 15 milyon hücreyi yeniden süspanse edin ve süspansiyona 45 mikrolitre FcR ve 15 mikrolitre EpCAM ekleyin. Tüpü ışıktan koruyarak hücreleri 4°C'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu yıkamak için 500 mikrolitre FACS tamponu ekleyin. Hücreleri santrifüjledikten sonra, peleti 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve ölü hücreleri ölçmek için hücre süspansiyonuna mililitre DAPI başına 0,5 mikromolar ekleyin. Hücre sıralamasından sonra, hücreleri beş dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Ve 20 mikrolitre BMM'de 3.000 ila 5.000 hücreyi yeniden süspanse edin. Her 48 oyuklu plakanın ortasına bir damla BMM ekleyerek hücreleri tohumlayın ve BMM katılaşana kadar hücreleri 37 ° C'de iki dakika inkübe edin. Damlacığı genleşme ortamıyla kaplayın. Organoid damlacığı bölmek için organoid ortamı atın ve kuyuya 500 mikrolitre soğuk Ad-DMEM/F-12 ekleyin. BMM damlacıklarını kuvvetli bir şekilde pipetlemek için 1.000 mikrolitrelik filtre uçları kullanın. 15 mililitrelik konik tüplere maksimum 10 BMM damlacığı toplayın ve 5 mililitre soğuk Ad-DMEM/F-12 ekleyin. Tüpü üç ila beş dakika buzun üzerine koyun. Hücreleri 200 x g'da 4°C'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 1 mililitre süpernatan kalana kadar atın. 200 mikrolitrelik filtre uçlarını kullanarak hücre peletini 30 ila 40 kez kuvvetlice pipetleyin. Mekanik ayrışmadan sonra, hücreleri beş dakika santrifüjlemeden önce 5 mililitre soğuk Ad-DMEM/F-12 ekleyin. Süpernatanı atın. Ve süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin. 50 mikrolitrelik bir BMM damlacığı tohumlayın. Ve genleşme ortamına mililitre BMP7 başına 25 nanogram ekleyin. Üç gün kültürlemeden sonra, ortamı farklılaşma ortamı ile değiştirin ve hücreleri en az 14 gün boyunca kültürleyin. EpCAM+ hücrelerinden kaynaklanan organoidlerin hepatik soya bağlı olup olmadığını doğrulamak için bir immün boyama analizi yapıldı. CK19+ ve HNF4ɑ+ hücrelerinin varlığı, organoidlerde hepatoblast ve safra kanalı progenitör hücrelerinin bulunduğunu gösterir. Ek olarak, E-CAD+ hücreleri ve ZO-1'i eksprese eden kübik veya çokyüzlü epitel hücreleri gibi epitel dokusu belirteçlerini eksprese eden organoidler, hücreler arasında sıkı bağlantıların varlığını gösterir. İmmünohistokimya, E-CAD+ hücrelerinin hepatosit benzeri bir fenotipi yansıtan poligonal bir epiteloid yapı gösterdiğini ortaya çıkardı. eHEPO'ların transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri burada gösterilmektedir. Beyaz daireler hücreler arası bağlantı komplekslerini gösterir. Siyah oklar apikal yüzey farklılaşmasını gösterir. Ve kırmızı ok, mikrovillusun enine bir kesitini gösterir. qPCR analizi, organoidlerin ALB, A1AT, CYP3A4 ve CYP3A7 gibi olgun hepatosit belirteçleri kazandığını gösterdi. PAS boyamada pembe lekeli alan, organoidlerin glikojen depolama kapasitesini gösterir. Ek olarak, analizimiz organoidlerin ALB'yi kültür ortamına salgılama, kültür ortamından amonyağı ortadan kaldırma, CYP3A4 enzim aktivitesi ve safra asidi taşıma kapasitesi yeteneğini gösterdi.

generation-of-functional-endodermal-hepatic-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Bu iletişim kuralı bir fare extrahepatic safra kanalını 3 boyutlu organoid sistemi üretimi açıklar. Bu safra organoids cholangiocyte Biyoloji çalışma kültüründe korunabilir. Safra organoids işaretleri hem yaratıcı hem de safra hücreleri hızlı ve polarize epitel hücrelerinin oluşmaktadır.

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Bu protokol, insan pluripotent hücrelerinin bağırsak organoidlerine farklılaşmasına izin verir. Protokol, hücreleri kesin endoderm, arka bağırsak endodermi ve ardından bağırsak epiteli popülasyonuna farklılaştırarak normal insan gelişimini taklit eder. Bu, protokolü hem bağırsak gelişimini hem de hastalık modelleme uygulamalarını incelemek için uygun hale getirir.

Gelişimsel ve Hastalık Modelleme Uygulamaları için hiPSC Kaynaklı Bağırsak Organoidlerinin Üretilmesi

Fare hepatatitlerinden uzun süreli ek vitro 3D organoid kültür sistemi kuruldu. Bu organoidler shRNA/ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu ile geçiş ve genetik olarak manipüle edilebilir.

Murine Hepatosit Organoidlerinin Kurulması ve Genetik Manipülasyonu

Bu makalede, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021'in kesin endoderm (DE) olarak sürekli olarak takviye edilmesiyle insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC' ler) fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere (HLC) farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Hepatosit Benzeri Hücre İndüksiyonu İçin Etkili Bir Yöntem

Burada, insan pluripotent kök hücre kaynaklı ince bağırsak ve kolonik organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi ve karakterize edilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tekrarlanabilirliği artırmak, ölçeklenebilirliği genişletmek ve organoidlerin kaplanması ve geçirilmesi için gereken çalışma süresini azaltmak için tasarlanmıştır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Hepatoselüler karsinom (HCC) organoid oluşumu için organoid kültivasyonun tüm aşamalarını kapsayan mevcut protokollere kapsamlı bir genel bakış ve iyileştirme sunuyoruz. Bu sistem, potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve ilaç adaylarının etkinliğinin değerlendirilmesi için değerli bir model görevi görmektedir.

Potansiyel Hedef Belirleme ve İlaç Keşfi için İnsan Hepatoselüler Karsinomu Hasta Kaynaklı Organoid Modelinin Geliştirilmesi ve Optimizasyonu

Organoidler, organ geliştirme, ilaç keşfi ve hastalık araştırmaları için kişiselleştirilmiş doku modellemesinde devrim yaratıyor. Organoid mühendisliği, karmaşık sentetik dokular oluşturmaya doğru ilerler. Amaç, doku mühendisliğini ilerletmek için morfogenez, assembloid teknolojisi ve biyomatrisleri entegre etmektir. Bu protokol, karaciğer organogenezinin modellenmesine ve sentetik doku yapımı için kılavuzların oluşturulmasına yardımcı olur.

Karaciğer Organogenezini Modellemek, Assembloidler Oluşturmak ve İnsan Hücre Hatlarını Kullanarak Sentetik Dokular Tasarlamak için İn Vitro Yetiştirme Teknikleri

Bu protokol, bir sıçan modelinde optimize edilmiş iki aşamalı kollajenaz karaciğer perfüzyon tekniği sunar ve in vitro uzun süreli 3D organoid kültürü için izole hepatositlerin kullanımını gösterir.

Sıçan Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepatosit İzolasyonu: Son Teknoloji 3D Organoid Kültürü İçin Çok Önemli Eski Bir Prosedür

Keşfedin endodermal hepatik organoid üretim protokolünü. Bu yöntemle iki haftada fonksiyonel eHEPO'lar oluşturabilir ve bir yıldan uzun süre kültürde tutabilirsiniz. Karaciğer biyolojisi ve rejeneratif tıp araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Daha fazla video keşfet