Name: FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT and RUN Analizi için Etkili Bir Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Öğrenin, fare uydu hücrelerinde FACS ile izolasyon ve CUT&RUN analizi yaparak kas hücrelerinde transkripsiyon düzenlemesini incelemeyi. Bu yöntem, kas hastalıkları için yeni tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mükemmel teknik yardım sağladığı için Anastasia Bannwarth'a teşekkür ederiz. IGBMC hayvan barınağı tesisine, hücre kültürüne, Fare Klinik Enstitüsü'ne (ICS, Illkirch, Fransa), görüntülemeye, elektron mikroskobuna, akış sitometrisine ve 'France Génomique' konsorsiyumunun (ANR-10-INBS-0009) bir üyesi olan GenomEast platformuna teşekkür ederiz.
Strazburg Üniversitesi, CNRS ve Inserm'in ITI 2021-2028 programının bir parçası olarak Disiplinlerarası Tematik Enstitüsü IMCBio'nun bu çalışması, Geleceğe Yönelik Fransız Yatırımları Programı çerçevesinde IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ve SFRI-STRAT'US projesi (ANR 20-SFRI-0012) ve EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) tarafından desteklenmiştir. INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon stratejik programı 24376 (DD'ye), INSERM genç araştırmacı hibesi (DD'ye), ANR-10-LABX-0030-INRT ve ANR tarafından Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02) çerçeve programı kapsamında yönetilen bir Fransız Devlet fonu tarafından ek finansman sağlandı. J.R., Université franco-allemande ve Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation'dan CDFA-07-22 Programı ve K.G. Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI) tarafından desteklenmiştir.

Fare Uzuv Kaslarından Uydu Hücre İzolasyonu ve Akış Sitometrisi Analizi

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+progenitor+cells+and+the+role+of+Pax+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes.</a> Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).</li>
<li>Tosic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lsd1+regulates+skeletal+muscle+regeneration+and+directs+the+fate+of+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 366(2018).</li>
<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
<li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
<li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles%3A+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li>
<li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).</li>
<li>Rovito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myod1+and+GR+coordinate+myofiber-specific+transcriptional+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+Sparse+Enrichment+Analysis+for+CUT%26RUN+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Atlas+2021+update%3A+a+data-mining+suite+for+exploring+epigenomic+landscapes+by+fully+integrating+ChIP-seq%2C+ATAC-seq+and+Bisulfite-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data.</a> Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+human+islet+isolation+utilizing+recombinant+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase.</a> Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).</li>
<li>Nikolic, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+collagenase+XI+and+liberase+H1+for+the+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets.</a> Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2C12+myoblastoma+cell+differentiation+and+proliferation+is+stimulated+by+androgens+and+associated+with+a+modulation+of+myostatin+and+Pax7+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).</li>
<li>Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+modulation+of+the+nuclear+receptor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).</li>
<li>Billas, I., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+controls+of+nuclear+receptor+function+in+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).</li>
<li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li>
<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 6, 35(2016).</li>
<li>Schultz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+satellite+cell+population+in+postnatal+mouse+lumbrical+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle.</a> The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).</li>
<li>Hyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+pancreatic+digestion+with+liberase+versus+collagenase+on+the+yield%2C+function+and+viability+of+neonatal+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets.</a> Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, fare uydu hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için standartlaştırılmış, güvenilir ve gerçekleştirmesi kolay bir yöntemin yanı sıra CUT & RUN yöntemi ile transkripsiyonel regülasyonun değerlendirilmesini bildirmektedir.
Bu protokol birkaç kritik adımı içerir. Birincisi, çok sayıda toplanan hücreyi sağlamak için kas bozulması ve lif sindirimidir. Artan enzim konsantrasyonuna rağmen, Protokol 1 kullanılandan daha fazla canlı hücre elde edildi. Uydu hücreleri, çeşitli zar proteinlerinin...

İskelet çizgili kaslar, toplam insan vücudunun ağırlığının ortalama %40'ını temsil eder1. Kas lifleri, yeni oluşan miyositlerin füzyonu ve hasarlı olanların yerini alan yeni miyoliflerin üretilmesi ile tanımlanan yaralanma üzerine rejenerasyon için dikkate değer bir kapasite sergiler2. 1961'de Alexander Mauro, uydu hücreleri3 olarak adlandırdığı bir mononükleer hücre popülasyonu bildirdi. Bu kök hücreler, transkripsiyon faktörü eşleştirilmiş kutu 7'yi (PAX7) eksprese eder ve bazal lamina ile kas liflerininsarkolemması arasında bulunur 4. Farklılaşma kümesini 34 (CD34; hematopoietik, endotelyal progenitör ve mezenkimal kök hücre belirteci), integrin alfa 7 (ITGA7; pürüzsüz, kardiyak ve iskelet kası belirteci) ve ayrıca CXC kemokin reseptörü tip 4'ü (CXCR4; bir lenfosit, hematopoietik ve uydu hücresi belirteci) ifade ettikleri bildirilmiştir5. Bazal koşullarda, uydu hücreleri, onları hareketsiz bir durumda tutan belirli bir mikro ortamda bulunur6. Kas hasarı üzerine aktive olurlar, çoğalırlar ve miyojenez7'ye uğrarlar. Bununla birlikte, toplam kas hücresi sayısının sadece küçük bir kısmına katkıda bulunan genom çapındaki analizleri, özellikle fizyolojik ortamlarda (toplam hücrelerin% <1'i) özellikle zordur.
Uydu hücrelerinden kromatin izolasyonu için, kromatin immünopresipitasyonunu takiben büyük paralel dizileme (ChIP-seq) veya hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT & Tag) deneylerini içeren çeşitli yöntemler tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu iki teknik, tartışmasız kalan bazı önemli sınırlamalar sunmaktadır. Gerçekten de, ChIP-seq, sonikasyon adımı sırasında büyük bir kısmı kaybolan yeterli kromatin üretmek için yüksek miktarda başlangıç malzemesi gerektirir. CUT & Tag, düşük hücre sayısı için daha uygundur, ancak Tn5 transpozaz aktivitesi nedeniyle ChIP-seq'den daha fazla hedef dışı bölünme bölgesi oluşturur. Ek olarak, bu enzim açık kromatin bölgeleri için yüksek bir afiniteye sahip olduğundan, CUT & Tag yaklaşımı, susturulmuş heterokromatin8,9 yerine, genomun aktif olarak kopyalanan bölgeleriyle ilişkili histon modifikasyonlarını veya transkripsiyon faktörlerini analiz etmek için tercihen kullanılabilir.
Burada, fare uzuv kas uydu hücrelerinin FACS ile hedeflerin altında bölünme için izolasyonuna ve nükleaz (CUT & RUN)10,11 analizi kullanılarak serbest bırakılmasına izin veren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Çeşitli adımlar, dokunun mekanik olarak bozulmasını, hücre sıralamasını ve çekirdek izolasyonunu içerir. Yöntemin, canlı bir hücre süspansiyonunun hazırlanmasına ilişkin etkinliği, kovalent histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörleri için CUT & RUN analizi yapılarak gösterilmiştir. İzole edilmiş hücrelerin kalitesi, tarif edilen yöntemi, doğal genomik doluluk durumunu aslına uygun olarak yakalayan kromatin hazırlamak için özellikle çekici kılar ve kromozom konformasyonunu, spesifik lokuslarda (4C-dizilimi) veya genom çapında seviyelerde (Hi-C) yüksek verimli dizileme ile kombinasyon halinde yakalamak için uygun olması muhtemeldir.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL mikrotüp</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>2 mL mikrotüp</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tüpler</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>anti-AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>anti-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-DMD</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K27ac</td><td>Aktif Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K4me2</td><td>Aktif Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>anti-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>anti-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>anti-TER119</td><td>BD Pharmingen TM</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag &reg; Plus Concanavalin A</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci 100 & m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431752</tr><tr><td>Hücreli Süzgeç 40 & m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci 70 & m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431751</tr><tr><td>Santrifüj 1</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>Santrifüj 5415 R</td></tr><tr><td>Santrifüj 2</td><td>Eppendorf</td><td>5805000010</td><td>Santrifüj 5804 R</td></tr><tr><td>Hazneli Slayt Sistemi&nbsp;</td><td>ThermoFischer</td><td>171080</td><td>Syst&egrave; ben Nunc&ticaret; Lab-Tek ve ticaret; Hazne Slayt</td></tr><tr><td>Temizleme maddesi</td><td>Sigma&nbsp; &nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>Kollajenaz, tip I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>KÖK HÜCRE teknolojileri</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Lekesi</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD FACSAria&trade; Füzyon Akış Sitometresi</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td>Genom tarayıcısı<td>ile Fluoromount G</td></tr><tr><td>&</td><td>IGV</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/ Gliserol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojel</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC onaylı matris</td></tr><tr><td>Görüntü işleme yazılımı</td><td>Image J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>Laboratuvar filmi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg; M</td></tr><tr><td>Liberaz LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Propil gallat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Sıralayıcı&nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan su banyosu</td><td>Biyoblok Bilimsel polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

facs ile İzole edilmiş fare uydu hücrelerinin cut&amp;run analizi için etkili bir protokol

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Küçük hücre popülasyonları ile genom çapında analizler, özellikle kök hücre alanındaki çalışmalar için büyük bir kısıtlamadır. Bu çalışma, yüksek yapısal protein içeriğine sahip bir doku olan ekstremite kasından uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) izolasyonu için etkili bir protokolü açıklamaktadır. Yetişkin farelerden alınan disseke ekstremite kasları, dispas ve tip I kollajenaz ile takviye edilmiş besiyerinde kıyma ile mekanik olarak bozuldu. Sindirimden sonra, homojenat hücre süzgeçlerinden süzüldü ve hücreler FACS tamponunda süspanse edildi. Canlılık, sabitlenebilir canlılık boyası ile belirlendi ve immün boyalı uydu hücreleri FACS ile izole edildi. Hücreler Triton X-100 ile parçalandı ve serbest bırakılan çekirdekler konkanavalin A manyetik boncuklarına bağlandı. Çekirdek/boncuk kompleksleri, ilgilenilen transkripsiyon faktörüne veya histon modifikasyonlarına karşı antikorlarla inkübe edildi. Yıkamalardan sonra, çekirdek/boncuk kompleksleri protein A-mikrokok nükleazı ile inkübe edildi ve CaCl2 ile kromatin bölünmesi başlatıldı. DNA ekstraksiyonundan sonra, kütüphaneler oluşturuldu ve dizilendi ve genom çapında transkripsiyon faktörü bağlanması ve kovalent histon modifikasyonları için profiller biyoinformatik analiz ile elde edildi. Çeşitli histon işaretleri için elde edilen pikler, bağlanma olaylarının uydu hücrelerine özgü olduğunu gösterdi. Ayrıca, bilinen motif analizi, transkripsiyon faktörünün, aynı kökenli yanıt elemanı aracılığıyla kromatine bağlı olduğunu ortaya çıkardı. Bu nedenle bu protokol, yetişkin farelerde uzuv kas uydu hücrelerinde gen regülasyonunu incelemek için uyarlanmıştır.

Fare iskelet kaslarından uydu hücreleri, Gunther ve ark. (bundan sonra Protokol 1)12 ve Liu ve ark.23 (bundan sonra Protokol 2 olarak anılacaktır). Protokol 1'de önerilen kollajenaz ve dispas konsantrasyonu kullanılırken sindirimden sonra sindirilmemiş kas lifleri gözlendiğinden, adım 1.2.1 ve 1.2.3'te açıklandığı gibi kas lifi ayrışmasını iyileştirmek için enzim miktarı arttırılmıştır. Protokol 2'de belirtildiği gibi, numuneler hücre canlılığını korumak için bir su banyosu...

Burada sunulan, fare uzuv kas uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) izolasyonu için, hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT &RUN) kullanılarak salım yoluyla kas liflerinde transkripsiyon regülasyonu çalışmasına uyarlanmış etkili bir protokoldür.

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&amp;RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

20 yılı aşkın bir süredir laboratuvarımız nükleer reseptörlerin patofizyolojik rolü ile ilgilenmektedir. İn vivo işlevlerini deşifre etmek için, ifadelerinin uzamsal ve zamansal kontrolüne izin veren fare modelini tasarladık. Buna paralel olarak, fare dokularındaki moleküler işlevlerini araştırmak için en son teknikleri geliştirdik.Son zamanlarda bilimsel ilgimiz, iskelet kası da dahil olmak üzere çeşitli dokularda sekosteroid ve steroid reseptör sinyalizasyonunu belirlememize yol açtı. Son zamanlarda, iskelet kası hücrelerini farklılaştıran miyoliflerdeki androjen reseptörünün, kasılma ve metabolik işlevlerinde etkili olduğunu gösterdik. Son bulgularımız, kasla ilişkili bozukluklar için etkili tedaviler geliştirmek için çok önemli olan iskelet kası patofizyolojik dinamiklerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.Bu protokolü, in vivo olarak kas kök hücreleri üzerinde sistrom analizi yapabilmek için geliştirdik. Tüm eski protokoller in vitro modaller olarak kullanılmıştır, bu da araştırmayı tüm organizma bağlamından tamamen ayırır. Düşük maliyetli ve zaman açısından verimli olmasının yanı sıra, bu protokol iskelet kası progenitör hücrelerinde transkripsiyon faktörü alımını ve kromatin manzarasını incelemek için etkili bir deneysel ortam sağlar.Bu protokol ile hazırlanan kromatin, uydu hücrelerinde AR sistromunun ilk genom çapında analizini sağlamıştır ve gen regülasyonu ile ilgili gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır. Birçoğu arasında, gelecekteki amacımız bu araştırmaları diğer oksosteroid reseptörlerine genişletmek ve iskelet kasındaki rejenerasyon sürecinde yer alan çeşitli hücre tiplerinde spesifik ortak düzenleyicilerini keşfetmek olacaktır.

an-efficient-protocol-for-cut-run-analysis-facs-isolated-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Burada sunulan yöntem, HSPC'lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC'ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

CUT&amp;RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&amp;RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP'lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.

FACS-İzolasyon ve Fibro-Adipojenik Progenitörlerin ve Kas Kök Hücrelerinin Bozulmamış ve Yaralı Fare İskelet Kasından Kültürü

Epigenetik alanda yeni olan araştırmacılar, CUT &amp; Tag'i ChIP tahlillerine göre önemli ölçüde daha kolay bir alternatif bulacaklar. CUT &amp; Tag, nadir ve birincil hücre popülasyonları üzerindeki epigenetik çalışmalardan büyük ölçüde yararlandı ve çok az hücreden yüksek kaliteli veriler üretti. Bu protokol, fare arka bacak kaslarından izole edilen fare miyoblastları üzerinde H3K4me1 CUT &amp; Tag testlerinin gerçekleştirilmesini açıklar.

Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT &#38; Tag) Testinin Kullanılması

Bu protokol, HEK-293T hücrelerinde NHEJ ve HR'nin etkinliğini ölçmek için bir ekstrakromozomal homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) testi ve homolog rekombinasyon (HR) testini tanımlar.

HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi

ScRNA-seq gereksinimlerini karşılayan fare beyni kortikal perisitlerini elde etmek için, CD13⁺/CD31⁻ seçimine dayalı kritik optimize edilmiş bir FACS protokolü sunuyoruz. Ana iyileştirmelerimiz, hücre canlılığını ve RNA bütünlüğünü önemli ölçüde artırır ve güvenilir transkriptomik profilleme imkanı sağlar.

Fare Kortikal Dokusundan Perisitlerin Tek Hücreli Dizileme için FACS Kullanılarak İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Öğrenin, fare uydu hücrelerinde FACS ile izolasyon ve CUT&RUN analizi yaparak kas hücrelerinde transkripsiyon düzenlemesini incelemeyi. Bu yöntem, kas hastalıkları için yeni tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Daha fazla video keşfet