Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve Adeno İlişkili Virüs Tek Kılavuzlu RNA Sistemi Kullanılarak Kahverengi Yağa Özgü Nakavt Farelerin Üretimi
24 Mart 2023
Bu protokolde, kombine bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sisteminden yararlanarak kahverengi yağ dokusuna (BAT) özgü nakavt fareleri üretmek için teknik prosedürleri açıklıyoruz. Açıklanan adımlar, sgRNA'ların tasarımını, AAV-sgRNA parçacıklarının hazırlanmasını ve AAV'nin BAT loblarına mikroenjeksiyonunu içerir.
Bu protokol, bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno ilişkili virüs tek kılavuzlu RNA sistemi kullanarak kahverengi yağa özgü nakavt fareleri üretir. AAV'yi kahverengi yağa güvenli bir şekilde uygulamak için cerrahi bir teknik içerir. Bu tekniğin temel avantajı, fareleri seçici olarak yetiştirmeye gerek kalmadan dokuya özgü nakavtları hızla üretebilmesidir.
Dokuya özgü nakavt veya nakavt yapma yaklaşımı, AAV enjekte etmek için cerrahi prosedür hedef organa göre değiştirilirse diğer dokulara uyarlanabilir. Başlamak için, postoperatif ağrı ve sıkıntıyı en aza indirmek ve önlemek için anestezi uygulanan UCP1 Cre Cas9 fareye analjezik deri altından uygulayın. Daha sonra kürkü bir tıraş makinesi kullanarak interskapuler bölgesinde tıraş edin ve cerrahi alanı iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovmanın en az üç alternatif turu ve ardından% 70 etanol ile sterilize edin.
Bir neşter kullanarak, interskapular yağları açığa çıkarmak için skapula arasındaki kahverengi yağ dokusunun üzerindeki deride iki santimetrelik bir kesi yapın. Tek bir kesi yaptıktan sonra yağ dokularının distal bölgesi ile kaslar arasındaki sınırdaki yağ dokularını kesin. Daha sonra baskın eldeki cerrahi makası kullanarak, kahverengi yağ dokusunu açığa çıkarmak için yağ dokularını künt ve dikey olarak soyun, kahverengi yağ dokusu da dahil olmak üzere yağ dokularını baskın olmayan el ile sıkıştırın.
Sulzer'in damarını, kesin kahverengi yağ dokusu yerini belirtmek için bir dönüm noktası olarak kullanın. Daha sonra, her fare için, 100 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasına bağlı keskin bir 32 gauge iğne kullanarak iki kahverengi yağ dokusunun her bir lobuna yavaşça 20 mikrolitre adeno ilişkili virüs veya AAV enjekte edin. AAV uygulaması sırasında enjekte edilen bölgeden sızıntı olmadığını gösteren başarılı enjeksiyonu onaylayın.
Homeostazı sağladıktan sonra, 5-0 emilebilir bir monofilament iplik kullanarak yağ dokularının ve kasın kenarını dikmek için maruz kalan yağ dokularını normal konumlarına geri yerleştirin. Son olarak, açık cildi 5-0 kaplamalı VICRYL boyasız örgülü ipliklerle dikin. Kahverengi yağ dokusunun kesin yeri, maruz kalmadan tespit edilemez, ancak dokuya aşırı maruz kalma hasarı.
Başarısız enjeksiyonlara yol açabilecek potansiyel kusurlar, AAV çözeltisinin yanlış bölgeye enjekte edilmesini, dokudan iğne penetrasyonunu ve AAV çözeltisinin aşırı hacmi nedeniyle doku balonlaşmasını içeriyordu. AAV tek kılavuz RNA'nın kahverengi yağ dokusuna hassas bir şekilde verilmesi, protokolün başarısı için çok önemliydi. Kahverengi yağ dokusunu açığa çıkarırken başarının anahtarı, makasın yönü ve derinliği ve Hamilton şırıngasının yeri de dahil olmak üzere cerrahi makas tekniğidir.
Bu teknik, kahverengi yağ ile ilgili enerji metabolizmasının moleküler düzenleyicilerini anlamak için yük üreten dokuya özgü nakavt hayvanlarına sahiptir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol; Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno-ilişkili virüs (AAV) tek kılavuz RNA tekniklerinin bir kombinasyonunu kullanarak kahverengi yağ dokusuna (BAT) özgü nakavt fareler oluşturma yöntemini tanımlamaktadır. Bu yöntemler kullanılarak araştırmacılar, seçici üretimle uğraşmaya gerek kalmadan hızla dokuya özgü nakavtlar oluşturabilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Genetik
- Hücre biyolojisi
- Moleküler biyoloji
Arka Plan
- Kahverengi yağ dokusu enerji metabolizması için kritik öneme sahiptir.
- Dokuya özgü nakavtların (knockout) oluşturulması, biyolojik süreçlerin anlaşılmasına yardımcı olur.
- Bu yöntem potansiyel olarak diğer dokular için de uyarlanabilir.
Kullanılan Yöntemler
- Cre-LoxP ve CRISPR-Cas9 yaklaşımlarının uygulanması.
- Kullanılan fare modeli: UCP1 Cre Cas9 fareleri.
- AAV-sgRNA'nın cerrahi mikroenjeksiyon yoluyla uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Kahverengi yağ dokusunun başarılı şekilde hedeflenmesi ve nakavt edilmesi.
- Dokuya özgü gen düzenlemede AAV'nin etkinliğinin kanıtlanması.
- Hassas iletim için temel cerrahi tekniklerin doğrulanması.
Sonuçlar
- Çalışma, kahverengi yağ metabolizmasıyla ilgili nakavt modelleri oluşturmak için hızlı bir tekniği ortaya koymaktadır.
- Enerji metabolizmasındaki moleküler düzenleyicilerin anlaşılmasını geliştirmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik
Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve AAV-sgRNA teknolojileri kullanılarak kahverengi yağ dokusu (BAT) spesifik nakavt farelerin hızla üretilmesi, metabolik araştırmalarda fonksiyonel genomiğin hızlandırılmasını sağlar. Bu yaklaşım, enerji regülasyonunda rol oynayan genler için hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırarak, geleneksel yetiştirme yöntemlerine kıyasla döngü sürelerini kısaltır. Yöntem, erken keşif ve translasyonel süreklilik için kritik olan dokuya özgü içgörüler sunarak portföy kararlarını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Mekanistik netlik için BAT'daki gen fonksiyonunun doğrudan sorgulanmasına olanak tanır.
- Hastalıkla ilişkili bir dokuda gen etkilerini izole ederek biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Metabolik bozukluklar için hedef seçiminde öngörüsel güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt akışlı fenotipik taramalar için valide edilmiş nakavt modelleri sağlar.
- Tekrarlanabilir kantitatif okumalar için genetik arka planları standartlaştırır.
- Uzun yetiştirme döngülerini atlayarak analiz geliştirme sürecini hızlandırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- BAT'ye özgü gen düzenleme yoluyla preklinik modelleri insan metabolik hastalık mekanizmalarıyla uyumlu hale getirir.
- Enerji metabolizmasına gen katkısını netleştirerek riskle uyumlu bir ilerleme sağlar.
- Metabolik araştırmalarda, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken keşif ve hedef doğrulama aşamalarına entegre olarak, metabolik ve endokrin araştırma portföyleri için preklinik model geliştirmeye yönelik bir köprü sağlar.
- Keşif Biyolojisi: BAT aracılı enerji düzenlemesinde hipotez testlerini ve yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Kantitatif fenotipik analizler için tekrarlanabilir nakavt modelleri sağlar.
- Analitik: Metabolik çıktılar üzerindeki gene özgü etkilerin in vivo ölçümüne olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Preklinik modellerin insan BAT biyolojisiyle uyumlu hale getirilmesini kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: AAV iletimi modifiye edilerek diğer dokulara uyarlanabilen protokol, daha geniş bir Ar-Ge kullanımını destekler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış, tekrarlanabilir prosedürlerle model oluşturma sürecini optimize eder.
- Stratejik Değer: Daha hızlı karar verme süreçlerini ve sermaye açısından verimli kaynak tahsisini sağlar.
- Portföy Etkisi: Metabolik ve endokrin hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Cerrahi mikroenjeksiyon ve BAT'ın anatomik lokalizasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- AAV üretimine ve CRISPR-Cas9 genetik mühendisliği altyapısına erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilirlik için ekipler arası titiz bir standardizasyon gerektirir.
- Diğer dokuları veya organları hedeflemek için protokol adaptasyonu gereklidir.
- Başarı, hassas AAV iletimine ve doku hasarının minimize edilmesine bağlıdır.
