İnsan Nöral Yapılarının Gömülü 3D Baskısı için Mikrojel-Hücre Dışı Matris Kompozit Desteği
May 5th, 2023
Bu çalışma, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris kompozitleri içindeki nöral kök hücrelerin serbest biçimli gömülü 3D baskısı için bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, birbirine bağlı insan sinir dokusu yapılarının yüksek doğrulukla programlanabilir modellenmesini sağlar.
SHAPE kompozitleri içindeki gömülü 3D Baskı, doğal hücre dışı ortama benzeyen hidrojellerin içindeki mekanik olarak hassas dokuların doğru bir şekilde modellenmesini sağlamak için geleneksel biyofabrikasyon sınırlamalarının üstesinden gelir. SHAPE alet kutusu, modüler biyomalzeme tasarımına dayanır ve baskı desteği formülasyonunda kolay değişikliklere izin verir. Ayrıca, diğer araştırma grupları tarafından basit adaptasyon için düşük maliyetli malzemelerden ve erişilebilir ekipmanlardan yararlanır.
Bu yaklaşım, Parkinson gibi nörodejeneratif bozukluklarda nöronal gelişimi ve iletişimi incelemek için mekansal olarak tanımlanmış insan sinir dokusu modelleri oluşturmak için uygulanabilir. Ultra saf suda kalsiyum karbonat çözeltisini mililitre konsantrasyon başına iki miligramda hazırlayarak başlayın. Aljinat çözeltisi ile eşit oranda karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 650 RPM'de manyetik olarak karıştırın.
Daha sonra bu karışıma bir ila 500 oranında asetik asit ekleyin ve gece boyunca tekrar karıştırın. Ertesi gün, jöleli aljinat çözeltisini bir homojenizatör kullanarak 10 dakika boyunca 15.000 RPM'de mikropartiküllere mekanik olarak parçalayın. Daha sonra mikropartikülleri elde etmek için santrifüj.
Süpernatantı dikkatlice atın ve iki milimolar sodyum hidroksit ve% 1 penisilin streptomisin içeren DMEM'deki parçacıkları yeniden askıya alın. Süspansiyonun rengi tekrar kırmızıya dönmelidir. Süspansiyonu gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, süspansiyonu 15.000 RPM'de üç dakika homojenize edin ve 10 dakika boyunca 18.500 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve sıkıca paketlenmiş aljinat mikropartikülleri için pelet gözlemleyin. SHAPE kompozitini oluşturmak için, aljinat mikropartikül peletini seyreltilmiş ve nötralize edilmiş kollajen ile ikiye bir oranında karıştırın ve buz üzerinde yukarı ve aşağı pipetleyin.
Üretilen kompozit malzemeyi soğutulmuş 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Yazdırmadan önce, daha önce kültürlenmiş insan nöral kök hücrelerini veya hNSC'leri, 37 santigrat derecede beş dakika boyunca% 0.025'lik bir tripsin çözeltisi kullanarak ayırın. Daha sonra tripsini büyüme ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 G'de santrifüj edin.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini iki ila üç mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın. 21 gauge künt metal iğne kullanarak, şırıngaya 100 mikrolitre sıkıca paketlenmiş aljinat mikropartikülleri yükleyin. Daha sonra hazırlanan hücre süspansiyonunu bir şırıngaya yükleyin.
Yazdırma için, yükleme iğnesini 27 gauge künt metal iğne ile değiştirin. Başvurulan yazılımı kullanarak, yazdırılacak yapı tasarlandıktan sonra, G kodu oluşturma için oluştur'u tıklayın. Hücre yüklü şırıngayı ekstrüzyon bazlı bir biyoyazıcıdaki volümetrik ekstrüzyon kafasına yerleştirin ve iğne uzunluğu ölçüm işlemini başlat'a tıklayarak iğne uzunluğunu kaydedin.
Ardından, SHAPE kompozit yüklü 24 kuyucuk plakasını yazıcıya yerleştirin ve boş kuyu yüzeyi yüksekliğini ölçmek için SHM'ye tıklayın. pH 2'yi ve ardından anahtar sembolünü seçin. Ardından, parametre kümesinin altında, hacimsel akış hızını saniyede 3,6 mikrolitre olarak değiştirin ve Parametreyi Uygula'ya, ardından Kaydet ve Bitti'ye basın.
Açık G kodu simgesini tıklatarak G kodunu yazıcının kullanıcı arabirimine yükleyin. Yazdırma yordamını başlatmak için çalıştırma programının simgesini seçin. Baskıdan hemen sonra, tavlama için SHAPE jelini 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ardından, tavlanmış SHAPE jel desteğine yavaşça büyüme ortamı ekleyin. İmmün boyama için, fazla ortamı jelden çıkarın ve bir spatula kullanarak, jeli DPBS içeren bir kaba aktarın. Plaka davlumbaza yerleştirildikten sonra DPBS'yi çıkarın.
Jeli% 4 formaldehit çözeltisi ile örtün ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. DPBS ile yıkadıktan sonra, blokaj solüsyonunu jele ekleyin. Plakayı yavaşça sallayın ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için oda sıcaklığında altı saat boyunca inkübe edin.
Bloke edici çözelti çıkarıldıktan sonra, birincil antikoru jele ekleyin ve yavaşça sallayın. Plakayı dört santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. DPBS yıkandıktan sonra, jeli 24 saat boyunca ikincil antikor çözeltisi ile benzer şekilde tedavi edin.
Lekeli jeli bir spatula ile görüntülemeden önce ince bir görüntüleme tabanına sahip bir kuyu plakasına yerleştirin. Bu çalışmada, hNSC mürekkebi yaklaşık 200 mikrometre çapında bir hücre filamenti bastı. Basılı iplikçikler, morfolojisi olan canlı hücreler bakımından zengindi.
30 günlük baskıdan sonra, hücreler küçük hücre gövdeleri ve uzun ince süreçlerle nöral morfoloji sergiledi ve bu da hNSC'lerin başarılı bir şekilde farklılaştığını gösterdi. Tubulin beta üç ile boyama, üretilen sinir ağlarının korunmuş geometri ile görselleştirilmesine izin verdi. Ve farklılaşma işlemi sırasında, hücreler basılı iplikçiklerden dışarı göç etmedi.
SHAPE kompozit, hücreler yerine kurban mürekkebi basarak eriyebilir kanallar üretmek için kullanılabilir. Ayrıca, destek, zaman ve mekan boyunca 3D baskılı yapılardaki oksijen gerilimini izlemek için oksijene duyarlı boncuklar içerebilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, kendiliğinden iyileşebilir, tavlanabilir partikül-hücre dışı matris kompozitlerinde sinir kök hücrelerinin gömülü 3D baskısı için bir protokol tanımlar. Bu yöntem, bağlantılı insan sinir dokusu yapılarının yüksek sadakatle programlanabilir desenlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofabrikasyon
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- Geleneksel biyofabrikasyon yöntemleri, mekanik olarak hassas dokuların oluşturulmasında sınırlamalar ile karşı karşıyadır.
- SHAPE kompozitleri, doku gelişimi için doğal bir hücre dışı ortam sağlar.
- Modüler biyomateryal tasarımı, kolay adaptasyon ve formülasyon değişiklikleri için izin verir.
- Düşük maliyetli malzemeler ve erişilebilir ekipman, daha geniş araştırma uygulamalarını kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- Sinir dokusu modellerinin doğru desenlenmesi için bir protokol geliştirmek.
- Nörodejeneratif bozukluklarda nöronal gelişim ve iletişimin incelenmesi.
- Diğer araştırma gruplarının yöntemi kopyalama ve uyarlamak için bir çerçeve sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Ultra saf su içinde kalsiyum karbonat çözeltisinin hazırlanması.
- Belirli bir oranda aljinat çözeltisi ile karıştırılması.
- Kontrollü hız ve sıcaklıkta manyetik karıştırma.
- Gömülü 3D baskı için SHAPE kompozitlerin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Mekansal olarak tanımlanmış insan sinir dokusu modellerinin başarılı oluşturulması.
- Dokuları yüksek sadakatle desenleme kabiliyetinin gösterilmesi.
- Nörodejeneratif bozukluklarda çalışmalarda potansiyel uygulamalar.
- Protokolün çeşitli araştırma ortamlarına uyarlanabilirliği.
Sonuçlar
- Protokol, sinirbilimde biyofabrikasyonun yeteneklerini artırır.
- Nöronal etkileşimleri araştırmak için değerli bir araç sağlar.
- Gelecek araştırmalar bu yöntemi kullanarak çeşitli nörolojik koşulları keşfedebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Embedded 3D printing of human neural constructs within SHAPE composites addresses a critical gap in modeling neurodegenerative diseases by providing a tunable, ECM-mimetic environment that supports long-term culture and functional maturation. This approach enables biopharma R&D to generate reproducible, human-relevant neural tissue models for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The modular, low-cost design supports scalable adoption across discovery workflows for Parkinson’s and related disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in human-derived neural tissue with preserved architecture and viability.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining printed cell localization and differentiation over extended culture periods.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement in spatially defined neural networks relevant to disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides a standardized, reproducible support medium for long-term culture and quantitative imaging of neural constructs.
- Scalability: Uses accessible equipment and low-cost materials to enable platform reuse across multiple compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Allows live-cell fluorescence and immunocytochemistry readouts to measure differentiation, axonal outgrowth, and network formation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Generates human neural tissue models applicable to studying neuronal development and communication in neurodegenerative disorders like Parkinson’s.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by maintaining construct geometry and enabling functional readouts over weeks.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through observable differentiation and network formation without cell migration from printed strands.
Pipeline & Workflow Integration
The SHAPE composite method integrates into the discovery continuum by enabling early-stage hypothesis testing in human neural models, supporting assay development for compound evaluation, and providing translational readouts that bridge to preclinical assessment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise patterning and long-term culture of human neural stem cells to study differentiation and network formation.
- Screening: Enables standardized, reproducible construct generation for compound exposure and functional readout via imaging and staining.
- Analytics: Delivers quantitative, spatially resolved data through live-cell imaging and immunocytochemistry to compare conditions and assess target modulation.
- Translational Research: Maintains construct integrity and supports axonal outgrowth, providing a disease-relevant system for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Leverages modular design and low-cost materials to allow adaptation across research groups and iterative use in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by providing a tunable, ECM-like microenvironment that supports neural differentiation and network formation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through self-healing, annealable support media and accessible fabrication protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing reliance on complex systems and enabling broad adoption across discovery teams.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through observable, long-term neural maturation and network stability in printed constructs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial preparation, particle generation, and sterile tissue culture techniques.
- Depends on access to homogenizers, centrifuges, bioprinters, and standard imaging and immunostaining equipment.
- Necessitates cross-team standardization of SHAPE composite formulation and printing parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or ECM components beyond alginate and collagen.
- Includes practical limitations such as the need for precise particle sizing and annealing timing to maintain support fidelity during printing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Self Healing Annealable Particle: Extracellular Matrix (SHAPE) Composite Preparation
2:40
Human Neural Stem Cell (hNSC) Bioink Preparation and Embedded 3D Printing
6:19
Results: Characterization of 3D Printed Human Neural Construct
7:11
Conclusion
