İnsan Keloid Dokusundan Primer Dermal Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu
28 Temmuz 2023
Bu çalışma, etkili ve istikrarlı bir şekilde saf ve canlı fibroblastlar sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastlar oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır.
Keloid dokusundan türetilen primer fibroblastların izolasyonu ve kültürü, keloidlerin daha ileri çalışmaları için temel oluşturur. Keloid dokusundan fibroblastlar, keloid araştırmaları için laboratuvarda bol ve stabil bir hücre kaynağı sağlayabilen bu protokol aracılığıyla kolayca elde edilebilir. Keloid dokusunu% 1 PSA ile desteklenmiş 10 ila 25 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne yerleştirmek için steril cımbız kullanarak başlayın.
Bu arada, altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dört mililitre PBS PSA çözeltisi ekleyin. Şimdi dokuyu tüpten çıkarın ve PBS PSA çözeltisi ile iki kez yıkayın. Bir çift steril forseps kullanarak, dokuyu sırayla bir kuyudan diğerine aktarın.
Daha sonra yağ ve epidermis katmanlarını cerrahi makasla çıkarın, dermise dokunmayın. Kesilen dermisi üç ila beş milimetre karelik parçalara ayırmak için bir makas kullanın ve parçaları bir çift steril forseps ile bir sonraki kuyuya aktarın. Parçaları PBS PSA solüsyonunda yıkayın.
Sterilize edilmiş forseps kullanarak, Petri kaplarına beş milimetreden daha az aralıklarla yerleştirilmiş 10 ila 30 dermis doku parçası yerleştirin. Bulaşıkları, parçalar kuruyana kadar bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin ve tabağa yapıştırın. Daha sonra,% 10 FBS ve% 1 PSA ile desteklenmiş yedi mililitre DMEM ekleyin ve bulaşıkları daha önce olduğu gibi inkübe edin.
Üç gün sonra, süpernatantın yarısını tam kültür ortamıyla değiştirin. Fibroblastları günlük olarak 40X mikroskobik büyütme altında gözlemleyin. Fibroblastlar% 90'a ulaştığında kültür ortamındaki doku parçalarını çıkarın.
Fibroblastları PBS'de yıkayın ve iki mililitre steril tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe ettikten sonra, kültür kabına hafifçe vurun ve mikroskop altında gözlemleyin. Hücrelerin çoğu ayrıldıktan sonra sindirimi sona erdirmek için iki mililitre tam ortam ekleyin.
Şimdi hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücre peletini tam ortamda yeniden süspanse edin. Fibroblastları dokuz santimetrelik bir hücre kültürü kabına tohumlayın ve nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
Fibroblastları yuvarlak lameller üzerinde kültürledikten ve bunları birincil ve ikincil antikorlarda inkübe ettikten sonra immünofloresan analizi yapmak için, hücresel çekirdeği boyamak için cam slayta 50 mikrolitre DAPI çözeltisi ekleyin. Yıkanmış lamelleri forseps kullanarak cam slaytların üzerine yerleştirin. Son olarak, numuneleri floresan mikroskobu için ıslak bir karanlık kutuya aktarın.
İşlemden beş gün sonra dokuda fibroblast büyümesi gözlendi. Fibroblastlar yüksek proliferasyon oranları gösterdi ve 10 gün sonra birleşmeye ulaştı. Fibroblastlar, yüksek birleşmede demetler halinde hizalanmış uzun ve iğ benzeri hücre gövdelerine sahipti.
İmmünofloresan boyama, fibroblastların pozitif kırmızı immünofloresansını ve hücresel çekirdeğin mavi immünofloresansını döndürdü. Flow sitometrik testler hemen hemen tüm fibroblastlarda CD90 pozitifliği gösterdi. Bu çalışma, optimize edilmiş bir yöntemi tanımlamış ve mevcut zorlukları çözmek ve keloid fibroblastların izolasyonu ve kültürü için başarı şansını artırmak için net talimatlar sağlamıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, saf ve canlı fibroblastları etkili ve istikrarlı bir şekilde sağlayabilen keloid dokularından primer fibroblastların oluşturulması için optimize edilmiş bir protokolü tanımlamaktadır. Bu fibroblastların izolasyonu ve kültürü, keloid araştırmalarının geliştirilmesi için temel teşkil etmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre kültürü
- Fibroblast izolasyonu
- Keloid araştırması
Arka Plan
- Keloidler, incelenmesi zor olabilen anormal skarlardır.
- Primer fibroblastlar, keloid biyolojisini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut protokoller yeterli hücre canlılığı sağlamayabilir.
- Bu çalışma, izolasyon sürecini iyileştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Keloid dokularından fibroblastları izole etmek için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
- Laboratuvar araştırmaları için stabil bir fibroblast kaynağı sağlamak.
- Keloid oluşumu ve tedavisine dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Doku işlemleri için steril cımbız ve santrifüj tüplerinin kullanımı.
- Keloid dokusunun %1 PSA takviyeli PBS ile yıkanması.
- Dokunun altı kuyucuklu bir plaka içindeki kuyucuklar arasında ardışık olarak aktarılması.
- Fibroblast büyümesi için kültür koşullarının oluşturulması.
Ana Sonuçlar
- Keloid dokularından canlı fibroblastların başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Protokol, araştırmalar için bol miktarda hücre kaynağı sağlar.
- Fibroblastlar zaman içinde stabilite ve canlılıklarını korumuştur.
- Keloid biyolojisi üzerine yapılacak ileri çalışmaları kolaylaştırmıştır.
Sonuçlar
- Optimize edilmiş protokol, fibroblast izolasyonu için etkilidir.
- Gelecekteki keloid araştırmaları için bir temel oluşturur.
- Keloid tedavisindeki terapötik gelişmeler potansiyelini artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Keloid dokusundan primer dermal fibroblastların güvenilir izolasyonu ve kültürü, erken evre ilaç keşif süreçlerinde hastalıkla ilişkili hücresel modellere duyulan kritik ihtiyaca cevap vermektedir. Bu protokol, fibrotik cilt bozuklukları için mekanistik çalışmaları ve hedef doğrulamayı destekleyerek, saf ve valide edilmiş fibroblast popülasyonlarına tutarlı erişim sağlar. Uygulanan yöntem, keloid araştırma portföylerindeki terapötik hipotez testleri için öngörücü güveni ve translasyonel sürekliliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Keloid patogenezinde rol oynayan fibroblast kaynaklı yolakların sorgulanmasını sağlar.
- Fonksiyonel olarak valide edilmiş primer hücreler sağlayarak biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Fibrotik hastalıklarda hedef uygunluğunun netleştirilmesi için mekanistik çalışmaları kolaylaştırır.
- Erken portföy önceliklendirme kararları için öngörü güvenilirliğini artırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Analiz standardizasyonu için primer fibroblastlarınle tekrarlanabilir bir kaynağı sağlar.
- Bileşik değerlendirmesi için kantitatif, hücre tabanlı analizlerin geliştirilmesine olanak tanır.
- Tarama iş akışlarında tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği destekler.
- Kontaminasyonu ve fibroblast dışı hücre karışımını minimize ederek değişkenliği azaltır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel çalışmalar için in vitro modelleri hastalıkla ilgili insan hücre tipleriyle uyumlu hale getirir.
- Keloid araştırmalarında keşiften preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Anti-fibrotik adayların riskle ayarlanmış şekilde ilerletilmesini destekler.
- Alt akış çalışmalarıyla desteklendiğinde, biyobelirteç keşfi ve doğrulaması için bir platform sunar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu protokol, primer keloid fibroblast izolasyonunu erken keşif ve preklinik araştırma arayüzüne konumlandırarak, fibrotik cilt hastalığı geliştirme süreçleri için güçlü hedef doğrulaması ve analiz geliştirme imkanı sunar.
- Keşif Biyolojisi: Keloid patogenezinde hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Kantitatif analiz geliştirme için valide edilmiş, tekrarlanabilir hücre sistemleri sunar.
- Analitikler: Hücre kimliğinin onaylanması için immünofloresan ve akış sitometrisi tabanlı karakterizasyona olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Aday terapötiklerin preklinik değerlendirmesi için hastalıkla ilgili hücresel modeller sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Araştırma ekipleri ve projeleri genelinde uyarlanabilir standart bir protokol oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Keloid araştırmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Primer hücre iş akışlarının standardizasyonunu, tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Erken aşama programlarda devam/durdur karar kalitesini ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Anti-fibrotik varlıkların riskle uyumlu şekilde önceliklendirilmesini ve geliştirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Steril doku tutma ve primer hücre kültürü tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Hücre kültürü tesislerine, immunofloresan ve akış sitometrisi cihazlarına erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilir hücre izolasyonu ve karakterizasyonu için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Diğer fibrotik veya dermal doku kaynakları için adaptasyon gerektirebilir.
- Potansiyel kısıtlamalar arasında donör değişkenliği ve doku mevcudiyeti yer almaktadır.
