Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Araştırmamız, klinik öncesi çalışmalarda sağlıklı ve hastalıklı karaciğer dokularını yakından taklit ederek, ilaç etkinliği ve güvenlik testleri için insanla ilgili in vitro karaciğer modelleri geliştirmeyi amaçlamaktadır. Tam karaciğer karmaşıklığını yeniden üretmek, uzun vadeli işlevsellik elde etmek, protokolleri standartlaştırmak ve yüksek verimli uygulamalar için organoid üretimini ölçeklendirmek, organoid araştırmalarında büyük bir deneysel zorluk olmaya devam etmektedir. Yakın zamanda sağlıklı hepatik organoidlerden karaciğer fibrozunu modelledik ve hasta kaynaklı hücrelerden sitrüllinemi ve piruvat karboksilaz eksikliği dahil olmak üzere karaciğer nadir hastalık modelleri oluşturduk. Diğer yöntemlerden farklı olarak, eHEPO protokolümüz, fonksiyonel karaciğer organoidlerini hızlı ve geniş ölçekte sağlayarak, uzun vadeli işlevselliği ve tutarlı bir başlangıç popülasyonundan çoklu tahlilleri destekler.

[Anlatıcı] Başlamak için, 15 mililitrelik konik bir tüpe 6 mililitre soğuk DMEM/F-12 ekleyin. Tüpe hemen 80 mikrolitre FOD bazal membran matrisi veya BMM ekleyin ve iyice karıştırın. Doku kültürü ile işlenmiş bir kuyucuk plakasını BMM solüsyonu ile kaplayın ve solüsyonu kuyu plakası yüzeyini kaplayacak şekilde dağıtın. Plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde en az bir saat inkübe edin. İndüklenebilir bir pluripotent kök hücre veya IPSC plakası alın ve IPSC'ye özgü ortamı aspire edin. Plakayı DMEM/F-12 veya DPBS ile durulayın ve 6 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna 1 mililitre spesifik enzim ekleyin. Bir dakika inkübe ettikten sonra enzimi aspire edin ve plakayı 37°C'de beş ila yedi dakika inkübe edin. Daha sonra, plakaya 1 mililitre önceden ısıtılmış IPSC ortamı ekleyin ve farklılaşmamış koloni agregalarını plakanın yüzeyinden ayırmak için yan tarafa hafifçe vurun. Süspansiyonu 5 mililitrelik bir serolojik pipetle hafifçe karıştırın ve ardından hücre süspansiyonunu istenen yoğunlukta BMM kaplı kuyucuğa tohumlayın. %70'lik bir birleşme noktasına ulaşmak için hücreleri üç ila beş gün boyunca 37°C'de inkübe edin. Farklılaşmaya başlamadan önce IPSC ortamını endoderm ortamıyla değiştirin. Hücreler, farklılaşmadan sonra hücre-hücre etkileşimini gösteren dikenli bir şekil kazanır. Endoderm hücrelerini PBS ile durulayın. 300 mikrolitre tripsin ekleyin. Ve hücreleri inkübatörde beş dakika inkübe edin. Hücrelere 3 mililitre soğuk DMEM/F-12 ekleyin ve tek hücreler oluşturmak için 1.000 mikrolitrelik filtre uçlarıyla pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti 10 mililitre FACS tamponu ile yıkayın. Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için, hücre süspansiyonunu beş dakika santrifüjlemeden önce hücreleri 100 mikrometrelik bir ağ süzgeci ve ardından 40 mikrometrelik bir ağ süzgeci ile süzün. 105 mikrolitre FACS tamponu ile 15 milyon hücreyi yeniden süspanse edin ve süspansiyona 45 mikrolitre FcR ve 15 mikrolitre EpCAM ekleyin. Tüpü ışıktan koruyarak hücreleri 4°C'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu yıkamak için 500 mikrolitre FACS tamponu ekleyin. Hücreleri santrifüjledikten sonra, peleti 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve ölü hücreleri ölçmek için hücre süspansiyonuna mililitre DAPI başına 0,5 mikromolar ekleyin. Hücre sıralamasından sonra, hücreleri beş dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Ve 20 mikrolitre BMM'de 3.000 ila 5.000 hücreyi yeniden süspanse edin. Her 48 oyuklu plakanın ortasına bir damla BMM ekleyerek hücreleri tohumlayın ve BMM katılaşana kadar hücreleri 37 ° C'de iki dakika inkübe edin. Damlacığı genleşme ortamıyla kaplayın. Organoid damlacığı bölmek için organoid ortamı atın ve kuyuya 500 mikrolitre soğuk Ad-DMEM/F-12 ekleyin. BMM damlacıklarını kuvvetli bir şekilde pipetlemek için 1.000 mikrolitrelik filtre uçları kullanın. 15 mililitrelik konik tüplere maksimum 10 BMM damlacığı toplayın ve 5 mililitre soğuk Ad-DMEM/F-12 ekleyin. Tüpü üç ila beş dakika buzun üzerine koyun. Hücreleri 200 x g'da 4°C'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 1 mililitre süpernatan kalana kadar atın. 200 mikrolitrelik filtre uçlarını kullanarak hücre peletini 30 ila 40 kez kuvvetlice pipetleyin. Mekanik ayrışmadan sonra, hücreleri beş dakika santrifüjlemeden önce 5 mililitre soğuk Ad-DMEM/F-12 ekleyin. Süpernatanı atın. Ve süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin. 50 mikrolitrelik bir BMM damlacığı tohumlayın. Ve genleşme ortamına mililitre BMP7 başına 25 nanogram ekleyin. Üç gün kültürlemeden sonra, ortamı farklılaşma ortamı ile değiştirin ve hücreleri en az 14 gün boyunca kültürleyin. EpCAM+ hücrelerinden kaynaklanan organoidlerin hepatik soya bağlı olup olmadığını doğrulamak için bir immün boyama analizi yapıldı. CK19+ ve HNF4ɑ+ hücrelerinin varlığı, organoidlerde hepatoblast ve safra kanalı progenitör hücrelerinin bulunduğunu gösterir. Ek olarak, E-CAD+ hücreleri ve ZO-1'i eksprese eden kübik veya çokyüzlü epitel hücreleri gibi epitel dokusu belirteçlerini eksprese eden organoidler, hücreler arasında sıkı bağlantıların varlığını gösterir. İmmünohistokimya, E-CAD+ hücrelerinin hepatosit benzeri bir fenotipi yansıtan poligonal bir epiteloid yapı gösterdiğini ortaya çıkardı. eHEPO'ların transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri burada gösterilmektedir. Beyaz daireler hücreler arası bağlantı komplekslerini gösterir. Siyah oklar apikal yüzey farklılaşmasını gösterir. Ve kırmızı ok, mikrovillusun enine bir kesitini gösterir. qPCR analizi, organoidlerin ALB, A1AT, CYP3A4 ve CYP3A7 gibi olgun hepatosit belirteçleri kazandığını gösterdi. PAS boyamada pembe lekeli alan, organoidlerin glikojen depolama kapasitesini gösterir. Ek olarak, analizimiz organoidlerin ALB'yi kültür ortamına salgılama, kültür ortamından amonyağı ortadan kaldırma, CYP3A4 enzim aktivitesi ve safra asidi taşıma kapasitesi yeteneğini gösterdi.