İnsan Nöral Yapılarının Gömülü 3D Baskısı için Mikrojel-Hücre Dışı Matris Kompozit Desteği

SHAPE kompozitleri içindeki gömülü 3D Baskı, doğal hücre dışı ortama benzeyen hidrojellerin içindeki mekanik olarak hassas dokuların doğru bir şekilde modellenmesini sağlamak için geleneksel biyofabrikasyon sınırlamalarının üstesinden gelir. SHAPE alet kutusu, modüler biyomalzeme tasarımına dayanır ve baskı desteği formülasyonunda kolay değişikliklere izin verir. Ayrıca, diğer araştırma grupları tarafından basit adaptasyon için düşük maliyetli malzemelerden ve erişilebilir ekipmanlardan yararlanır.

Bu yaklaşım, Parkinson gibi nörodejeneratif bozukluklarda nöronal gelişimi ve iletişimi incelemek için mekansal olarak tanımlanmış insan sinir dokusu modelleri oluşturmak için uygulanabilir. Ultra saf suda kalsiyum karbonat çözeltisini mililitre konsantrasyon başına iki miligramda hazırlayarak başlayın. Aljinat çözeltisi ile eşit oranda karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 650 RPM'de manyetik olarak karıştırın.

Daha sonra bu karışıma bir ila 500 oranında asetik asit ekleyin ve gece boyunca tekrar karıştırın. Ertesi gün, jöleli aljinat çözeltisini bir homojenizatör kullanarak 10 dakika boyunca 15.000 RPM'de mikropartiküllere mekanik olarak parçalayın. Daha sonra mikropartikülleri elde etmek için santrifüj.

Süpernatantı dikkatlice atın ve iki milimolar sodyum hidroksit ve% 1 penisilin streptomisin içeren DMEM'deki parçacıkları yeniden askıya alın. Süspansiyonun rengi tekrar kırmızıya dönmelidir. Süspansiyonu gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, süspansiyonu 15.000 RPM'de üç dakika homojenize edin ve 10 dakika boyunca 18.500 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve sıkıca paketlenmiş aljinat mikropartikülleri için pelet gözlemleyin. SHAPE kompozitini oluşturmak için, aljinat mikropartikül peletini seyreltilmiş ve nötralize edilmiş kollajen ile ikiye bir oranında karıştırın ve buz üzerinde yukarı ve aşağı pipetleyin.

Üretilen kompozit malzemeyi soğutulmuş 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Yazdırmadan önce, daha önce kültürlenmiş insan nöral kök hücrelerini veya hNSC'leri, 37 santigrat derecede beş dakika boyunca% 0.025'lik bir tripsin çözeltisi kullanarak ayırın. Daha sonra tripsini büyüme ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 G'de santrifüj edin.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini iki ila üç mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın. 21 gauge künt metal iğne kullanarak, şırıngaya 100 mikrolitre sıkıca paketlenmiş aljinat mikropartikülleri yükleyin. Daha sonra hazırlanan hücre süspansiyonunu bir şırıngaya yükleyin.

Yazdırma için, yükleme iğnesini 27 gauge künt metal iğne ile değiştirin. Başvurulan yazılımı kullanarak, yazdırılacak yapı tasarlandıktan sonra, G kodu oluşturma için oluştur'u tıklayın. Hücre yüklü şırıngayı ekstrüzyon bazlı bir biyoyazıcıdaki volümetrik ekstrüzyon kafasına yerleştirin ve iğne uzunluğu ölçüm işlemini başlat'a tıklayarak iğne uzunluğunu kaydedin.

Ardından, SHAPE kompozit yüklü 24 kuyucuk plakasını yazıcıya yerleştirin ve boş kuyu yüzeyi yüksekliğini ölçmek için SHM'ye tıklayın. pH 2'yi ve ardından anahtar sembolünü seçin. Ardından, parametre kümesinin altında, hacimsel akış hızını saniyede 3,6 mikrolitre olarak değiştirin ve Parametreyi Uygula'ya, ardından Kaydet ve Bitti'ye basın.

Açık G kodu simgesini tıklatarak G kodunu yazıcının kullanıcı arabirimine yükleyin. Yazdırma yordamını başlatmak için çalıştırma programının simgesini seçin. Baskıdan hemen sonra, tavlama için SHAPE jelini 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ardından, tavlanmış SHAPE jel desteğine yavaşça büyüme ortamı ekleyin. İmmün boyama için, fazla ortamı jelden çıkarın ve bir spatula kullanarak, jeli DPBS içeren bir kaba aktarın. Plaka davlumbaza yerleştirildikten sonra DPBS'yi çıkarın.

Jeli% 4 formaldehit çözeltisi ile örtün ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. DPBS ile yıkadıktan sonra, blokaj solüsyonunu jele ekleyin. Plakayı yavaşça sallayın ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için oda sıcaklığında altı saat boyunca inkübe edin.

Bloke edici çözelti çıkarıldıktan sonra, birincil antikoru jele ekleyin ve yavaşça sallayın. Plakayı dört santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. DPBS yıkandıktan sonra, jeli 24 saat boyunca ikincil antikor çözeltisi ile benzer şekilde tedavi edin.

Lekeli jeli bir spatula ile görüntülemeden önce ince bir görüntüleme tabanına sahip bir kuyu plakasına yerleştirin. Bu çalışmada, hNSC mürekkebi yaklaşık 200 mikrometre çapında bir hücre filamenti bastı. Basılı iplikçikler, morfolojisi olan canlı hücreler bakımından zengindi.

30 günlük baskıdan sonra, hücreler küçük hücre gövdeleri ve uzun ince süreçlerle nöral morfoloji sergiledi ve bu da hNSC'lerin başarılı bir şekilde farklılaştığını gösterdi. Tubulin beta üç ile boyama, üretilen sinir ağlarının korunmuş geometri ile görselleştirilmesine izin verdi. Ve farklılaşma işlemi sırasında, hücreler basılı iplikçiklerden dışarı göç etmedi.

SHAPE kompozit, hücreler yerine kurban mürekkebi basarak eriyebilir kanallar üretmek için kullanılabilir. Ayrıca, destek, zaman ve mekan boyunca 3D baskılı yapılardaki oksijen gerilimini izlemek için oksijene duyarlı boncuklar içerebilir.