Name: İnsan Keloid Dokusundan Primer Dermal Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Öğrenin insan keloid dokusundan primer dermal fibroblast izolasyonu ve kültürü yöntemini. Bu optimize protokol, laboratuvar araştırmaları için yüksek canlılıkta ve saf hücre kaynağı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81903189 ve 82073418 numaralı hibeler) ve Guangzhou Bilim ve Teknoloji Vakfı'ndan (202102020025 numaralı hibe) alınan hibelerle desteklenmiştir.

Bu çalışma, Güney Tıp Üniversitesi (2020081) Dermatoloji Hastanesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Bireylerden doku toplanmadan önce bilgilendirilmiş hasta onamları alındı.
1. Hazırlık
NOT: Aşağıdaki prosedürler biyolojik güvenlik kabini altında steril bir ortamda yapılmalıdır.
<ol><li>Yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerine (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin-amfoterisin B çözeltisi (PSA) ekleyerek tam kültür ortamı hazırlayın.</li>
	<li>1x PBS'ye% 1 PSA ekleyerek PSA ile fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) hazırlayın. 1x PBS'ye %1 FBS ekleyerek PBS'yi FBS ile hazırlayın.</li>
	<li>Otoklavlama ile birkaç sterilize makas, forseps ve neşter hazırlayın.</li>
</ol>2. Çıkarılan dokuların elde edilmesi
<ol><li>Keloid hastalarından ameliyat yoluyla doku elde edin. Taze keloid dokularını steril bir ambalaj torbasında veya steril santrifüj tüpünde toplayın ve mümkün olan en kısa sürede laboratuvardaki biyolojik güvenlik kabinine aktarın. NOT: Bu protokolde elde edilen keloid dokusunun boyutu yaklaşık ~20 x 20 x 10mm3 olup, boyut ameliyata bağlı olarak değişebilir.</li>
</ol>3. İzolasyon
<ol><li>Steril cımbız kullanarak keloid dokusunu çıkarın ve 10 dakika boyunca% 1 PSA ile 10-25 mL PBS içeren 50 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra 6 oyuklu bir plaka hazırlayın ve her oyuğa %1 PSA ile takviye edilmiş 4 mL PBS ekleyin. Sterilize edilmiş cımbız kullanarak dokuyu çıkarın ve% 1 PSA ile desteklenmiş PBS ile iki kez yıkayın. Steril forseps kullanarak, dokuyu sırayla bir kuyudan diğerine aktarın.</li>
	<li>Cerrahi makas veya cerrahi neşter kullanarak yağ ve epidermis tabakalarını çıkarın ve dermis tabakasına dokunmayın. Dermis tabakasını makasla 3-5 mm2 parçaya kesin ve disekesin, bu parçaları steril forseps kullanarak bir sonraki kuyucuğa aktarın ve tekrar% 1 PSA solüsyonu ile PBS'de yıkayın.</li>
</ol>4. Kültür
<ol><li>Dermis dokusu parçalarını sterilize edilmiş forseps kullanarak Petri kaplarına yerleştirin; Parça sayısının 10 ile 30 arasında olmasına ve her parça arasındaki mesafenin >5 mm olmasına dikkat edin. Petri kaplarını 37 °C'de %5'lik birCO2 inkübatörde 30-60 dakika boyunca doku parçaları biraz kuruyana kadar baş aşağı koyun ve Petri kabına yapışın. Ardından, %10 FBS ve %1 PSA ile takviye edilmiş DMEM ekleyin ve Petri kaplarını 37 °C'de %5CO2 inkübatöre dikkatlice yerleştirin. NOT: Fibroblastlar morfolojik ve fonksiyonel olarak heterojen bir hücre popülasyonudur. Bu karmaşıklık göz önüne alındığında, izolasyon ve kültür adımları dikkatle gerçekleştirilmelidir; keloid dermal doku parçalarını eşit şekilde seçin ve bu parçaları Petri kabına yerleştirmeden önce iyice karıştırın.</li>
	<li>3 gün sonra, süpernatantın yarısını tam bir kültür ortamı ile değiştirin. Kültür ortamını 2-3 günde bir değiştirin. Fibroblastları her gün 40x büyütmede mikroskop altında gözlemleyin. NOT: Tüm adımlar nazikçe gerçekleştirilmelidir. Doku parçalarının Petri kaplarına yapışması zaman aldığından, PERI kabını izole ettikten sonra 2 gün boyunca hareket ettirmeyin.</li>
	<li>Doku parçalarının etrafında büyüyen fibroblastlar yaklaşık% 90 birleşmeye ulaştığında, doku parçalarını ve kültür ortamını çıkarın. Fibroblastları steril 1x PBS ile yıkayın ve plakalara 2 mL steril 1x tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de yaklaşık ~ 3-5 dakika inkübe edin. Kültür kabına hafifçe vurun ve mikroskop altında gözlemleyin. Hücrelerin çoğu plakadan ayrıldığında, sindirim işlemini sonlandırmak için 2 mL tam ortam ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücre peletini tam ortamda yeniden süspanse edin. Fibroblastları 9 cm'lik bir hücre kültürü kabına tohumlayın ve nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.</li>
</ol>5. Bakım ve koruma
<ol><li>Yaklaşık 3-4 gün sonra, fibroblastlar% 80 birleşme noktasına ulaştığında, 4.2-4.4 adımlarını tekrarlayın ve fibroblastları 1: 3 oranında geçirin. Daha ileri deneyler için pasajlı fibroblastları kullanın. NOT: Fibroblast kültürü 10 geçişten sonra durdurulmalıdır, çünkü hücreler orijinal hücrelere göre değişen özellikler göstermeye başlayabilir.</li>
	<li>Daha fazla kullanım için sıvı nitrojen içinde P1-P3'ün geçiş hücrelerini kriyoprezervasyon.<ol><li>4.2-4.3 arasındaki adımları tekrarlayın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 300 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın, hücre peletini %90 FBS ve %10 DMSO içeren 1 mL hücre dondurma ortamında yeniden süspanse edin ve süspansiyonu hücre kriyotüplerine aktarın.</li>
		<li>Hücreleri donmuş bir kutuya taşıyın ve ardından donmuş kutuyu −80 °C'lik bir dondurucuya koyun. 1 gün sonra, uzun süreli koruma için hücreleri sıvı nitrojene aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>6. İmmünofloresan boyama ile fibroblastların tanımlanması
<ol><li>Yuvarlak lamelleri 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve pasajlı fibroblastları 1 × 104 hücre / kuyu konsantrasyonunda kültürleyin. Fibroblastlar% 60 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını çıkarın. Fibroblastları oda sıcaklığında 20 dakika sabitlemek için 1 mL% 4 paraformaldehit ekleyin ve her seferinde 1 dakika boyunca 3x PBS ile yıkayın. NOT: Mikroskop altında bir hemositometre lamı veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın.</li>
	<li>PBS'yi çıkarın, hücre zarlarının geçirgenliği için% 0.5 Triton X-100 ile 20 dakika inkübe edin ve ardından her seferinde 1 dakika boyunca PBS ile 3x yıkayın. % 0.5 sığır serum albümini ile PBS ekleyin ve 30 dakika bekletin. Daha sonra çıkarın ve 1: 1.000'de antikor seyreltici içinde seyreltilmiş PDGFR-α/vimentin antikorunu ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, birincil antikoru çıkarın, hücreleri 3x PBS ile 3 dakika yıkayın ve 1: 200'de antikor seyreltici ile seyreltilmiş ikincil antikor Alexa Fluor-555 keçi anti-tavşan IgG'yi 1 saat bekletin.</li>
	<li>İkincil antikoru çıkarın ve hücreleri 3x PBS ile yıkayın. Forseps kullanarak yuvarlak lamelleri çıkarın, cam slaytlara koyun ve hücre çekirdeklerini boyamak için 50 μL 5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi ekleyin. Numuneleri ıslak, karanlık bir kutuda saklayın ve lazer konfokal floresan mikroskobu altında gözlemleyin. NOT: Spesifik olmayan boyamayı dışlamak için birincil antikoru olmayan ancak ikincil antikoru olan negatif bir kontrol grubu ekleyin.</li>
</ol>7. Fibroblastların akım sitometrisi ile tanımlanması
<ol><li>Hücre peletini 1.5 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne toplayın ve% 1 FBS içeren 50 μL PBS ile yeniden süspanse edin. Karanlıkta 30 dakika boyunca anti-CD90 ile inkübe edin ve kontrol grubuna bir anti-IgG izotip kontrolü ekleyin. Daha sonra,% 1 FBS içeren 200 μL PBS ekleyin ve tüpü 4 ° C'de 300 × g'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve% 1 FBS içeren 200 μL PBS ekleyin. Süspansiyonu bir hücre süzgecinden (70 göz) yeniden askıya alın ve filtreleyin. Filtrata 1:100'de 5 μg/mL'lik bir DAPI stok çözeltisi ekleyin ve ardından sonuçları akış sitometrisi ile elde edin. İleri saçılımı (FSC) apsis ve yan saçılımı (SSC) ordinat olarak ayarlayın ve ana hücre popülasyonunu daire içine alın. Hücre popülasyonunu seçin ve fikoeritrini apsis olarak ve sayıyı analiz için ordinat olarak ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
<li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).</li>
<li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keloid+disorder%3A+Genetic+basis%2C+gene+expression+profiles%2C+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840(2022).</li>
<li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars%3A+A+critically+appraised+topic%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li>
<li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo%2C+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring%3A+Human+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li>
<li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li>
<li>Künzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858(2019).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+explants+culture+method%3A+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li>
<li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).</li>
<li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li>
<li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+regulates+cell+growth%2C+apoptosis%2C+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+%28TGF-beta%29%2FSMAD+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li>
<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

Beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Keloid dokulardan primer fibroblastların elde edilmesi, daha ileri araştırmalar için kritik bir temeldir. Şimdiye kadar, primer fibroblastları elde etmek için iki yöntem vardı: enzim sindirimi ve eksplant kültürü11,12,13,14. Bununla birlikte, her iki geleneksel yöntemin de kontaminasyona yatkınlık, diğer hücre tipleriyle karışma, uzun bir kültür süresi ve düşük başarı oranı gibi sınırlamaları v...

Fibroproliferatif bir hastalık olan keloid, genellikle çevredeki normal cildi kendi kendini sınırlamadan istila eden ve hastalar için çeşitli derecelerde kaşıntı, ağrı ve kozmetik ve psikolojik yüklere neden olan plakların sürekli büyümesi olarak kendini gösterir1. Keloidlerde yer alan birincil hücreler olan fibroblastlar, aşırı proliferasyon, gereksiz hücre dışı matriks üretimi ve düzensiz kollajenler yoluyla bu hastalığın oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynar 2,3. Bununla birlikte, altta yatan patogenez belirsizliğini korumaktadır ve keloid için etkili bir terapötik yöntem hala eksiktir; Bu nedenle, daha fazla araştırmaya acil ihtiyaç vardır 4,5.
İn vivo keloid araştırmaları için ideal bir hayvan modeli olmadığından, keloid dokulardan primer fibroblastlar elde ederek bir in vitro model oluşturmak, keloid araştırmaları için fizibilite ve güvenilirlik sağlayabilir 2,6. Birincil hücreler, doğrudan canlı dokudan türetilen hücrelerdir ve genel olarak bu hücrelerin, hücre dizilerine kıyasla birden fazla bireyin fizyolojik durumuna ve genetik arka planına daha yakından benzeyebileceği kabul edilmektedir 8,9. Birincil hücrelerin kültürlenmesi, hücrelerin büyümesini ve metabolizmasını ve diğer hücre fenotiplerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.
Şu anda, primer fibroblastları elde etmek için iki yöntem vardır: enzim sindirimi ve eksplant kültürü. Bununla birlikte, primer fibroblastların elde edilmesinde, çeşitli bakteri veya mantarlar tarafından kontaminasyon riski, kolayca çıkarılamayan diğer hücre türleri ile karışma, kültür döngüsünün uzun süresi, orijinal hücrelere kıyasla hücre özelliklerinde müteakip değişiklikler vb. gibi çeşitli engeller tanımlanmıştır 9. Bu nedenle, primer fibroblastların elde edilmesi için uygulanabilir ve etkili bir süreç geliştirmek, daha ileri çalışmalar ve uygulamalar için temel oluşturur. Bu çalışma, saf ve canlı fibroblastları etkili ve istikrarlı bir şekilde sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastların çıkarılması için optimize edilmiş bir protokolü tanımlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL steril santrifüj tüpü</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>15 mL steril santrifüj tüpü</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>%4 poliformaldehit</td><td>Beyotime Biyoteknoloji</td><td>P0099</td><td>Hücre fiksasyonu</td></tr><tr><td>50 mL steril santrifüj tüpü</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>Keloid dokusu koyun</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-555 keçi anti-tavşan IgG&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Alexa&nbsp; Flor&nbsp; 555&nbşk;</td><td>İmmünofloresan boyama testi için ikinci antikor</td></tr><tr><td>Anti insan CD90</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>Fibroblastların saflığını tanımlayın</td></tr><tr><td>Antikor seyreltici</td><td>Beyotime Biyoteknoloji</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik güvenlik kabini&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 serisi A2</td><td>İzolasyon ve kültür hücreleri</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>aladdin</td><td>B265993</td><td>İmmünofloresan boyama deneyi için engelleme</td></tr><tr><td>Karbondioksit inkübatörü</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>Hücreleri kültürlemek için kullanma</td></tr><tr><td>Hücre kriyotüpleri</td><td>Corning</td><td>43513</td><td>Hücreleri düşük sıcaklıkta</td></tr><tr><td>saklayın santrifüj makinesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST 16R</td><td>Süpernatanı atın&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biyoteknoloji</td><td>C1006</td><td>Hücresel çekirdeği boyayın</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biyomedikal</td><td>196055</td><td>Hücreleri korumak için kullanma</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Kültür ortamı çözeltisi</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD</td><td>BD FACSCelesta</td><td>Gözlemi </td></tr><tr><td>Termo</td><td>Scientific Termo Scientific</td> Hazırladığı Dondurulmuş Hücrelerin <td>Kimliği; 5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>Lazer konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>İmmünofloresan boyama testinin gözlemlenmesi</td></tr><tr><td>PDGFR-&alfa; antikor</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>İmmünofloresan boyama testi için ilk antikor</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin-çözeltisi</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td>Kontaminasyonu önlemek için kültür ortamı çözeltisi ekleyin</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>Kültür fibroblastları</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Kültür ortamı çözeltisi</td></tr><tr><td>Tavşan (DAIE) mAB IgG XR (R) İzotuj Kontrolü (PE)</td> <td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>5742S</td><td>Akış sitometrisi için bir kontrol olarak</td></tr><tr><td>Yuvarlak lamel</td><td>Biosharp</td><td>801007</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>Hücre zarında delikler</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Hücreleri geçirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Vimentin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>İmmünofloresan boyama testi için ilk antikor</td></tr></tbody></table>

İnsan keloid dokusundan primer dermal fibroblastların İzolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Keloid dokudaki ana hücre tipi olan fibroblastlar, keloidlerin oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynar. Keloid dokusundan türetilen primer fibroblastların izolasyonu ve kültürü, keloidlerin biyolojik fonksiyonu ve moleküler mekanizmalarının yanı sıra bunları tedavi etmek için yeni terapötik stratejiler hakkında daha ileri çalışmaların temelini oluşturur. Primer fibroblastları elde etmenin geleneksel yöntemi, zayıf hücresel durum, diğer hücre tipleriyle karışma ve kontaminasyona yatkınlık gibi sınırlamalara sahiptir. Bu makale, fibroblast elde edilirken olası sorunların ortaya çıkmasını azaltabilecek optimize edilmiş ve kolayca tekrarlanabilir bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokolde fibroblastlar izolasyondan 5 gün sonra gözlenebilmekte ve 10 günlük kültürden sonra %80'e yakın birleşmeye ulaşabilmektedir. Daha sonra fibroblastlar, immünofloresan testleri için PDGFRa ve vimentin antikorları ve akış sitometrisi için CD90 antikorları kullanılarak pasajlanır ve doğrulanır. Sonuç olarak, keloid dokusundan fibroblastlar, keloid araştırmaları için laboratuvarda bol ve stabil bir hücre kaynağı sağlayabilen bu protokol aracılığıyla kolayca elde edilebilir.

Protokolün zaman çizelgesi Şekil 1A'da özetlenmiştir. İzolasyon sürecinin bazı temsili görüntüleri Şekil 2'de gösterilmektedir; epidermis ve yağ tabakaları dikkatlice çıkarıldı ve dermis tabakası 3-4mm2'lik küçük parçalara ayrıldı ve bunlar Petri kaplarına aşılandı.
Şekil 3A'da gösterildiği gibi, işlemden 5 gün sonra mikroskop altında doku parçalarında birkaç fibroblast büyümesi gözlendi. <...

Bu çalışma, etkili ve istikrarlı bir şekilde saf ve canlı fibroblastlar sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastlar oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

İnsan Keloid Dokusundan Primer Dermal Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

Keloid dokusundan türetilen primer fibroblastların izolasyonu ve kültürü, keloidlerin daha ileri çalışmaları için temel oluşturur. Keloid dokusundan fibroblastlar, keloid araştırmaları için laboratuvarda bol ve stabil bir hücre kaynağı sağlayabilen bu protokol aracılığıyla kolayca elde edilebilir. Keloid dokusunu% 1 PSA ile desteklenmiş 10 ila 25 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne yerleştirmek için steril cımbız kullanarak başlayın.Bu arada, altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dört mililitre PBS PSA çözeltisi ekleyin. Şimdi dokuyu tüpten çıkarın ve PBS PSA çözeltisi ile iki kez yıkayın. Bir çift steril forseps kullanarak, dokuyu sırayla bir kuyudan diğerine aktarın.Daha sonra yağ ve epidermis katmanlarını cerrahi makasla çıkarın, dermise dokunmayın. Kesilen dermisi üç ila beş milimetre karelik parçalara ayırmak için bir makas kullanın ve parçaları bir çift steril forseps ile bir sonraki kuyuya aktarın. Parçaları PBS PSA solüsyonunda yıkayın.Sterilize edilmiş forseps kullanarak, Petri kaplarına beş milimetreden daha az aralıklarla yerleştirilmiş 10 ila 30 dermis doku parçası yerleştirin. Bulaşıkları, parçalar kuruyana kadar bir inkübatöre baş aşağı

isolation-culture-characterization-primary-dermal-fibroblasts-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Insan derisi punch biyopsi gelen fibroblast eksplant kültür protokolü düşük bir geçit numaradan milyon 15-20 hücre bankacılığı için 4-8 hafta içinde cilt hücrelerini elde etmek teknik olarak sağlam ve basit bir yoludur.

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

Bu video, insan dermis dokularından Schwann hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için bir protokol göstermektedir. İnsan dermisi, fibroblastlar ve Schwann hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri içerir. İzolasyondan sonra, hücreler çoğalan fibroblastları ortadan kaldırmak için bir antimitotik ajan ile muamele edilir ve bu da saf bir Schwann hücresi kültürü ile sonuçlanır.

İnsan Dermisinden Primer Schwann Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Birincil insan fibroblast ikinci naif multipotent ten türetilmiş öncü (SKP) hücreleri izole etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Biz fibroblast kültürleri elde edilen bu SKPS insan deri biyopsisi doğrudan elde benzeyen kök hücre özelliklerini paylaşmak olduğunu göstermektedir. Bu hücreler, örneğin Oct4 ve Nanog olarak multipotent işaretleri ek olarak nöral tepe işaretleyici, Nestin, ifade eder.

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Bu yazıda insan derisinden papiller ve retiküler fibroblastların yalıtımına yönelik FACS tabanlı bir protokol açıklanmaktadır. Eksplant kültürler aracılığıyla yaygın olarak kullanılan izolasyon protokolüyle kaçınılmaz olan in vitro kültürünü bozur. Yayılımlı fibroblast alt setleri işlevsel olarak farklıdır ve dermis içinde diferansiyel gen ifadesi ve lokalizasyonu görüntüler.

Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Mevcut protokol, yetişkin fare damak tadından elde edilen oral keratinositlerin izolasyonu ve kültürünü açıklar. İmmünasyon kullanılarak yapılan bir değerlendirme yöntemi de rapor edilir.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Bu yazıda birincil, hastaya özgü insan aort düz kas hücrelerinin ve dermal fibroblastların izolasyonu ve kültürlenmesi için eksplant kültürüne dayalı bir yöntem anlatılmaktadır. Ayrıca, hücre kasılmasını ölçmek ve daha sonra bu hücrelerdeki hastaya özgü farklılıkları incelemek için kullanılabilecek yeni bir yöntem sunulmaktadır.

Primer Hastaya Özgü Aort Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu ve Yarı Kantitatif Gerçek Zamanlı Kasılma Ölçümleri In Vitro

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Öğrenin insan keloid dokusundan primer dermal fibroblast izolasyonu ve kültürü yöntemini. Bu optimize protokol, laboratuvar araştırmaları için yüksek canlılıkta ve saf hücre kaynağı sağlar.

İnsan Keloid Dokusundan Primer Dermal Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet