Name: Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Öğrenin yüksek hızlı manyetik cımbız kurulumunu kullanarak DNA saç tokaları ve SNARE kompleksleri üzerinde nanomekanik ölçümler yapmayı. Bu yöntem mekanobiyolojik olayları anlamak için 1,2 kHz hızında gerçek zamanlı izleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi tarafından desteklenmiştir (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 ve NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. NMG hibesi (2021R1C1C2009717) tarafından desteklenmiştir.

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Bu çalışmada, biyomoleküllerin yapısal değişikliklerini yüksek uzaysal zamansal hassasiyette gözlemleyebilen tek moleküllü bir kuvvet spektroskopisi kurulumunu tanıttık. Kullanılan yüksek hızlı CMOS kamera, 1.280 x 1.024 çözünürlükte 1.200 kare s−1 elde ederek 1,2 kHz boncuk izleme sağlar. Bununla birlikte, ölçümlerin hızı şu anda boncuk izleme yazılımı ile sınırlıdır, bu nedenle yatırım getirisi genellikle yüksek hızlı ölçümlerde daha küçük alanlara indirgenir. SLD'nin yüksek gücü, birkaç kHz bant genişliğine...

Hücreler mekanik uyaranları aktif olarak algılar ve bunlara yanıt verir. Bunu yaparken, birçok biyomolekül dinamik yapısal değişiklikleri mümkün kılan kuvvete bağımlı özellikler gösterir. İyi takdir edilen örnekler arasında, hücrelere çevrelerinden önemli mekanik bilgiler sağlayan mekanosensitivite iyon kanalları ve sitoiskelet elemanları bulunur.
Ek olarak, benzersiz bir kuvvet taşıyan nitelik gösteren moleküller, daha geniş anlamda mekanosensitif olarak da kabul edilebilir. Örneğin, nükleik asit dublekslerinin lokal oluşumu ve erimesi, ayrıca G-dörtlüleri gibi daha yüksek dereceli yapılar, replikasyon, transkripsiyon, rekombinasyon ve daha yakın zamanda genom düzenlemede çok önemli roller oynamaktadır. Dahası, sinaptik iletişimde yer alan bazı nöronal proteinler, tipik moleküller arası etkileşimlerin seviyelerini aşan fiziksel kuvvetler üreterek işlevlerini yerine getirirler. Hangi örnek üzerinde çalışılırsa çalışılsın, ilgili biyomoleküllerin nanomekaniğini yüksek uzaysal zamansal hassasiyetle araştırmak, ilişkili mekanobiyolojik süreçlerin moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmada oldukça yararlı olacaktır 1,2,3.
Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi yöntemleri, biyomoleküllerin mekanik özelliklerini incelemek için güçlü araçlar olarak hizmet etmiştir 2,4,5,6. Nükleik asit ve proteinlerdeki yapısal değişiklikleri kuvvet uygulamasıyla eşzamanlı olarak izleyebilir, böylece kuvvete bağlı özellikleri inceleyebilirler. İyi bilinen iki kurulum, moleküllerimanipüle etmek için mikron boyutunda boncuklar kullanan optik cımbız ve manyetik cımbızdır (MT'ler), 5,6,7,8 moleküllerini manipüle eder. Bu platformlarda, polistiren (optik cımbız için) veya manyetik boncuklar (MT'ler için), tipik olarak çift sarmallı DNA'nın (dsDNA) kısa parçalarından yapılmış moleküler "tutamaklar" aracılığıyla hedef moleküllere (örneğin, nükleik asitler ve proteinler) bağlanır. Boncuklar daha sonra kuvvet uygulamak için hareket ettirilir ve hedef moleküllerdeki yapısal değişiklikleri bildiren konumlarını izlemek için görüntülenir. Optik ve manyetik cımbızlar uygulamalarında büyük ölçüde birbirinin yerine geçebilir, ancak kuvveti kontrol etme yaklaşımlarında önemli farklılıklar vardır. Optik cımbızlar, boncukları pozisyonda tutan doğal olarak pozisyon kelepçeli aletlerdir, çünkü bir hedef yapı şekil değişikliklerine uğradığında uygulanan kuvvet dalgalanır; Açılma gibi uzatma artışı, bağlantıyı gevşetir ve gerginliği azaltır ve bunun tersi de geçerlidir. Optik cımbızdaki kuvveti kontrol etmek için aktif geri bildirim uygulanabilse de, MT'ler aksine, doğal olarak çevresel bozulmaya da dayanabilen kalıcı mıknatısların kararlı, uzak alan manyetik kuvvetlerinden yararlanan bir kuvvet kelepçeleme cihazı olarak çalışır.
Uzun geçmişlerine ve basit tasarımlarına rağmen, MT'ler, büyük ölçüde hızlı boncuk izlemedeki teknik zorluklar nedeniyle, yüksek hassasiyetli ölçümlere uygulamalarında optik cımbızların gerisinde kalmıştır. Bununla birlikte, son zamanlarda, birkaç grup MT enstrümanları için hem donanım hem de yazılımın çok yönlü bir şekilde geliştirilmesine öncülük etmiştir 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Bu çalışmada, 1.2 kHz'de çalışan böyle bir kurulumun bir örneğini tanıtıyoruz ve kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde nanomekanik ölçümler yapmak için nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. Model sistemler olarak, DNA saç tokalarını ve nöronal SNARE komplekslerini kullanıyoruz ve pikonewton rejimindeki hızlı, yapısal değişikliklerini inceliyoruz. DNA saç tokaları, iyi tanımlanmış bir kuvvet aralığı20,21'de basit iki durumlu geçişler sergiler ve bu nedenle cımbız kurulumunun performansını doğrulamak için oyuncak modeller olarak hizmet eder. SNARE proteinleri, membran füzyonu22'yi yönlendiren kuvvete duyarlı bir kompleks halinde bir araya geldikçe, tek moleküllü kuvvet spektroskopisi 14,23,24,25 ile de kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Verileri analiz etmek ve termodinamik ve kinetik hakkında yararlı bilgiler çıkarmak için standart yaklaşımlar sunulmaktadır. Bu makalenin, mekanobiyolojik çalışmalarda yüksek hassasiyetli MT'lerin benimsenmesini kolaylaştırabileceğini ve okuyucuları kendi kuvvete duyarlı ilgi sistemlerini keşfetmeye motive edebileceğini umuyoruz.

kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Tek moleküllü manyetik cımbızlar (MT'ler), nükleik asitler ve proteinler gibi biyomolekülleri zorla sorgulamak için güçlü araçlar olarak hizmet etmiştir ve bu nedenle mekanobiyoloji alanında yararlı olmaya hazırdır. Yöntem genellikle manyetik boncukların görüntü tabanlı izlenmesine dayandığından, görüntülerin kaydedilmesi ve analiz edilmesindeki hız sınırının yanı sıra boncukların termal dalgalanmaları, hedef moleküllerdeki küçük ve hızlı yapısal değişiklikleri gözlemlemede uygulanmasını uzun zamandır engellemiştir. Bu makalede, biyomoleküllerin ve komplekslerinin nano ölçekli, milisaniyelik dinamiklerini çözebilen yüksek çözünürlüklü bir MT kurulumunun yapımı ve işletilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Uygulama örnekleri olarak, DNA saç tokaları ve SNARE kompleksleri (membran-füzyon makineleri) ile yapılan deneyler, geçici durumlarının ve geçişlerinin pikonewton ölçekli kuvvetlerin varlığında nasıl tespit edilebileceğine odaklanarak gösterilmiştir. Yüksek hızlı MT'lerin, hücrelerdeki kuvvetleri algılayan, ileten ve üreten moleküller üzerinde yüksek hassasiyetli nanomekanik ölçümler yapmaya devam edeceğini ve böylece moleküler düzeyde mekanobiyoloji anlayışımızı derinleştireceğini umuyoruz.

Kuvvet kalibrasyonu İki kuvvet ölçüm yönteminden (boncukların yanal yer değiştirme varyansı ve güç spektrumu analizi) elde edilen sonuçlar 0-2 pN arasında farklılık göstermiştir (Şekil 2G). Şekil 2F'deki sonuçlara göre, normal neodimyum mıknatıslarla 30 pN'ye kadar güvenilir bir şekilde ulaşabiliriz.
8 bp DNA saç tokasının iki durumlu geçişleri İlk önce kısa bir DNA saç tokasının nanomekaniğini ...

Burada, kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde maksimum 1.2 kHz hızında nanomekanik ölçümler yapan yüksek hızlı bir manyetik cımbız kurulumunu açıklıyoruz. DNA saç tokalarına ve SNARE komplekslerine model sistemler olarak uygulanmasını tanıtıyoruz, ancak mekanobiyolojik olaylarda yer alan diğer moleküllere de uygulanabilecektir.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Biyomoleküller, genellikle kuvvete yanıt olarak küçük ve hızlı yapısal değişikliklere uğrarlar. Yüksek çözünürlüklü manyetik cımbız, fizyolojik olarak ilgili kuvvetler altında bu dinamikleri keşfedebilir. Yöntem, nano ölçekli ölçümleri milisaniye hassasiyetiyle yaptığından, nükleik asitlerdeki ve proteinlerdeki ince değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek mümkündür.İlk yatak ve mekanosensitif proteinlerdeki arızalar potansiyel olarak kardiyovasküler ve kas-iskelet sistemi bozukluklarına yol açabilir. Manyetik cımbız, bu proteinlerin çalışma mekanizmaları hakkında fikir verebilir. İyi çözünürlükler elde etmek için set düzgün bir şekilde hizalanmalı ve kalibre edilmelidir.Ayrıca, ölçümler için moleküler yapıların hazırlanması ve tanımlanması sırasında dikkatli olunmalıdır. Titreşim önleyici optik masaya ters çevrilmiş bir mikroskop kurarak başlayın. Ardından, yüksek hızlı bir CMOS kamera ve bir çerçeve tutucu takın.3D'de mıknatıs manipülasyonu için bir çeviri aşaması oluşturmak üzere manuel bir XY aşamasına 20 milimetreden fazla hareket uzunluğuna sahip motorlu bir doğrusal sahneyi dikey olarak monte edin. Ardından, mıknatıs dönüşü için bir döner step motor ve bir kayış ve kasna

high-speed-magnetic-tweezers-for-nanomechanical-measurements-on-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Biz kısmen akson zarı yapışık bir optik-tuzak prob yapılan eş zamanlı kuvvet spektroskopisi ölçümü ile bir lazer disektör ile lezyonlanmıştır olan bir akson gerginlik serbest ölçtük. Geliştirilen Deneysel protokol, kültür alt tabakaya yapışma akson değerlendirir.

Lazer Bağlı Akson Lezyon sırasında Gerilim Film ölçümü Piconewton ve Milisaniye Çözünürlük de Yüzey için aksonal yapışma değerlendir

Manyetik cımbız, güçlü bir tek moleküllü manipülasyon teknikleri, biyolojik makromoleküllerin (manyetik bir tork cımbız olarak adlandırılan bir konfigürasyonu kullanılarak) ve tork (manyetik cımbız serbestçe yörüngeli adı konfigürasyonu kullanılarak) bükümün doğrudan ölçümleri için uyarlanabilir. Bu tür ölçümler yapmak için rehber DNA ve ilgili nükleotid protein filamanların çalışma uygulamaları da dahil olmak üzere verilmiştir.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Manyetik kuvvet mikroskobu (MFM), örnek topografyasını ve yerel manyetik alan gücünü nano ölçekli çözünürlükle ölçmek için dikey olarak mıknatıslanmış bir atomik kuvvet mikroskobu probu kullanır. MFM uzamsal çözünürlüğünü ve hassasiyetini optimize etmek, azalan kaldırma yüksekliğini artan tahrik (salınım) genliğine karşı dengelemeyi gerektirir ve inert bir atmosfer eldiven kutusunda çalışmaktan yararlanır.

Nano Ölçekli Manyetik Etki Alanlarını Görselleştirmek için Manyetik Kuvvet Mikroskobu Çözünürlüğünü ve Duyarlılığını Optimize Etme

Bu protokol, telomerik DNA bağlayıcı proteinler (Telomer Tekrar Bağlama Faktörü 1 [TRF1] ve TRF2) ile insan hücrelerinden ekstrakte edilen uzun telomerler arasındaki etkileşimleri incelemek için tek moleküllü manyetik cımbızların kullanılmasını göstermektedir. Telomerler ve telomerik tekrar bağlama faktörleri için hazırlık adımlarını, tek moleküllü deneylerin yürütülmesini ve veri toplama ve analiz yöntemlerini açıklar.

Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Burada biz hızla nematodunun büyüme medya agar, yüzlerce Caenorhhabditis elegans tutarlı numaraları iyi başına 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokol tanımlamak. Bu kültürler tüm canlıların fenotipik tarama için yararlıdır. Yanlısı uzun ömürlü efektleri için ekran kimyasallara bu kültürler kullanarak üzerinde odaklanabilir.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Burada bir protokol proton taşıma dış membran cytochromes Shewanella Corynebacterium Bay-1'karmaşık yoluyla ekstraselüler elektron taşıma oranı katkısını çalışmaya bütün hücreli elektrokimyasal deneyler mevcut.

Elektrokimyasal algılama döteryum Kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma Shewanella Corynebacterium Bay-1

Öğrenin yüksek hızlı manyetik cımbız kurulumunu kullanarak DNA saç tokaları ve SNARE kompleksleri üzerinde nanomekanik ölçümler yapmayı. Bu yöntem mekanobiyolojik olayları anlamak için 1,2 kHz hızında gerçek zamanlı izleme sağlar.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Daha fazla video keşfet