Name: Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Keşfedin, elektron mikroskobu ve 3D rekonstrüksiyon teknolojisini birleştirerek pankreas kanseri hücrelerindeki mitokondriyal ultrastrüktürel değişiklikleri yüksek çözünürlükle görüntüleyin. Bu yöntem, organel morfolojisinin nitel ve nicel analizini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (Z23H290001, LY19H280001) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (82274364, 81673607 ve 81774011); Huzhou Bilim ve Teknoloji Hibesi'nin Kamu Refahı Araştırma Projesi'nin yanı sıra (2021GY49, 2018GZ24). Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Tıbbi Araştırma Merkezi Kamu Platformu'ndan gelen büyük yardım, teknik destek ve deneysel destek için teşekkür ederiz.

1. Malzeme hazırlığı
<ol><li>12 mL DMEM ortamında (%10 fetal sığır serumu ve 100 U/mL penisilin-streptomisin) 2 x 106 Panc02 hücresini kültürleyin ve 48 saat boyunca %5 karbondioksit ve %95 hava atmosferinde 37 °C ve %95 nemde muhafaza edin.</li>
	<li>Panc02 hücrelerini toplayın, 28 x g'de 2 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Numunenin uygun boyutta (1 x 107 hücre) olduğundan emin olun, aksi takdirde aşağıdaki fiksasyon ve dehidrasyon adımları iyi çalışmayacaktır.</li>
	<li>Taze Panc02 hücrelerini 1.5 mL mikro santrifüj tüplerine gece boyunca 4 °C'de sabitlemek için fiksatif olarak 1 mL %2.5 glutaraldehit ekleyin. NOT: Numunelerin, aşağıdaki adımların her birinde (adım 1.3-1.11) 5 dakika boyunca 1.006 x g'da santrifüjlenmesi gerekir.</li>
	<li>Fiksatifi aspire edin ve numuneleri 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez durulayın ve ardından her biri 10 dakika oda sıcaklığında çift damıtılmış su (ddH2O) ile iki kez durulayın.</li>
	<li>1 saat boyunca 4 ° C'de 1:1 oranında% 1 osmiyum tetroksit (OsO4) ve% 1.5 potasyum ferrosiyanür içeren 50 μL çözelti ekleyin. Ardından, her seferinde 10 dakika boyunca 0.1 M PBS ile iki kez durulayın ve 10 dakika daha ddH2O ile durulayın.</li>
	<li>1 mL% 1 tiyokarbohidrazid (TCH) ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika ila 1 saat inkübe edin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca dört kez ddH2O ile durulayın.</li>
	<li>50 μL% 1 OsO4 ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat sabitleyin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca dört kez ddH2O ile durulayın.</li>
	<li>Gece boyunca 4 °C'de 1 mL %2 uranil asetat ekleyin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca dört kez ddH2O ile durulayın.</li>
	<li>İlave 1 saatlik inkübasyon için 60 ° C'de 1 mL Walton çözeltisi (10 mL 0.03 mol / L aspartik asit stok çözeltisi içinde çözülmüş 0.066 g kurşun nitrat) ekleyin.</li>
	<li>ddH2O ile her seferinde 10 dakika boyunca dört kez durulayın ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca kademeli bir alkol serisinde kurutun:% 50 alkol,% 70 alkol,% 80 alkol ve% 90 alkol 1x ve% 100 alkol 2x. Ardından, her seferinde 10 dakika boyunca iki kez %100 asetonda kurutun. Dehidrasyon için her çözeltiden 1 mL kullanın.</li>
	<li>200 μL asetonu Pon 812 epoksi reçine ile 3:1, 1:1 ve 1:3 oranında karıştırın. Numuneyi sırasıyla 2 saat, 4 saat ve 4 saat oda sıcaklığında reçineye batırın ve ardından gece boyunca emprenye etmek için %100 Pon 812 epoksi reçineyi alın. NOT: Boyama ve reçine gömme adımlarını gerçekleştirirken, bunlar toksik maddeler olduğundan çeker ocakta çalıştırılması önemlidir. Ek olarak, deney sırasında laboratuvar önlükleri ve solvente dayanıklı eldivenler giyilmelidir.</li>
	<li>Numuneleri bir gömme kalıba koyun ve ardından polimerize olması için 48 saat boyunca 60 °C'de bir fırına koyun. Numunenin etrafındaki reçine görünümünü azaltmak için düz gömme29 kullanın. Bu, numune kurulumunu basitleştirir ve şarj artefaktlarının sonraki görüntü segmentasyonu üzerindeki etkisini azaltır. NOT: Daha sonra yatay bir kesme yüzeyi oluşturmak için, aşırı doldurmamaya dikkat ederek kalıp deliğine az miktarda reçine eklenebilir.</li>
	<li>Silikon gofretleri önce yıkayarak ve ardından konsantreH2S04/H2O2solüsyonu ile 30 dakika hidrofilize ederek hazırlayın. Hidrofilize silikon gofretler üzerinde 70 nm kalınlığında seri dilim şeritleri ultramikrotom kullanarak toplayın ve 60 °C fırında 10 dakika kurutun. NOT: Dilim kaybını veya deformasyonunu önlemek için dilim gofretlerin yüzeyine doğru yüzerken dilimi yavaşça yakalayın.</li>
</ol>2. Görüntü elde etme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon
<ol><li>Sahneye bir silikon gofret monte etmeden önce, bölümleri üç kez damıtılmış suyla yıkayın ve havayla kurutun. 1 cm x 0,5 cm boyutunda iletken bir karbon bant kesin ve numune kurulumunu tamamlamak için bunu silikon gofret ile SEM numune aşaması arasına yapıştırın (Şekil 2E).</li>
	<li>FE-SEM hızlandırma voltajı parametresini 2 mm çalışma mesafesi ile 4 kV'a ayarlayın (Şekil 3B ve Tablo 1). NOT: Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek ve görüntüdeki paraziti azaltmak için, mümkün olduğunca düşük büyütme oranlarında gözlemleyin. Çoklu arttıkça, SEM'in tarama aralığı azalır ve bu da görüntülerde yük birikiminde bir artışa yol açar.</li>
	<li>Üst menü çubuğundaki H/L simgesine tıklayın. İlk olarak, düşük büyütmede, hedef dilim şeritlerinin ilk bölümünü yönlendirin ve ardından yüksek büyütme moduna geçmek için Y /Y seçeneğine (Şekil 3A) tekrar tıklayın; Görüntü parlaklığını, kontrastını ve büyütmesini ayarlayarak ilgilenilen yapıya uygun bir görüntü toplayın.</li>
	<li>Proje Görünümü > Açık Veri'yi seçin ve analiz edilecek görüntü dosyalarını yazılıma aktarın.</li>
	<li>Dilimleri Hizala > Düzenle'ye tıklayarak resimleri hizalayın (Şekil 4B) ve görüntü saydamlığını değiştirerek sol alt menü çubuğundaki Yoğunluk Aralığı değerini ayarlayın. Burada yarı otomatik bir hizalama stratejisi kullanın; Özellikle, otomatik hizalama yoluyla, resimlerin önceki bir resimle çakışmasını sağlayın ve ardından manuel ince ayar yapın. NOT: Bu çalışmada, hizalama işlemi sırasında, bir önceki görüntü referans olarak kullanılmış ve iki görüntünün hedef yapısını maksimum düzeyde örtüştürmek için taşıma ve döndürme işlemlerinden yararlanılmıştır. Geçerli Dilim Çiftini Hizala'ya tıklamak, görüntülerin otomatik olarak hizalanmasına yardımcı olabilir, ancak yanlış yerleştirme meydana gelebilir.</li>
	<li>Alt Birimi Ayıkla modülünü seçin ve hizalanmış veri kümelerini tüm yığının çakışan kısmının boyutuna sığacak şekilde kırpın.</li>
	<li>Segmentasyon alt bölümünün altında (Şekil 4C), Segmentasyon > Kaydet> Yeniden Örnekle'yi seçin. Sihirli Değnek eşiğini ve boyutunu seçin Fırça doğru aralığı seçmek için araç. Burada yine, uygun bir geniş alanı otomatik olarak seçmek için önce Sihirli Değnek'i kullanarak yarı otomatik bir segmentasyon yöntemini benimseyin ve ardından ayrıntıları doğru bir şekilde tanımlamak için Fırçayı kullanın. NOT: Sihirli Değnek , Maskeleme değerini değiştirerek ve Çizim Sınırı Çizgisi kullanılarak, ilgilenilen yapı ile çevresindeki yapılar arasında var olan piksel yoğunluğundaki bariz farklılıklara dayalı olarak görüntüleri bölümlere ayırmak için uygulanabilir. Görüntü alımı sırasında oluşan şarj artefaktlarını ayırt edemez. Bu nedenle, hedef bölgeler için yanlış segmentasyona neden olabilir. Fırça aracı, biyolojik yapıları doğru bir şekilde yeniden yapılandırmak için manuel olarak bölümlere ayırmak için kullanılabilir.</li>
	<li>Segmentasyon > Seçimi altında, seçilen alanı eklemek için + simgesine tıklayın (Şekil 4C).</li>
	<li>İlgilenilen mikro yapıları yeniden oluşturmak için seçim tamamlanana kadar farklı görüntülerde aynı hedef yapıyı seçmek için yukarıdaki adımı (2.8) tekrarlayın. NOT: Mitokondriyal yeniden modelleme işlemleri sırasında, hedef nesnenin seçimi, bir grup ardışık görüntünün ortasındaki resimden yapılmalıdır. Gerekli alan ilk veya son resimden seçilirse, rekonstrüksiyon sonucu tam bir 3D görselleştirme sunamayacaktır.</li>
	<li>Bölgesel segmentasyonu tamamladıktan sonra, nesnenin boyutu ve resim çözünürlüğü için en iyi sonuçlara göre görüntü dosyasını oluşturun. Kırpma Düzenleyicisi'ne tıklayın ve ardından Sanal Kaydırıcı kutusuna 6 sayısını girin (Şekil 4C).</li>
	<li>Soldaki açılır menüde, Proje alt bölümünün altındaki gri alana sağ tıklayın ve Yüzey Oluştur > Oluştur > Uygula'yı seçin. Oluşturulan dosyada, yüzey yapısını ve 3B gösterimi oluşturmak için Yüzey Görünümü modülünü kullanın.</li>
</ol>3. Niceleme
<ol><li>Küçük Noktaları Kaldır'a tıklayın > uygulayın (Şekil 4D). Proje alt bölümünün altında, gri alana sağ tıklayın ve Etiket Analizi > Uygula'yı seçin (Şekil 4D).</li>
	<li>Sütunun adını özelleştirin ve bir ölçü grubu seçin. Yerel Ölçümler kutusundan Volume3d ve Length3d'yi seçin. </li>
	<li>Ekranın sol alt köşesindeki Uygula düğmesine tıklayın. Verileri kopyalayın ve GraphPad gibi istatistiksel yazılımlarda grafik çizin.</li>
</ol>

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Cristae'yi Görselleştirmek için 3D Teknik

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Burada sunulan yöntem, seri ultra ince kesitlerden oluşturulan 2D tomografik görüntülerin istiflenmesine ve segmentasyonuna elektron mikroskobu ve görüntü işleme teknolojisinin uygulanmasını içeren 3D rekonstrüksiyon tekniğini uygulamak için adım adım yararlı bir kılavuzdur. Bu protokol, yapıların yüksek çözünürlük düzeyinde güçlü tekrarlanabilirliği ve daha yüksek doğrulukta avantajlarına sahip olan organel üst yapısının 3D görselleştirilmesi ile ele alınabilecek 2D görüntülerin bir sınırlamasını vurgulamaktadır. Daha d...

Mitokondri, hücredeki en önemli organellerden biridir. Hücresel biyoenerjetik ve metabolizmanın merkezi olarak hizmet ederler 1,2 ve kanserde kritik bir rol oynarlar3. Pankreas kanseri (PK), hızlı yayılımı ve yüksek ölüm oranı nedeniyle tedavisi en zor kanserlerdenbiridir. Esas olarak mitokondriyal morfolojideki 3,5,6,7 değişikliklerin neden olduğu mitokondriyal disfonksiyon, PC8'in altında yatan hastalık mekanizmalarıyla ilişkilendirilmiştir. Mitokondriler de oldukça dinamiktir, bu da ağ bağlantılarındaki ve cristae yapılarındaki sık ve dinamik değişikliklerle yansıtılır9. Cristae yapısının yeniden şekillendirilmesi, tümör hücresi büyümesi, metastaz ve tümör mikroçevre değişiklikleri sırasında önemli ölçüde değişen mitokondriyal fonksiyonu vehücresel durumu 10,11 doğrudan etkileyebilir12,13.
Son yıllarda, bilim adamları bu organeli EM gözlemi14,15,16,17; örneğin, araştırmacılar 3D rekonstrüksiyon tekniklerini kullanarak mitokondriyal dinamiklerianaliz ettiler 6,7,18,19. Elektron mikroskobu görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu için genel konsept ve yöntem resmi olarak 196820 gibi erken bir tarihte oluşturuldu ve T4 faj kuyruğunu yeniden yapılandırmak için elektron mikroskobu, elektron kırınımı ve bilgisayar görüntü işlemenin birleştirilmesini içeriyordu. Şimdiye kadar, elektron mikroskobu 3D görüntüleme teknolojisi, görüntü çözünürlüğü 21, otomasyon derecesi22 ve işlem hacmi 23 açısından önemli ilerlemeler kaydetmiş ve biyolojik araştırmalarda doku seviyesinden nanometre ölçeğindeorganel ultrayapı seviyesine kadar giderek daha geniş bir ölçekte kullanılmaktadır24. Son yıllarda, elektron mikroskobu 3D görüntüleme de çok çeşitli uygulamalar için umut verici bir teknoloji haline gelmiştir25,26,27.
Mitokondriyal kristalara artan ilgi, özellikle ultrastrüktürel hacim görüntüleme için temel gereksinimleri göstermektedir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), bir bakır ızgara (400 mesh)28 üzerinde toplanan numuneleri, kesitten geçen elektron ışını ile görselleştirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bakır ızgaranın sınırlı aralığı nedeniyle, aynı numunenin sürekli dilimlerini tam olarak görüntülemekimkansızdır 29. Bu, TEM görüntüleme sırasında hedef yapıların incelenmesini zorlaştırır. Ek olarak, TEM, birden fazla dilimin kesilmesi ve toplanması ve bunların sırayla görüntülenmesi21 dahil olmak üzere zaman alıcı ve hataya açık manuel görevlere dayanır, bu nedenle büyük hacimli numunelerin ultrastrüktürel rekonstrüksiyonları için uyarlanmamıştır23. Şu anda, büyük hacimli numune görüntülemenin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonu, TEM kamera dizisi (TEMCA)30 veya iki ikinci nesil TEMCA sistemi (TEMCA2)31 gibi kısa sürede otomatik yüksek verimli görüntülemeye olanak tanıyan özel ekipmanların kullanılmasıyla gerçekleştirilmektedir. Bununla birlikte, bu tür görüntüleme, özelleştirilmiş ekipman gereksinimi nedeniyle elde edilmesi kolay ve evrensel olma avantajına sahip değildir.
TEM ile karşılaştırıldığında, SEM32,33'e dayalı geniş alanlar için otomatik olarak binlerce seri hacimsel görüntü oluşturma yöntemi, seri görüntülemenin verimliliğini ve güvenilirliğini artırır ve daha yüksek z-çözünürlükleri sunar 34. Örneğin, seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) ve odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM), yüksek hız, verimlilik veçözünürlük 35,36 ile ultrayapının 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmeyi mümkün kılmıştır. Bununla birlikte, blok yüzeyinin SBF-SEM'in elmas bıçağı ile veya FIB-SEM33,37'nin odaklanmış iyon ışını ile frezelenerek mekanik olarak traşlanması kaçınılmazdır. İki yöntemin numunelere zarar vermesi nedeniyle, daha fazla analiz için aynı hedef yapıyı tekrar oluşturmak mümkün değildir38,39,40. Ek olarak, az sayıda çalışma, patolojik değişiklikleri gözlemlemek için EM kullanarak kanser hücrelerinin 3D organel ultrayapısını yeniden yapılandırmaya çalışmıştır12. Bu nedenlerden dolayı, pankreas kanseri hücreleri gibi kanser hücrelerinin patolojik mekanizmalarını daha fazla aydınlatmak için, mitokondriyal üst yapıyı kristae seviyesinde analiz etmek için bir ultramikrotom ve bir alan emisyon taramalı elektron mikroskobu (FE-SEM) kullanarak seri kesit görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu için yeni bir teknoloji öneriyoruz; Bu teknoloji ile verimli ve erişilebilir bir yöntem kullanılarak yüksek çözünürlüklü veriler elde edilebilir. Bir ultramikrotom kullanılarak yapılan seri ultra ince kesitler, bir ızgara kutusunda yarı kalıcı olarak saklanabilir ve birkaç yıl sonra bile birden çok kez yeniden görüntülenebilir41. FE-SEM, yüksek çözünürlüklü görüntüleme, yüksek büyütme ve çok yönlülük sağlama yeteneği nedeniyle çeşitli araştırma alanlarında bir araç olarak oldukça değerlidir42. Organellerin ince yapısını 3D olarak sergilemek amacıyla, FE-SEM43,44 tarafından üretilen geri saçılan elektronları kullanarak faydalı çözünürlüğe sahip seri 2D görüntü yığınları üretme tekniği, özel ekipman olmadan hedef bölgelerin veya bunlarla ilişkili yapıların yüksek verimli ve çok ölçekli görüntülemesini elde etmek için de kullanılabilir 45. Yük artefaktlarının oluşturulması, elde edilen görüntülerin kalitesini doğrudan etkiler, bu nedenle bekleme süresini kısa tutmak özellikle önemlidir.
Bu nedenle, bu çalışma, mitokondriyal cristae46'nın 3 boyutlu yapısını yeniden yapılandırmak için bu SEM tekniğinde kullanılan deneysel prosedürleri detaylandırmaktadır. Spesifik olarak, mitokondriyal bölgelerin yarı otomatik segmentasyonunu elde etmek ve geleneksel OTO numune hazırlama yöntemi44,47 kullanılarak dilim numuneleri yapmayı da içeren Amira yazılımını kullanarak 3D rekonstrüksiyonu dijitalleştirmek için geliştirilen süreci gösteriyoruz, ultramikrotom dilimleme kullanarak kesit koleksiyonunu tamamlama ve FE-SEM ile sıralı 2D veriler elde etme.

<table><tbody><tr><td>(1S,3R)-RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>SIGMA</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Görüntüleme</td><td></td><td>2020.2</td></tr><tr><td>Aspartik asit</td><td>MCE</td><td>HY-42068</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Kartal'ı s orta</td><td>Gibco</td><td>11995115</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>MCE</td><td>HY-100579</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Alan emisyon taramalı elektron mikroskobu</td><td>HITACHI</td><td>SU8010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10500.22</td><td></td></tr><tr><td>Kurşun nitrat</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-211724</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-206008B</td><td></td></tr><tr><td>Panc02</td><td>Avrupa Doğrulanmış Hücre Kültürleri Koleksiyonu&nbsp;</td><td></td><td></td>98102213</tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Biosharp</td><td>BL505A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Pon 812 Epoksi reçine</td><td>SPI CHEM</td><td>GS02660</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum ferrosiyanür</td><td>Macklin</td><td>P816416</td><td></td></tr><tr><td>Tiyokarbohidrazid</td><td>Merck</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>LEICA</td><td>EMUC7</td><td></td></tr><tr><td>Uranil Asetat</td><td>RHAWN</td><td>R032929</td><td></td></tr></tbody></table>

pankreas kanseri hücrelerinde mitokondriyal ultrastrüktürel değişikliklerin görselleştirilmesi için Üç boyutlu bir teknik

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Sadece bilinmeyen bilgiler açısından zengin değil, aynı zamanda üç boyutlu (3D) bir bakış açısıyla da sofistike olan hücre organeli üst yapısının dinamik özelliklerinin anlaşılması, mekanik çalışmalar için kritik öneme sahiptir. Elektron mikroskobu (EM) iyi bir görüntüleme derinliği sunar ve nanometre ölçeğinde bile hücresel organellerin ultrastrüktürel morfolojisini araştırmak için yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarının yeniden yapılandırılmasına izin verir; bu nedenle, 3D rekonstrüksiyon, eşsiz avantajları nedeniyle önem kazanmaktadır. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), aynı ilgi bölgesinden büyük yapıların ardışık dilimler halinde 3D olarak yeniden yapılandırılmasına olanak tanıyan yüksek verimli bir görüntü elde etme teknolojisi sağlar. Bu nedenle, organellerin gerçek 3D ultrayapısını eski haline getirmek için büyük ölçekli 3D rekonstrüksiyonda SEM uygulaması giderek daha yaygın hale geliyor. Bu protokolde, pankreas kanseri hücrelerinde mitokondriyal kristaları incelemek için seri ultra ince kesit ve 3D rekonstrüksiyon tekniklerinin bir kombinasyonunu öneriyoruz. Bu tekniklerin nasıl uygulandığının ayrıntıları, osmiyum-tiyokarbohidrazid-osmiyum (OTO) yöntemi, seri ultra ince kesit görüntüleme ve görselleştirme ekranı dahil olmak üzere bu protokolde adım adım açıklanmaktadır.

Hücre kültürü sırasında (Şekil 1A), önce pankreas kanseri hücrelerini tam kültür ortamı ile kültürlenmiş bir kontrol grubuna, bir (1S, 3R)-RSL348 (RSL3, bir ferroptoz aktivatörü, 100 nM) grubuna ve bir RSL3 (100 nM) artı ferrostatin-149 (Fer-1, bir ferroptoz inhibitörü, 100 nM) grubuna ayırdık. Yukarıdaki deneysel adımlar sayesinde, taramalı elektron mikroskobu kontrol grubu, RSL3 grubu ve inhibitör grubu (RSL3 + Fer-1 grubu) için sırasıyla 38 ...

Bu protokol, yüksek doğruluk, yüksek çözünürlük ve yüksek verim ile 3D görüntüleme elde etmek için mitokondriyal cristae'nin nasıl yeniden yapılandırılacağını açıklar.

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Bu proje, ilaçların anti-kanser etkisini, hücre altı nano ölçekte yapıyı değiştirerek ve organel morfolojisi ile kanser patolojik mekanizması arasındaki bağlantıyı kurarak gözden geçirmeyi amaçlamaktadır. Bu teknoloji, geleneksel elektron mikroskobu teknolojisini özel ekipman olmadan üç boyutlu rekonstrüksiyon teknolojisi ile birleştirir. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, görüntüleme verimliliğini ve rekonstrüksiyon esnekliğini ve hedef yapıların gerçek hayattaki rekonstrüksiyonunu herhangi bir zamanda artırabilir.Bu yüzden son derece kolay ve evrenseldir. Sürekli ultra ince slaytların üç boyutlu rekonstrüksiyonu teknolojisi, belirli pahalı ekipman olmadan gerçek stereokimyasalı tekrar tekrar geri yükleyebilir. Herhangi bir zamanda tüm organellerin kalitatif ve kantitatif analizi için kullanılabilir.Gözlemin kolay çalışmasını gerçekleştirir.

a-three-dimensional-technique-for-visualization-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Immünohistokimyasal lekeli pankreas örneklerin büyük ölçekli satın alma ve analiz Roman bilgisayar destekli yöntemler açıklanmıştır: (1) Sanal Dilim yakalama bölümün tamamını, büyük ölçekli veri (2) Kütle analiz 2D Sanal Dilimleri (3) İmar (4) 3D adacık haritalama ve (5) matematiksel analizi.

Bilgisayar destekli Büyük ölçekli Görselleştirme ve Pankreas Adacık Kütle, Boyut Dağılımı ve Mimarlık Niceleme

Mitokondriyal füzyon zamanla mitokondriyal ağ üzerinden photoconverted matris hedefli YFP dengelenme izleme ölçüldü. Şimdiye kadar, sadece bir hücre bir anda bir saat uzun kinetik analizine tabi olabilir. Biz aynı anda böylece veri toplama işlemini hızlandıracak, birden çok hücre ölçen bir yöntem sunuyoruz.

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Kaynak: Hamid, H. S.,  et al. İnsan İntraepidermal Sinir Liflerinde Mitokondrinin Üç Boyutlu Görüntülenmesi ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2017) Bu video, üç boyutlu görüntüleme kullanarak sinire özgü mitokondriyi görselleştirme yöntemini göstermektedir. Önceden etiketlenmiş intraepidermal sinir liflerinin sıralı taramalarını elde etme ve sinir yapılarıyla ilişkili olarak mitokondriyi izole etmek ve görüntülemek için 3D yüzey görüntüleri oluşturma sürecini ana hatlarıyla belirtir.

İntraepidermal Sinir Lifleri İçinde Mitokondrinin Görselleştirilmesi

Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

Burada, pankreas kanseri hücreleri ve metabolik fonksiyonların bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak ölçüm tarafından takip fibroblastlar, 3 boyutlu (3D) küresel ortak kültür hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır.

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Bu protokol için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için göstermektedir.

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Pankreasın in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi pankreas intravital görüntüleme penceresi ile kolaylaştırıldı.

Pankreas intravital görüntüleme penceresine sahip bir Murine Modelinde Pankreasın Stabilize Boyuna In Vivo Hücresel Düzey Görselleştirmesi

Bu protokol, yaşlanma sırasında C. elegans'ın çoklu dokularında mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için standart bir yaklaşım sağlar.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Bu çalışmada, adım adım bir protokol açıklıyoruz ve canlı hücrelerde mitokondrinin morfolojik özelliklerini belirlemek için numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere temel ayrıntıları vurguluyoruz. Bu yöntem, çeşitli koşulları incelemek için mitokondriyal morfolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılır.

Canlı Hücrelerde Mitokondriyal Morfolojinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Belirlenmesi

Burada, zaman içinde mitokondriyal fisyon ve füzyon aktivitesindeki 3 boyutlu değişikliklerin nicelleştirilmesinde yararlı olan bir ImageJ eklentisi olan mitokondriyal olay yerelleştiricisini (MEL) açıklıyoruz. Ayrıca, ImageJ'de analizden önce mikrografların temizlenmesi için yararlı olan bir görüntü işleme hattını da açıklıyoruz.

Mitokondriyal Morfolojideki Değişikliklerin Dinamik ve Üç Boyutlu Floresan Mikrografları ile Anlaşılması

Mitokondriyal boya terminali olan Schwann hücre mitokondrilerinin in vivo konfokal mikroskopi için yerel enjeksiyonları. Bu yöntem, sağlıklı veya hasta kaslı farelerin iskelet kas dokularında gösterilen kavram kanıtını kullanarak yüksek çözünürlüklü mitokondriyal görselleştirme sağlar.

Farelerin Kas ve Terminal Schwann Hücrelerinde Mitokondriyal Morfolojinin Yerinde Niceletilmesi Yöntemleri

Keşfedin, elektron mikroskobu ve 3D rekonstrüksiyon teknolojisini birleştirerek pankreas kanseri hücrelerindeki mitokondriyal ultrastrüktürel değişiklikleri yüksek çözünürlükle görüntüleyin. Bu yöntem, organel morfolojisinin nitel ve nicel analizini kolaylaştırır.

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

Daha fazla video keşfet