Name: Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletimkokondriyal Cybrid Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Öğrenin, kanser hücre hatlarından sitoplazmik hibrid üretimini kullanarak mitokondri genotiplerinin tümör agresifliğindeki rolünü araştırmayı. Bu yöntem, kanser ilerlemesindeki mitokondrial katkıları ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, RSA, JMB ve AA'ya PID2019-105128RB-I00 hibe numarası ve PFS ve RML'ye PGC2018-095795-B-I00 hibe numarası ile finanse edilmiş, her ikisi de MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ve hibe numaraları B31_20R (RSA, JMA ve AA) ve E35_17R (PFS ve RML) tarafından finanse edilmiş ve Gobierno de Aragón tarafından finanse edilmiştir. RSA'nın çalışmaları, Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE'den bir hibe ile desteklendi. Yazarlar, Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza'nın kullanımını kabul etmek ister.

NOT: Tüm kültür ortamları ve tampon bileşimleri Tablo 1'de belirtilmiştir. Sibrid üretiminden önce, hücre hatları arasındaki her iki genomda genetik farklılıkların varlığını doğrulamak için donör ve alıcı hücrelerden hem mitokondriyal hem de nükleer DNA profilleri yazılmalıdır. Bu çalışmada, ticari olarak temin edilebilen bir L929 hücre hattı ve laboratuvarımızda kendiliğinden oluşan türetilmiş hücre hattı L929dt kullanılmıştır (daha fazla bilgi içinbkz. 13 ). Bu hücre hatları, mt-Nd2 genlerinin dizisinde, sibridizasyon işlemi tamamlandıktan sonra mtDNA'nın saflığını doğrulamak için kullanılabilecek iki farklılık gösterir13. Bu durumda, nükleer arka planın saflığı antibiyotik duyarlılığı ile doğrulandı, çünkü L929dt hücrelerinin aksine, L929 genetisine dirençliydi.
1. Rodamin 6G tedavisi ile mitokondriyal tükenme (alıcı hücreler)
NOT: Başarılı cybrid üretimi için ilk adım, alıcı hücrelerdeki mitokondriyal fonksiyonları tamamen ve geri dönüşümsüz olarak ortadan kaldırmaktır. Bu amaçla, her hücre hattı için rodamin 6G ile uygun konsantrasyon ve tedavi süresinin önceden belirlenmesi gerekmektedir. Bu yeterli konsantrasyon, ilaca bağlı hücre ölümünün hemen altında olmalıdır (tedavi sırasında hücreleri öldürmeyen en yüksek seviye). En uygun koşullar tanımlandıktan sonra aşağıdakileri gerçekleştirin.
<ol><li>Tohum 10 6 hücreyi6 delikli bir plakada tam kültür ortamı kullanarak (ayrıntılar için Tablo 1'e bakın) ve hücre hattına bağlı olarak 3-10 gün boyunca 3-10 gün boyunca optimum rodamin 6G konsantrasyonu ile günlük olarak muamele edin. Geleneksel konsantrasyonlar 3-10 gün boyunca 2 ila 5 μg / mL arasında değişir20,21. Bu çalışmada, L929 türevi hücreler için, 7 gün boyunca 2.5 μg / mL rhodamine 6G, seçilen tedavi13,22 idi.</li>
	<li>Hücreleri canlı tutmak için, hücre kültürü ortamını 50 μg / mL idrar ve 100 μg / mL piruvat ile destekleyin ve her 24 saatte bir yenileyin.</li>
	<li>Tedaviden sonra ve füzyondan önce, rhodamine 6G ile muamele edilmiş hücrelerin ortamını, rhodamine 6G olmadan hücre kültürü ortamını tamamlamak için değiştirin ve bunları% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde 3-4 saat boyunca bu ortamda bırakın. NOT: Rodamin 6G toksik etkisi geri dönüşümsüzdür ve fonksiyonel olmayan mitokondrili hücreler20'yi geri kazanmamalıdır. Bu nedenle, tedaviden sonra, fonksiyonel mitokondri almayan hücreler, idrar takviyeli kültür ortamında bile ölmelidir. Bu nedenle, nükleer seleksiyon gerekli olmamalıdır. Bununla birlikte, mitokondri olmadan rodamin 6G ile tedavi edilen hücrelerin kontrol füzyonu önerilir.</li>
</ol>2. Genleşme ve mitokondriyal izolasyon (donör hücreler)
<ol><li>Yaklaşık 25 x 106 hücre elde etmek için rodamin 6G tedavisinin zaman atlaması sırasında mitokondri donör hücrelerini genişletin.</li>
	<li>7. günde, 50 mL'lik bir tüpte katlanarak büyüyen hücreleri hasat edin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüjleme yoluyla toplayın. Hücreleri soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kat yıkayın ve RT'de 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüjleme ile çökeltin. Şu andan itibaren, soğuk reaktifler kullanarak ve tüpleri buz üzerinde hücreler veya mitokondri ile tutarak mitokondriyal ekstraksiyonun tüm adımlarını 4 ° C'de gerçekleştirin.</li>
	<li>Üçüncü santrifüjlemeden sonra, bir vakum pompasına bağlı bir cam pipet kullanarak süpernatantı aspirasyon yoluyla atın ve paketlenmiş hücreleri, hücre pelet hacminin 7 katına eşit bir hipotonik tampon hacminde yeniden askıya alın. Ardından, hücre süspansiyonunu bir homojenizatör tüpüne aktarın ve hücrelerin 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek şişmesine izin verin.</li>
	<li>600 rpm'de dönen motor tahrikli bir havaneyle bağlı homojenizatörde 8 ila 10 strok gerçekleştirerek hücre zarlarını kırın. NOT: Hücre zarı bozulmasının adımı hücre tipleri arasında değişebilir; Bu nedenle, her hücre tipi için optimize edilmelidir.</li>
	<li>İzotonik bir ortam oluşturmak için hücre süspansiyonuna aynı hacimde hipertonik tampon ekleyin (hücre pelet hacminin 7 katı).</li>
	<li>Homojenatı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'de sabit bir rotorda santrifüj edin. Daha sonra, çekirdeklerle veya sağlam hücrelerle kontaminasyonu önlemek için peletten büyük bir marj bırakarak süpernatantın sadece 3 / 4'ünü toplayın ve başka bir tüpe aktarın. Aynı işlemi iki kez tekrarlayın. Süpernatantın tutulması ve peletin atılması gerektiğini unutmayın.</li>
	<li>Mitokondriyal fraksiyonu (süpernatan) kaydedin. 1,5 mL tüplere aktarın ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca maksimum hızda (18.000 x g) santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti tampon A ile yıkayın, iki tüpün içeriğini bir araya getirin ve adım 2.7'de tarif edildiği gibi aynı koşullarda santrifüj yapın. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>300 μL tampon A ile ek bir yıkama yapın ve Bradford tahlili23'ü kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Her bir sibridizasyon testi için, transfer prosedürü için en uygun mitokondri miktarı belirlenmelidir (bizim durumumuzda, 106 hücre başına 10-40 μg mitokondriyal protein arasında bir konsantrasyon).</li>
	<li>Aynı zamanda, rhodamine 6G ile önceden işlenmiş hücreleri, 15 mL'lik bir tüpte toplayarak ve RT'de 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüj yaparak füzyon için hazırlayın.</li>
	<li>Hem reseptör hücrelerde mitokondriyal fonksiyonun ortadan kaldırılmasının hem de donörlerden organel saflaştırmasının uygun şekilde gerçekleştirildiğinden emin olmak için, az sayıda rodamin 6G ile muamele edilmiş hücreleri ve izole edilmiş mitokondrileri, 6 kuyucuklu bir plakada tam kültür ortamını kullanarak tohumlayın ve kuyucukların hiçbirinde hayatta kalan hücrelerin kalmadığını kontrol etmek için bir ay boyunca kültürleyin (Şekil 2).</li>
	<li>Buna paralel olarak, mitokondriyal fraksiyondaki çekirdek kirleticilerinin yokluğunu, nükleer proteinlerin (yani, lamin beta, histon H3, vb.) immünotespiti veya bir nükleer genin kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) amplifikasyonu (yani, SDH, 18S rRNA, vb.) NOT: Kontaminasyonları önlemek için, laminer akış davlumbaz altında çalışan aseptik koşullarda tüm adımların gerçekleştirilmesi önerilir.</li>
</ol>3. Füzyon ve cybrid üretimi
<ol><li>Füzyona devam etmek için, izole mitokondri pelletine (10-40 μg mitokondriyal protein) rhodamine 6G ile muamele edilmiş hücrelerin 106'sını dikkatlice ekleyin ve hücrelerin mitokondri ile karışmasına izin vermek için 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>100 μL polietilen glikol (PEG,% 50) ekleyin ve peleti 30 s boyunca hafifçe askıya alın. Ardından, 30 saniye daha el değmeden dinlenmeye bırakın.</li>
	<li>Son olarak, karışımı taze tam hücre kültürü ortamına sahip 6 delikli bir plakaya aktarın ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin. Birkaç gün sonra (genellikle 1 hafta), transmitokondriyal sibritler büyümeye başlamalıdır (Şekil 2), bu da analizlerinden önce ayrı ayrı seçilebilen veya bir havuzda karıştırılabilen klonlara yol açmalıdır.</li>
</ol>4. Hem mitokondriyal hem de nükleer arka planın doğrulanması
NOT: Yeni hücre hattı kurulduktan ve hücreler katlanarak büyümeye başladıktan sonra, mitokondriyal ve nükleer DNA'larının saflığı doğrulanmalıdır. Bu nedenle, orijinal hücre hatları, tanınabilir hale getirmek için genomlarında farklı mutasyonlar veya polimorfizmler barındırmalıdır.
<ol><li>Toplam DNA izolasyonu<ol><li>Ticari bir genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya fenol-kloroform-izoamil alkol ekstraksiyonu ve alkol çökeltme24 kullanarak standart bir protokol uygulayarak cybrid üretimi için kullanılan tüm hücre hatlarının genomik DNA'sını izole edin.</li>
	</ol></li>
	<li>mtDNA değerlendirmesi (Şekil 3) NOT: mtDNA'nın saflığını analiz etmek için dizileme, kısıtlama parça uzunluğu polimorfizmi (RFLP) analizi veya alele özgü qPCR gibi çeşitli teknikler gerçekleştirilebilir. RFLP tarafından mtDNA dizi varyasyonlarının varlığını doğrulamak için, sonraki protokol adımlarını izleyin.<ol><li>PCR ile nükleotid değişimini içeren bir mtDNA fragmanını güçlendirin.<ol><li>Burada, L929dt hücreleri, L929 hücrelerinde bulunmayan bir mt-Nd2 geni (m.4206C>T) içinde, 4206 pozisyonunda bir mtDNA mutasyonu sunar. İletimkokondriyal sibritlerde bu ikamenin varlığını doğrulamak için, standart bir protokol ve aşağıdaki primerleri kullanarak PCR ile 397 bp'lik bir parçayı yükseltin: 1) 5'-AAGCTATCGGG CCCATACCCCG-3' (3862-3884 pozisyonları) ve 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGGGCG -3' (4236-4258 pozisyonları).</li>
		</ol></li>
		<li>İstenilen nükleotid ikamesinin RFLP ile varlığını, dizi değişimini tanıyan ve her iki hücre çizgisi için farklı bir kesim paterni oluşturan spesifik bir endonükleaz kullanarak analiz edin. NOT: L929dt mtDNA varyantı mevcut olduğunda (4206T), adım 4.2.1'de elde edilen amplikon, 306 bp, 52 bp ve 39 bp'lik üç DNA parçası üreten SspI için iki kısıtlama bölgesi içerir (bkz. 52 ve 39 bantlarını oluşturan kısıtlama sitesi, vahşi tip (WT) sürüm C4206 mevcut olduğunda ve 91 bp'lik yeni bir bant göründüğünde bozulur. Bu nedenle, SspI için tam sindirim için bir iç kontrol analize dahil edilmiştir. Sindirim reaksiyonu, üreticinin talimatlarını izleyerek 37 ° C'de gerçekleştirilir.</li>
		<li>Kısıtlama parçalarını elektroforez ile ayırın ve bant desenini karşılaştırın.<ol><li>Sindirim yapıldıktan sonra, elde edilen kısıtlama parçalarını% 10 poliakrilamid-Tris-borat-EDTA (TBE) jellerinde elektroforez ile analiz edin (1x TBE bileşimi için Tablo 1'e bakınız). RT'de 15 dakika boyunca 1x TBE'de bir ethidyum bromür çözeltisinde jel boyamadan sonra DNA fragmanlarını görselleştirin (jel boyama çözeltisi bileşimi için Tablo 1'e bakınız).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Nükleer DNA genotiplemesi NOT: Nükleer DNA genotiplemesi, RFLP analizi için kullanılan önceki DNA ekstraksiyon örneği kullanılarak yapılmalıdır.<ol><li>Ticariye özgü oligonükleotidlerden oluşan bir havuz kullanarak 16 lokusu (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 ve AMEL) güçlendirin (bkz.</li>
		<li>Daha önce elde edilen parçaları ayırmak için genetik bir analizör kullanarak elektroforez yapın. NOT: Güçlendirildikten sonra, farklı lokuslar kapiler bir sistem kullanılarak elektroforez ile analiz edilir (bakınız Malzeme Tablosu). Parçalar, ticari bir polimerle doldurulmuş 50 cm uzunluğunda bir kapiler içinde ayrılır. Katot ve anot tamponları, Malzeme Tablosunda gösterildiği gibi ticari olarak da temin edilebilir. Elektroforez 19.5 kV'de 60 °C'de 20 dakika süreyle uygulanır.</li>
		<li>Her bir güçlendirilmiş lokusa karşılık gelen alelleri belirlemek için biyoinformatik araçlar kullanın (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Nükleer DNA profilinin mitokondri reseptör hücre hattı profili ile eşleşip eşleşmediğini kontrol etmek için adım 4.3.3'te elde edilen verileri nükleer DNA profili veritabanı (Tablo 1) ile karşılaştırın (Şekil 4).</li>
	</ol></li>
</ol>

Süspansiyon Büyüten Kanser Hücrelerinden İletim Cybrid Üretimi

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Otto Warburg, kanser hücrelerinin metabolizmalarını değiştirdiğini ve mitokondriyal solunumu azaltırken "aerobik glikoliz"i3,4 güçlendirdiğini bildirdiğinden, mitokondrinin kanser dönüşümü ve ilerlemesindeki rolüne olan ilgi katlanarak artmıştır. Son yıllarda, mtDNA'daki mutasyonlar ve mitokondriyal disfonksiyon, birçok kanser tipi25'in ayırt edici özellikleri olarak kabul edilmiştir. Bugüne kadar, çok sayıda çalışma, spesifik tümörlerin m...

Enerji metabolizmasının yeniden programlanması, 1930'larda Otto Warburg tarafından ilk kez gözlemlenen kanser1'in ayırt edici bir özelliğidir2. Aerobik koşullar altında, normal hücreler glikozu piruvat'a dönüştürür, bu da asetil-coA üretir, mitokondriyal makineyi besler ve hücresel solunumu teşvik eder. Bununla birlikte, Warburg, normoksik koşullar altında bile, çoğu kanser hücresinin glikoliz işleminden elde edilen piruvatı laktata dönüştürdüğünü ve enerji elde etme yollarını değiştirdiğini göstermiştir. Bu metabolik ayarlama "Warburg etkisi" olarak bilinir ve bazı kanser hücrelerinin, ATP'yi aerobik süreçten daha az verimli bir şekilde üretmesine rağmen, hızlı büyüme ve bölünme için enerjik taleplerini karşılamalarını sağlar 3,4,5. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, kanser progresyonunda metabolizmanın yeniden programlanmasının anlamını desteklemiştir. Bu nedenle, tümör enerjileri kansere karşı ilginç bir hedef olarak kabul edilir1. Enerjik metabolizmada ve temel öncüllerin tedarikinde merkezi bir merkez olarak, mitokondri, bugüne kadar sadece kısmen anladığımız bu hücre adaptasyonlarında kilit bir rol oynamaktadır.
Yukarıdakilere paralel olarak, mitokondriyal DNA (mtDNA) mutasyonları, bu metabolik yeniden programlamanın olası nedenlerinden biri olarak önerilmiştir; bu, bozulmuş bir elektron taşıma zinciri (ETC) performansına yol açabilir 6 ve bazı kanser hücrelerinin hayatta kalmak için neden glikolitik metabolizmalarını geliştirdiğini açıklayacaktır. Gerçekten de, mtDNA'nın kanser hücrelerinde mutasyonlar biriktirdiği, tümörlerin en az% 50'sinde mevcut olduğu bildirilmiştir7. Örneğin, Yuan ve ark. tarafından yürütülen yeni bir çalışma, böbrek, kolorektal ve tiroid kanserlerinde hipermutasyona uğramış ve kesilmiş mtDNA moleküllerinin varlığını bildirmiştir8. Dahası, birçok çalışma, bazı mtDNA mutasyonlarının daha agresif bir tümör fenotipi ve kanser hücrelerinin metastatik potansiyelindeki bir artışla ilişkili olduğunu göstermiştir 9,10,11,12,13,14,15,16.
Mitokondriyal genomun kanser progresyonundaki belirgin ilgisine rağmen, bu mutasyonların incelenmesi ve hastalığa katkıları, şu anda mevcut olan deneysel modellerdeki ve teknolojilerdeki sınırlamalar nedeniyle zor olmuştur17. Bu nedenle, mitokondri DNA'sının kanser hastalığının gelişimi ve ilerlemesindeki gerçek etkisini anlamak için yeni tekniklere ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, geleneksel sibridizasyon yöntemlerinin ana zorluklarının üstesinden gelen, izole mitokondri ile rodamin 6G ile önceden işlenmiş hücrelerin yeniden popülasyonuna dayanan, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden transmitokondriyal sibrid üretimi için bir protokol sunuyoruz18,19. Bu metodoloji, karşılık gelen ρ0 hücre hattının mevcudiyetine bakılmaksızın herhangi bir çekirdek donörünün kullanılmasına ve geleneksel teknikleri izleyerek enükleasyonu zor olan hücrelerden mitokondri transferine (yani, yapışkan olmayan hücre hatları) izin verir.

<table><tbody><tr><td>3500XL Genetik Analiz Cihazı;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4406016</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>AmpFlSTR Tanımlayıcı Plus PCR Amplifikasyon Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4427368</td><td></td></tr><tr><td>Anot Tampon Kabı 3500 Serisi</td><td></td> Borik asit 4393927 <td></td><td>Uygulanan Biyosistemler</td></tr><tr><td></td><td>PanReac</td><td>131015</td><td></td></tr><tr><td>Bradford tahlili</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Katot Tampon Kabı 3500 Serisi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4408256</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişeleri</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikoz</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131026</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör Teflon havaneli</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>L929 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean Tetra4 Jel Sistemi</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PCR primerleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Özel ürünler</td><td></td></tr><tr><td>Poliakrilamid Çözeltisi %30</td> <td>PanReac</td><td>A3626</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>POP-7</td><td>Piruvat</td><td>4393714</td><td></td></tr><tr><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>QIAmp DNA Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>Serum Fetal Sığır</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>SspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3132</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin / penisilin</td><td>PAN biyoteknoloji</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>P14030b</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td></td></tr></tbody></table>

kanser hücre hatlarını kullanarak İletimkokondriyal cybrid Üretimi

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Son yıllarda, mitokondri ve kanser arasındaki bağlantıyı tespit etmeye adanmış çalışmaların sayısı önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, mitokondri ve tümörigenezdeki değişiklikleri içeren bağlantıyı tam olarak anlamak ve tümörle ilişkili mitokondriyal fenotipleri tanımlamak için daha fazla çabaya ihtiyaç vardır. Örneğin, mitokondrinin tümörigenez ve metastaz süreçlerine katkısını değerlendirmek için, mitokondrinin farklı nükleer ortamlardaki tümör hücrelerinden etkisini anlamak önemlidir. Bu amaçla, olası bir yaklaşım, sözde cybrid hücrelerini elde etmek için mitokondrinin farklı bir nükleer arka plana aktarılmasından oluşur. Geleneksel sibridizasyon tekniklerinde, mtDNA'dan (ρ0, nükleer donör hücre) yoksun bir hücre hattı, enüklee hücrelerden veya trombositlerden türetilen mitokondri ile yeniden doldurulur. Bununla birlikte, enükleasyon işlemi, invaziv hücrelerde birçok durumda kısmen veya tamamen kaybolan bir özellik olan kültür plakasına iyi hücre yapışmasını gerektirir. Ek olarak, geleneksel yöntemlerde bulunan bir diğer zorluk, saf nükleer ve mitokondriyal DNA arka planları elde etmek için endojen mtDNA'nın mitokondriyal alıcı hücre hattından tamamen çıkarılmasını sağlamak ve üretilen sibritte iki farklı mtDNA türünün varlığından kaçınmaktır. Bu çalışmada, izole mitokondri ile rodamin 6G ile önceden işlenmiş hücrelerin yeniden popülasyonuna dayanan süspansiyon büyüyen kanser hücrelerine uygulanan bir mitokondriyal değişim protokolü sunuyoruz. Bu metodoloji, geleneksel yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelmemizi sağlar ve böylece kanser ilerlemesi ve metastazındaki mitokondriyal rolün anlaşılmasını genişletmek için bir araç olarak kullanılabilir.

Yukarıda sunulan protokolü izledikten sonra, korunmuş bir nükleer arka plana sahip, ancak yeni bir mitokondri genotipine sahip bir homoplazmik cybrid hücre hattı, Şekil 1 ve Şekil 2'deki şemalarda gösterildiği gibi elde edilmelidir. Sibritlerde bulunan mitokondriyal ve nükleer DNA'nın saflığı, Şekil 3'te gösterildiği gibi RFLP ve Şekil 4'te gösterildiği gibi nükleer DNA genotipleme analizi ile doğrulana...

Bu protokol, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden cybrid üretimi için bir tekniği, mitokondrinin tümörojenik süreçteki rolünü incelemek için bir araç olarak tanımlamaktadır.

Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletimkokondriyal Cybrid Üretimi

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Bu araştırma, mitokondriyonun kanser progresyonu ve metastazındaki katkısını daha iyi anlamayı amaçlamaktadır. İletimkokondriyal sibrid üretimi, mitokondriyal genotiplerin bir tümör hücresinin agresifliğine nasıl ve hangi seviyede dahil olduğunu aydınlatmamıza yardımcı olabilir. Kanserde mitokondriyal rol hakkında bilgi edinen teknolojilerden biri de sibrid üretimidir.Bu aracı, donatif elektroforez, solunum analizi ve diğer mitokondriyal fonksiyonel tahliller, akış sitometrisi, proteomikler vb. İçeren çeşitli diğer yöntemlerle birleştiriyoruz. Kanser hücrelerinin plastisitesi, nükleer ve mitokondriyal genler arasındaki etkileşim ağları ile birlikte, deneylerimizin ve veri yorumlamamızın karmaşıklığını arttırmaktadır. Yeni deneysel yaklaşımlar geliştirmek için gerekli olan nedenlerden biri de budur.Araştırmamızın en heyecan verici bulgularından biri, metastaz oluşumuna benzeyen ve hücreleri tamamen aerobik glikolize bağımlı hale getiren ve aynı zamanda in vivo modellerde daha tümörojenik ve metastatik hale getiren hücrelerin oyun çanağından ayrılmasıyla ilişkili iki mitokondriyal DNA mutasyonunun keşfi olmuştur. Bu mitokondri değişim protokolü, büyüyen kanser hücrelerinin askıya alınmasına uygulanabilir. Kronoloji, çekirdeklenme sürecinin ve mitokondriyal DNA'nın mitokondriyal alıcı hücre hatlarından tamamen çıkarılmasının sıklıkla gerçek bir zorluk haline geldiği geleneksel yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelebilir.

transmitochondrial-cybrid-generation-using-cancer-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Indüklenebilir ve ilgilenilen genin reversibl cDNA aşırı veya shRNA aracılı knock-down ile insan hücre hatları oluşturmak için bir hızlı ve kolay yolu. Bu yöntem geçici transfeksiyon yöntemleri veya konvansiyonel knockdown / nakavtla stratejileri değiştirmek zordur güvenilir ve son derece tekrarlanabilir işlemek hücre hatları için araştırmacılar sağlar.

Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi

Mitoz geçiren kanser hücrelerinde fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir. PJ-34 eradike insan meme kanseri MDA-MB-231 mitoz İlave sentrozom barındıran hücreler. Normal iki odak mitoz farklı olarak, ekstra-sentrozom PJ-34 varlığında iki kutup mili kümelenmiş değildi.

Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

Bu makale, dolaşımdaki tümör hücrelerinden (CTC'ler) prostat kanseri hastasından türetilen ksenogreftler (PDX'ler) oluşturmak için kullanılan bir yöntemi detaylandırmaktadır. CTC'lerden PDX modellerinin oluşturulması, prostat kanserini incelemek için alternatif bir deneysel model sağlar; En sık teşhis edilen tümör ve erkeklerde kanserden sık görülen bir ölüm nedenidir.

Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Burada, bir protokol (MitoCeption) GSC metabolizması ve fonksiyonları üzerine biyolojik etkilerini inceleyerek amacı ile glioblastoma kök hücreler (GSC) için, insan mezenkimal kök hücrelerin (MSC) izole mitokondri, transfer sunulmaktadır. Benzer bir protokol için diğer hücre tipleri arasında mitokondri aktarmak için adapte edilebilir.

MitoCeption: Glioblastoma Kök Hücreleri için İzole İnsan MSC kondriyayı aktarma

Burada, tek bir subtelomere bir MS2 sıra etiketi içeren kanser hücre klonlar oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım MS2 GFP sistemde güvenerek, endojen tutanaklar, telomeric tekrar içeren RNA (canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade TERRA) görselleştirme sağlar.

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Transmitokondrial sibridler, mitokondriyal DNA (mtDNA) tükenmiş hücrelerin (rho0 hücreleri) mitokondriyal bozukluklardan etkilenen hastalardan türetilen sitoplastlarla (enüklee hücreler) kaynaştırılmasıyla elde edilen melez hücrelerdir. Hastalığın nükleer veya mitokondriyal kökeninin belirlenmesine, biyokimyasal aktivitenin değerlendirilmesine ve mtDNA ile ilişkili varyantların patogenetik rolünün doğrulanmasına izin verir.

Mitokondriyal Disfonksiyonu Incelemek İçin In Vitro Bir Yaklaşım: Bir Cybrid Modeli

Burada, mitokondriyal izleme, mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) ve retinal pigment epitel hücrelerinin (ARPE19) doğrudan ko-kültür prosedürlerinin yanı sıra, MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasındaki TNT'ler yoluyla mitokondriyal alışverişi karakterize etmek için tünelleme nanotüpleri (TNT) oluşumunu ve mitokondriyal transferi gözlemleme ve istatistiksel olarak analiz etme yöntemlerini içeren bir protokol sunuyoruz.

Mezenkimal Kök Hücreler ve Retinal Pigment Epiteli Arasında İn Vitro Tünelleme Nanotüpleri Yoluyla Mitokondriyal Transfer

Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

Kanser tedavileri için direnç hastalık ilerleme ve ölüm katkıda bulunmaktadır. Direnci mekanik temelleri belirleme terapötik yanıt artırmak için önemlidir. Prostat kanseri (PC) yolları dissekan yardımcı olmak için taxane dayanıklı cep modelleri oluşturmak için protokol Docetaxel direnç PC hastalarda ilerleme dahil bu el yazması ayrıntılar.

Prostat kanseri hücre modelleri Anti-Mitotik Ajan Docetaxel direnç üretimi

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Öğrenin, kanser hücre hatlarından sitoplazmik hibrid üretimini kullanarak mitokondri genotiplerinin tümör agresifliğindeki rolünü araştırmayı. Bu yöntem, kanser ilerlemesindeki mitokondrial katkıları ortaya koyar.

Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletimkokondriyal Cybrid Üretimi

Daha fazla video keşfet