Name: Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin, tek objektifli ışık tabakalı floresan mikroskobu kullanarak hücre iskeleti ağlarını görselleştirme yöntemini. Bu protokol, yoğun üç boyutlu biyolojik örnekleri minimum fotobeyazlama ile görüntülemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (NSF) RUI Ödülü (DMR-2203791) tarafından J.S.'ye desteklenmiştir. Uyum sürecinde Dr. Bin Yang ve Dr. Manish Kumar tarafından sağlanan rehberlik için minnettarız. Kinesin motorlarının hazırlık talimatları için Dr. Jenny Ross ve K. Alice Lindsay'e teşekkür ederiz.

Hücre İskeleti Ağlarını Görselleştirmek için Özelleştirilebilir Floresan Mikroskobu

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
<li>Research at Dogic Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/">http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/</a> (2023).</li>
<li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li>
<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok. Tüm araştırmalar, çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek ticari veya finansal ilişkilerin yokluğunda yapılmıştır.

Bu protokolle ilgili iki önemli ayrıntı, sistemin toplam maliyeti ve beklenen derleme ve hizalama süresidir. Kesin maliyet değişken olsa da, bu SOLS veya benzer bir DIY sisteminin toplam maliyetinin 85.000 USD aralığında olacağını rahatlıkla tahmin edebiliriz. Bu tahminin tüm bileşenlerin perakende fiyatını dikkate aldığını, bu nedenle bu genel fiyatın kullanılmış bileşenlerin tedarik edilmesiyle büyük ölçüde azaltılabileceğini not ediyoruz. Yapım süresi açısından, optik deneyimi az olan bir kullanıcının, tüm bileşenlerin mevcut ve hazır olması koşuluyla, tüm bu SOLS sistemini 1-2 ay içinde kurmasını ve hizalamasını beklemek mantıklı olacaktır. Protokolün uzunluğuna ve karmaşıklığına rağmen, video protokolüyle eşleştirilen yazılı makaledeki ayrıntı miktarının bu protokolü basit ve takip edilmesi hızlı hale getirmesi gerektiğine inanıyoruz.
Bu protokolde iki kritik adım vardır. İlk olarak, galvo'nun yerleşimi, üç ayrı 4f lens çiftinin parçası olduğu için birçok lensin yerleşimini belirler. Galvo'nun hem O1 hem de O2'nin arka odak düzlemleri ile konjuge olması ve eğim-değişmez taramayı sağlamak için doğru şekilde ortalanması çok önemlidir. İkincisi, görüntü kalitesi O2 ve O3'ün birbirine göre hizalanmasına son derece duyarlıdır. Burada, ilk olarak, O3'ün O2'ye hizalama açısının, uyarma ışık tabakasının eğimiyle eşleştiğinden ve böylece benzer şekilde eğimli FoV boyunca maksimum düz aydınlatma sağladığından emin olmak için özen gösterilmelidir. İkincisi, mümkün olduğunca geniş bir alana sahip düz bir FoV'yi korumak için O3 doğru eksenel mesafeye yerleştirilmelidir. Üçüncüsü, O2-O3 arayüzünden geçen sinyali en üst düzeye çıkarmak için O3, O2'den doğru yanal mesafeye yerleştirilmelidir.

Kullanılabilir FoV açısından, bu sistem 80 μm x 80 μm'lik bir alanda tutarlı aydınlatma ile düz, güvenilir bir alan elde etti. Bu alan, kamera tarafından sağlanan maksimum FoV'den daha küçüktür, bu nedenle kullanılabilir FoV, Şekil 13'teki sarı kutu ile gösterilir. Çözümleme gücü açısından, bu sistem, x ekseni boyunca 432 nm ve y ekseni boyunca 421 nm'lik minimum çözülebilir bir mesafe elde etti, bu da Gauss uyumlarının ortalama sigma x ve y'sinin iyi FoV'de nokta yayılma fonksiyonlarına (PSF'ler) bulunmasıyla ve iki ile çarpılmasıyla ölçüldü. Bu sistemin toplam NA açısından optimize edilmediğini not ediyoruz, yani kullanıcılar bu sistemin elde ettiğinden daha yüksek bir çözümleme gücü istiyorlarsa önemli bir iyileştirme için yer var. Bu tür SOLS yapısı için, birçoğu daha yüksek bir sistem çözünürlüğüne katkıda bulunacak, ancak daha yüksek bir maliyet, daha küçük bir FoV veya röle arayüzünde daha karmaşık hizalama teknikleri gibi dezavantajlara sahip çok sayıda uyumlu objektif seçeneği vardır 8,11,13,20. Ayrı olarak, kullanıcılar daha büyük bir FoV isterlerse, 2D taramaya izin vermek için ikinci bir galvo dahil etmek bu hedefe ulaşacaktır, ancak tasarıma entegre edilecek ek optik ve kontrol mekaniğigerektirecektir 32. Web sitemizdeki sayfada sistemde yapılan değişikliklerle ilgili daha fazla ayrıntı ve tasarım süreciyle ilgili diğer yararlı kaynaklara bağlantılar sağladık23.

Bu özel tasarım için belirli bileşenleri geliştirmenin ötesinde, bu yapıya başka yüksek çözünürlüklü mikroskopi teknikleri veya modaliteleri eklemek çok uygun olacaktır. Böyle bir gelişme, ek uyarma lazerlerinin orijinal uyarma yolu8'e hizalanmasını içeren çok dalga boylu aydınlatmayı dahil etmek olacaktır. Ayrıca, bu tür SOLS tasarımı numuneyi erişilebilir bıraktığından, mikroskoba optik cımbızlama, mikroakışkanlar ve reometri dahil ancak bunlarla sınırlı ek işlevler eklemek nispeten basittir 2,33.

Yayınlanmış sayısız ışıklı sayfa kılavuzuyla karşılaştırıldığında, bu protokol, önemli optik deneyimi olmayan bir kullanıcının yararlı bulabileceği bir anlayış düzeyinde talimatlar sağlar. Geleneksel örnek slayt montaj yeteneklerine sahip kullanıcı dostu bir SOLS yapısını daha geniş bir kitle için erişilebilir hale getirerek, cihazın kullanıldığı veya kullanılabileceği tüm alanlarda SOLS tabanlı araştırma uygulamalarının daha da genişletilmesini sağlamayı umuyoruz. 2,34,35 sayısı hızla artan SOLS enstrümanlarının uygulamalarına rağmen, SOLS tipi enstrümanların birçok faydasının ve kullanımının hala keşfedilmemiş olduğuna inanıyoruz ve bu tür enstrümanların ileriye dönük olasılıklarına heyecan duyuyoruz.

Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM), seçici düzlem aydınlatma mikroskobu (SPIM), süpürülmüş konfokal hizalı düzlemsel uyarma (SCAPE) ve eğik düzlem mikroskobu (OPM) dahil olmak üzere, uyarma ışığının bir tabaka 1,2 şeklinde şekillendirildiği yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme teknikleri ailesini temsil eder3,4,5,6,7. Epi-floresan, toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) veya konfokal mikroskopi gibi diğer mikroskopi modalitelerinin aksine, LSFM'de fototoksisite minimumdur ve numuneler daha uzun zaman ölçeklerinde görüntülenebilir çünkü sadece aktif olarak görüntülenen numunenin düzlemi aydınlatılır 8,9,10. Bu nedenle, LSFM teknikleri, özellikle konfokal mikroskopi teknikleri için çok kalın olanlar olmak üzere, uzun süreler boyunca 3D numuneleri görüntülemek için son derece yararlıdır. Bu nedenlerden dolayı, 2004 yılındaki orijinal gelişiminden bu yana, LSFM, canlı zebra balığı ve Drosophila embriyoları gibi tüm organizmaların görselleştirilmesi için birçok fizyolog, gelişim biyoloğu ve sinirbilimci için tercih edilen görüntüleme tekniği haline gelmiştir 3,4,6,11 . Bu son yirmi yılda, LSFM'nin avantajları, hem in vivo hem de in vitro 13,14,15,17 doku11,12, hücresel ve hücre altı ölçekler dahil olmak üzere giderek daha küçük ölçeklerde yapı ve dinamikleri görselleştirmek için kullanılmıştır.
Literatürde başarılı kullanım durumlarına dair raporlara rağmen, ticari LSFM sistemlerinin yüksek maliyeti (bu yazının yazıldığı tarih itibariyle ~0,25 milyon USD)18,19 tekniğin yaygın kullanımını engellemektedir. Kendin Yap yapılarını araştırmacılar için uygun bir alternatif haline getirmek için, açık erişim çabası OpenSPIM 22 de dahil olmak üzere birden fazla derleme kılavuzu 8,13,20,21 yayınlandı. Bununla birlikte, bugüne kadar, minimum optik deneyime sahip araştırmacılar, yalnızca geleneksel slayta monte edilmiş örneklerle uyumlu olmayan daha önceki LSFM tasarımlarını kullanabilirler (Şekil 1A). Son zamanlardaki tek amaçlı, ışık sayfası (SOLS) uygulaması, hem uyarma hem de algılama için tek bir amaç kullanır (Şekil 1C), böylece uyumluluk 5,6,8,13,20 ile ilgili sınırlamanın üstesinden gelir. Bununla birlikte, SOLS tasarımının çok yönlülüğünün maliyeti, nesne düzlemini görüntüleme için kameraya aktarmak, eğmek ve yeniden görüntülemek için iki ek hedefin gerekliliği nedeniyle yapının karmaşıklığında önemli bir artıştır (Şekil 1D). Karmaşık SOLS tarzı kurulumlara erişimi kolaylaştırmak için bu makale, yalnızca giriş seviyesi bir optik kursu hakkında bilgi sahibi olan araştırmacılar için yararlı olacak slayt uyumlu bir SOLS sisteminin tasarımı, yapımı, hizalama süreci ve kullanımı hakkında adım adım kılavuz sunmaktadır.
Protokolün kendisi kısa ve öz olsa da, okuyucular tasarımın belirli bölümleri veya donanım hususları hakkında daha fazla bilgi edinmek için hazırlık adımları sırasında diğer kaynaklara başvurmalıdır. Bununla birlikte, bir okuyucu bu tasarımın özelliklerini takip etmeyi planlıyorsa, belirli optik bileşenlerin nasıl seçileceğini anlamak gerekli olmayabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> Şekil 1: Farklı LSFM konfigürasyonlarının özellikleri. (A) Erken LSFM tasarımlarında ortak olan iki ortogonal hedefe sahip kurulum. Bu konfigürasyonda, numuneyi içermek için geleneksel slayt montaj teknikleriyle uyumlu olmayan bir kılcal tüp veya bir jel silindiri kullanılır. (B) Aşağıdakileri gösteren bir SOLS ışık tabakası tasarımının şeması: (C) numune düzleminde (O1) hem uyarma hem de emisyon toplama için kullanılan tek hedef; bu, geleneksel bir kızağın üstüne monte edilmesine ve (D) SOLS emisyon yolundaki röle hedef sistemine izin verir. O2 emisyon ışığını toplar ve görüntüyü büyütür. O3, düzlemi kamera sensörüne doğru eğim açısında görüntüler. Kısaltmalar: LSFM = ışık tabakası floresan mikroskobu; SOLS = tek objektifli ışık levhası; O1-O3 = hedefler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>1" Plano-İçbükey Lens f = -50 mm</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>Hizalama lazeri için LC1715<A-ML</td><td>> Tahmini Maliyet: 49,5 $</td></tr><tr><td>1" Akromatik Çift f = 100 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 ve hizalama lazeri Tahmini Maliyet: 342,42 $</td></tr><tr><td>1" Akromatik Çift f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 Tahmini Maliyet: 114,14 $</td></tr><tr><td>1" Akromatik Çift f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 Tahmini Maliyet: 114,14 $</td></tr><tr><td>1" Akromatik Çift f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 Tahmini Maliyet: 114,14 $</td></tr><tr><td>1" Akromatik Çift f = 45 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 Tahmini Maliyet: 114,14 $</td></tr><tr><td>1" Akromatik Çift f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 Tahmini Maliyet: 114,14 $</td></tr><tr><td>1" Silindirik Lens f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3 Tahmini Maliyet: 117.62 $</td></tr><tr><td>1" Silindirik Lens f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 Tahmini Maliyet: $111.22</td></tr><tr><td>1" Silindirik Lens f = 50 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 Tahmini Maliyet: 117,62 $</td></tr><tr><td>1" Montajlı İğne Deliği, 30 & m İğne Deliği Çapı</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>Tahmini Maliyet: 77,08 $</td></tr><tr><td>1" Gümüş Ayna (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, hizalama için bir Tahmini Maliyet: 168,78 $</td></tr><tr><td>2" Eliptik Ayna</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 Tahmini Maliyet: 179,98 $</td></tr><tr><td>2" Direk Tutucu (x11)</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>Özel lazer montajı, ND tekerleği, güvenlik ekranları için Tahmini Maliyet: $ 98.45</td></tr><tr><td>2 "Gönderiler (x47)</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>Özel lazer montajı ve optik bileşenler için Tahmini Maliyet: $ 277.3</td></tr><tr><td>3 "Mesajlar (x4)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>M3</td><td>destekleri ve diğer montajlar için TR3 Tahmini Maliyet: 24,6 $</td></tr><tr><td>3" Direk Tutucu (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PH3</td><td>Tahmini Maliyet: 38,48 $</td></tr><tr><td>30 ila 60 mm Kafes Adaptörü&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>O1 monte etmek için Tahmini Maliyet: 45,42 $</td></tr><tr><td>30mm Kafes Filtre Tekerleği</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>ND filtreleri monte etmek için Tahmini Maliyet: $ 172.36</td></tr><tr><td>30mm Kafes Plakası (x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>Hizalama kafesi ve hizalama lazeri oluşturmak için Tahmini Maliyet: 114,54 $</td></tr><tr><td>30mm Dik Açılı Kinematik Ayna Montajı (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>M1 ve M2'yi monte etmek ve hizalama lazeri için Tahmini Maliyet: 463,95 $</td></tr><tr><td>4" Direk Tutucu (x30)</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>Tahmini Maliyet: 320,1 $</td></tr><tr><td>561 nm Lazer ve Güç Kaynağı&nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>Uyarma lazeri Tahmini Maliyet: 6000 $</td></tr><tr><td>60mm Kafes Plakası (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>TL1 ve M3 montajı montajı için Tahmini Maliyet: 88,52 $</td></tr><tr><td>60mm Dik Açılı Kinematik Ayna Dağı</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>M3 monte etmek için Tahmini Maliyet: 187.26 $</td></tr><tr><td>90&derece; Flip Dağı</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TRF90</td><td>Hizalama lazeri için Tahmini Maliyet: 95,5 $</td></tr><tr><td>Harici C-Mount Dişli ve Dahili SM1 Dişli Adaptör</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>Lens tüpünü kameraya bağlamak için Tahmini Maliyet: 20,96 $</td></tr><tr><td>Harici SM1 Dişli ve Dahili C-Mount Dişli Adaptör</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>Tüp lensi lens yuvasına bağlamak için Tahmini Maliyet: 21,82 $</td></tr><tr><td>Harici SM1 Dişli ve Dahili M25 Dişli Adaptör (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>O1 ve O2 monte etmek için Tahmini Maliyet: $ 47.06</td></tr><tr><td>Harici SM1 Dişli ve Dahili M26 Dişli Adaptör</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>O3 monte etmek için Tahmini Maliyet: $22.38</td></tr><tr><td>Hizalama Diski</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>Tahmini Maliyet: 20.45 $</td></tr><tr><td>Hizalama Lazeri</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Tahmini Maliyet: 16,98 $</td></tr><tr><td>Otomatik Plastik Slayt, Kırmızı&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>Tahmini Maliyet: 20 $</td></tr><tr><td>Işın Deklanşörü&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>Lazer ışığını engellemek için Tahmini Maliyet: 65,8 $</td></tr><tr><td>Kafes Döndürme Montajı (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>CL1-3 monte etmek için Tahmini Maliyet: 282,15 $</td></tr><tr><td>Kafes Sistemi Çubukları 1" (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER1</td><td>M3 ve O1 monte etmek için Tahmini Maliyet: 44,8 $</td></tr><tr><td>Kafes Sistemi Çubukları 3" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER3</td><td>O3 monte etmek için Tahmini Maliyet: 14,28 $</td></tr><tr><td>Kafes Sistemi Çubukları 4" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER4</td><td>Yarık takmak için Tahmini Maliyet: 30,76 $</td></tr><tr><td>Kafes Sistemi Çubukları 8" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td>Tüp lens hizalaması için <td>ER8</td><td> Tahmini Maliyet: 25,3 $</td></tr><tr><td>Kafes Sistemi Çubukları 12" (x8)</td><td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>Hizalama için kafes Tahmini Maliyet: $ 145.36</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>Tahmini Maliyet: ~ 14,000 $</td></tr><tr><td>Sıkıştırma Çatalı (x35)</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>Direk montajlarını sıkıştırmak için Tahmini Maliyet: 338,8 $</td></tr><tr><td>Kapak Camı, 22 x 22 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td>Slayt örnekleri için Tahmini Maliyet: 265 $</td></tr><tr><td>Dikroik&nbsp;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405 / 488/561 / 635-25x36</td><td>Eksiyasyon / emisyon yollarını ayırmak için Tahmini Maliyet: 965 $</td></tr><tr><td>Kırlangıç Kuyruğu Çeviri Aşaması</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>İğne deliği çevirmek için Tahmini Maliyet: $ 90.55</td></tr><tr><td>Emisyon Filtresi</td><td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>Tahmini Maliyet: $ 140.99</td></tr><tr><td>Buzlu Cam Hizalama Diski (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>Hizalama kafesi ve ara düzlem için Tahmini Maliyet: 75,14 $</td></tr><tr><td>Fonksiyon Jeneratörü</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>galvo kontrol etmek için Tahmini Maliyet: 900 $</td></tr><tr><td>Galvanometre - 1D Büyük Işın Çapı Sistemi</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>Tahmini Maliyet: 1715,78 $</td></tr><tr><td>Galvanometre Güç Kaynağı</td><td>Siglent SPD3303C</td><td></td><td>Tahmini Maliyet: 300 $</td></tr><tr><td>Jelrit</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>G35020-100.0</td><td>3D boncuk örneği için Gellan sakızı Tahmini Maliyet: $ 68.25</td></tr><tr><td>FIJI Yazılımı</td><td>Açık Kaynak</td><td></td><td>İndirme https://imagej.net/software/fiji/downloads Tahmini Maliyet: Ücretsiz</td></tr><tr><td>Sıcak Plaka / Karıştırıcı</td><td>Corning</td><td>6795-220</td><td>Örnek çözeltiler hazırlamak için Tahmini Maliyet: 550 $</td></tr><tr><td>K-Cube Fırçalı Motor Kontrol Cihazı</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Sürücüler Z825B Tahmini Maliyet: $ 757.51</td></tr><tr><td>Kinematik Dağı</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>Dikroik monte etmek için Tahmini Maliyet: 92,01 $</td></tr><tr><td>Kinesis Yazılımı</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td>https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 indirme Tahmini Maliyet: Ücretsiz</td></tr><tr><td>Lazer Işık Engelleyici&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td>ND filtre yansımaları için <td>LB1</td><td> Tahmini Maliyet: 57,65 $</td></tr><tr><td>Lazer Dağı</td><td>özel yapım</td><td></td><td>3D baskılı Tahmini Maliyet: N/A</td></tr><tr><td>Lazer Güvenlik Ekranı (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td>Başıboş lazer ışığını engellemek için TPS4 Tahmini Maliyet: 92,02 $</td></tr><tr><td>Lazer Tarama Tüpü Lens</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1 Tahmini Maliyet: 1491 $</td></tr><tr><td>Lens Montajı (x10)&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>Tüm lensi ve ekstra hizalama aynasını monte etmek için. Tahmini Maliyet: 164,7 $</td></tr><tr><td>Manyetik Cetvel</td><td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>Hizalamayı kontrol etmek için Tahmini Maliyet: 52,74 $</td></tr><tr><td>Mikro Yönetici Yazılımı&nbsp;</td><td>Açık Kaynak</td><td></td><td>İndirme https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Tahmini Maliyet: Ücretsiz</td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12550400</td><td>Slayt örnekleri için Tahmini Maliyet: 123,9 $</td></tr><tr><td>Mikroskop Aşaması&nbsp;</td>Özel parçalı <td>ASI</td><td>FTP-2000</td><td>Örneklerin ince çevirisi için Tahmini Maliyet: ~ 16.000 $</td></tr><tr><td>Mini Vorteks Karıştırıcı&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>Numune hazırlama için Tahmini Maliyet: 152,64 $</td></tr><tr><td>Motorlu Aktüatör</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>M1 ince çeviri yapmak için Tahmini Maliyet: 729,07 $</td></tr><tr><td>Monte Edilmiş Standart İris (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>Hizalama için en az 2 Tahmini Maliyet: 118,02 $</td></tr><tr><td>ND Filtre Seti&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>NDK01 ve nbsp;</td><td>Uyarma yoğunluğunu azaltmak için Tahmini Maliyet: 726,73 $</td></tr><tr><td>Objektif Objektif 1</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td><td>O1 Tahmini Maliyet: ~15.000</td></tr>$ <tr><td>Objektif Lens 2</td><td>Nikon</td><td>TU Plan Fluor 100X/0.90&nbsp;</td><td>O2 Tahmini Maliyet: ~6,000 $</td></tr><tr><td>Objektif Lens 3</td><td>Mitutoyo</td><td>Plan Apo HR 50X/0.75</td><td>O3 Tahmini Maliyet: ~ 6.800 $</td></tr><tr><td>OPM Deskewing Yazılımı</td> Görüntü işleme için <td>açık kaynaklı</td><td></td><td>. https://github.com/QI2lab/OPM indirme Tahmini Maliyet: Ücretsiz</td></tr><tr><td>Fotodiyot Güç Sensörü</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>Lazer yoğunluğunu ölçmek için S121C Tahmini Maliyet: 379,68 $</td><td></td></tr> <tr><td>Pozitif Izgara Bozulma Hedefi</td><td>Thorlabs</td><td>R1L3S3P</td><td>Brightfield hizalaması Tahmini Maliyet: 267,87 $</td></tr><tr><td>Güç Ölçer Dijital Konsol</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PM100D</td><td>Lazer yoğunluğunu ölçmek için Tahmini Maliyet: 1245,48 $</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J62315.14</td><td>Floresan kaplı slayt numunesi için Tahmini Maliyet: 27,7 $</td></tr><tr><td>Direkler için Dik Açılı Kelepçe</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>RA90</td><td>M3 desteği ve aşağı açılır ayna için Tahmini Maliyet: 32,46 $</td></tr><tr><td>RMS Dişli Kafes Plakası (x2)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>CP42</td><td>Hizalama lazeri için Tahmini Maliyet: 70,56 $</td></tr><tr><td>Kesme Plakası 2.5-5.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&nbsp;</td><td>Tahmini Maliyet: $ 182.85</td></tr><tr><td>Kesme Plakası 5.0-10.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>Tahmini Maliyet: 201.47 $</td></tr><tr><td>Kesme Plakası 10.0-25.4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>Tahmini Maliyet: 236.42 $</td></tr><tr><td>Kesme Plakası Görüntüleme Ekranı</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS</td><td>Tahmini Maliyet: 337.74 $</td></tr><tr>Kolimasyonu kontrol etmek için<td>1-3 mm Plakalı Thorlabs</td><td></td><td>SI035</td> Kesme İnterferometresi<td> Tahmini Maliyet: 465,85 $</td></tr><tr><td>Geçmeli Direk Yaka (x35)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>R2</td><td>Direk yüksekliğini korumak için Tahmini Maliyet: 208,25 $</td></tr><tr><td>Yarık</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td>Tahmini Maliyet: 294,64 $</td></tr><tr><td>Oluklu Lens Tüpü, 3 "</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1L30C</td><td>Hizalama lazeri için Tahmini Maliyet: 77,45</td></tr><tr><td>$ Kare Ayna, 1 x 1 "</td><td></td><td></td><td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did = 642191768069 & hvpos=& HVNE TW=G& HVRAND=1336734911900437 4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th=1 Tahmini Maliyet: 14,76 $</td></tr><tr><td>İstiflenebilir Lens Tüpü 1/2" (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>CL1-3 monte etmek için Tahmini Maliyet: $ 40.86</td></tr><tr><td>İstiflenebilir Lens Tüpü 1 "</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>O3 monte etmek için Tahmini Maliyet: $ 15.41</td></tr><tr><td>İstiflenebilir Lens Tüpü 2 "(x2)</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>Kamera yolu için Tahmini Maliyet: $35.7</td></tr><tr><td>Çivili Kaide Taban Adaptörü (x37)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE1</td><td>Direk montajlarını masaya takmak için Tahmini Maliyet: 400,71 $</td></tr><tr><td>Lens Yuvasını Çevirme (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>İğne deliği, O2 ve O3 ince çevirmek için Tahmini Maliyet: 441 $</td></tr><tr><td>Standart Mikrometre ile Çeviri Aşaması (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2 Tahmini Maliyet: 647,54 $</td></tr><tr><td>Seyahat Kılavuzu Çeviri Aşaması</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>O3 kafes çeviri montajı Tahmini Maliyet: 497,3 $</td></tr><tr><td>Tüp Lens</td><td>Nikon</td><td>MXA20696</td><td>3 TL Tahmini Maliyet: 359 $</td></tr><tr><td>Beyaz Montajlı LED</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>MNWHL4</td><td>Brightfield ışık kaynağı Tahmini Maliyet: 171,28 $</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>TOPLAM TAHMINI MALIYET: 84.858,98 $</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Yazarlar, birçok parçanın kullanılmış olarak satın alındığını belirtiyorlar. Burada, tüm ürünlerin perakende fiyatını yansıtmaya çalıştık, böylece kullanılan belirli ürünler, özellikle de daha pahalı olanlar satın alınarak toplam maliyet büyük ölçüde azaltılabilir.</td></tr><tr><td>OPSİYONEL BİLEŞENLER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR</td><td>&nbsp; GS3-U3-23S6C-C</td><td>Hizalama sırasında teşhis kontrolleri için. Bunun yerine satın alma kamerası kullanılabilir, ancak daha sonra yeniden hizalama gerektirir. Tahmini Maliyet: 1089 $</td></tr></tbody></table>

hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Sulandırılmış hücre iskeleti kompozitleri, denge dışı yumuşak maddeyi incelemek için değerli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bu 3D, yoğun ağların dinamiklerinin sadık bir şekilde yakalanması, genellikle floresan konfokal mikroskoplarla ilişkilendirilen optik kesit almayı gerektirir. Bununla birlikte, ışık tabakası floresan mikroskobundaki (LSFM) son gelişmeler, onu uygun maliyetli ve zaman zaman üstün bir alternatif olarak ortaya koymuştur. LSFM'yi optiğe daha az aşina olan hücre iskeleti araştırmacıları için erişilebilir kılmak için, kullanıma hazır bileşenlerden çok yönlü bir ışık tabakası floresan mikroskobu oluşturmaya yönelik adım adım bir başlangıç kılavuzu sunuyoruz. Geleneksel slayt numuneleriyle numune montajını mümkün kılmak için bu LSFM, hem uyarma hem de emisyon toplama için tek bir objektif kullanan tek objektifli ışık tabakası (SOLS) tasarımını takip eder. Okuyucuların enstrümantasyonu değiştirmesine ve kendi özel ihtiyaçlarına uyacak şekilde tasarlamasına izin vermek için SOLS'nin her bir bileşeninin işlevini yeterince ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Son olarak, kinesin güdümlü mikrotübül ağlarında asterleri görselleştirerek bu özel SOLS cihazının kullanımını gösteriyoruz.

Gellan sakızına gömülü 1 μm boncukların hacimsel taramalarını gerçekleştirdik. Şekil 14 , x, y ve z yönleri boyunca eğrilik eğri hacimsel taramaların maksimum yoğunluk projeksiyonlarını göstermektedir.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> Şekil 14: Gellan sakızında 1 μm floresan boncukların hacimsel görüntülemesi. Eğrilik eğriliği olan hacimsel taramaların maksimum yoğunluk projeksiyonları gösterilir. Ölçek çubukları = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Mikrotübül aster örneklerinin hacimsel taramalarını gerçekleştirerek yeniden yapılandırılmış hücre iskeleti ağlarını karakterize etmek için tek objektifli, ışık tabakalı mikroskobun kullanımını gösterdik. Kısaca, rodamin etiketli, taksol ile stabilize edilmiş mikrotübüller, GTP ile sulandırılmış dimerlerden polimerize edildi; daha sonra, polimerizasyonu takiben, streptavidin bazlı kinesin motor kümeleri, 6 μM mikrotübüller, 0.5 μM kinesin dimerleri ve 10 mM ATP'nin nihai konsantrasyonları için ATP ile birlikte numunelere karıştırıldı. Taksol ile stabilize edilmiş mikrotübüllerin ve kinesin motor kümelerinin hazırlanması için kapsamlı protokoller ve kılavuzlar Mitchson Lab ve Dogic Lab web sitelerindebulunabilir 25,26. Numuneler nazikçe mikroskop lamlarına pipetlendi, mühürlendi ve motor aktivitenin durmasına izin vermek için görüntülemeden önce 8 saat bekletildi, böylece numuneler asterlere benzeyen sabit bir yapısal duruma ulaştı.
Sulandırılmış hücre iskeleti sistemleri üzerine yapılan çalışmalar, en sık olarak etiketli filamentleri görüntülemek için konfokal veya epifloresan mikroskobu kullanır. Bununla birlikte, bu tekniklerin her ikisi de yoğun 3D örnekleri görüntüleme yetenekleri bakımından sınırlıdır27. İn vitro hücre iskeleti tabanlı aktif madde araştırmalarında, numuneleri yarı2D 28,29 olarak sınırlayarak çok ilerleme kaydedilmiş olsa da, hücre iskeleti ağları doğası gereği 3D'dir ve mevcut birçok çaba, yalnızca 3D örneklerde ortaya çıkabilecek etkileri anlamaktayatmaktadır 29,30, bu nedenle yüksek çözünürlüklü 3D görüntülemeye ihtiyaç yaratır.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> Şekil 15: Sulandırılmış hücre iskeleti örneklerinin tek objektifli ışık tabakası mikroskobu ile 3D görselleştirilmesinin kolaylaştırılması. (A) Leica DMi8 lazer taramalı konfokal mikroskopta elde edilen floresan mikrotübül asterlerinin görüntüleri. Görüntüler, bir z-taramasından farklı düzlemleri gösterir. Ölçek çubuğu = 30 μm. (B) Aynı numunenin tek objektifli ışık sayfası kurulumunda gerçekleştirilen hacimsel bir taramadan elde edilen eğriliği giderilmiş görüntüler. Ölçek çubuğu = 30 μm. Buradaki eğrilik düzeltilmiş görüntü alanı, Şekil 13B'de gösterilen kullanılabilir FoV'ye (sarı kutu) karşılık gelir. Konfokal, lamel yakınındaki tek düzlemleri görüntülemede üstün olsa da, floresan numunenin yoğunluğu, görüntüleme düzleminin altından gelen ek sinyal nedeniyle daha yüksek düzlemlerde görüntüleme sırasında komplikasyonlara neden olur. Işık tabakası, yalnızca görüntüleme düzlemini aydınlatarak bu sorunu ortadan kaldırır, böylece z'de farklı düzlemlerde eşit derecede keskin görüntülemeye izin verir. Kısaltmalar: SOLS = tek amaçlı ışık sayfası; FoV = görüş alanı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Şekil 15'te, kinesin motor kümeleri tarafından aster benzeri yapılara büzülen yeniden yapılandırılmış bir mikrotübül ağının hacimsel görüntülemesini gösteriyoruz. Önceki araştırmalarda gösterildiği gibi28,31, bu 3D yapılar merkeze doğru yoğunlaşma eğilimindedir ve bu da sinyalde baskın olan parlak floresan bölgelerine neden olur. Lamelin yakınındaki görüntüleme düzlemlerinde (düşük z seviyesi), konfokal mikroskopi (Şekil 15A), yukarıdan gelen odak dışı floresan sinyalleri nedeniyle merkeze doğru ek arka plan ile asterin çevresindeki tek filamentleri çözebilir. Bununla birlikte, z'de birkaç mikron hareket etmek, asterin odak dışı yoğun bölümlerinin görüntüleme düzlemindeki sinyalde baskın olması nedeniyle görüntülerin kalitesini hızla düşürür. Işık tabakasının tek düzlemli aydınlatması (Şekil 15B), asterin görüntüleme düzleminin üstündeki ve altındaki yoğun kısımlarından gelen odak dışı sinyalleri ortadan kaldırır, böylece düzlemler arasında karşılaştırılabilir görüntü kalitesine izin verir. Işık tabakasının yüksek kaliteli, güvenilir hacimsel tarama verileri üretme yeteneği, yeniden yapılandırılmış hücre iskeleti sistemlerinde 3D fenomenleri görselleştirme ve karakterize etme olasılığını açar.

Bu protokol, tek objektifli, hafif tabakalı bir floresan mikroskobunun nasıl oluşturulacağını ve hücre iskeleti ağlarını görselleştirmek için kullanımını ayrıntılı olarak açıklar.

Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

Çalışmamız, dengeden uzak malzemelerde trans iş dinamikleri, yerel yapı ve mekanik özellikler arasındaki ilişki hakkındaki bilgileri ilerletmeyi amaçlamaktadır. Hücre iskeleti ağları gibi dengeden uzak malzemeleri görselleştirmek, yoğun, üç boyutlu numuneleri, numunenin hacmi boyunca karşılaştırılabilir görüntü kalitesiyle görüntüleme yeteneği gerektirirken, floresan ışık tabakası mikroskobunun en uygun olduğu teknik olarak zorlu bir görev olan fotoağartma yoluyla minimum hasara neden olur. Floresan ışık tabakası mikroskop sistemleri, bu kalın, üç boyutlu numunelerin minimum foto ağartma ile uzun zaman ölçekleri için görüntülenmesine olanak tanıyan mükemmel optik kesitleme yetenekleri sağlar.Özellikle, sunacağımız tek objektifli ışık tabakası sistemi, geleneksel kızağa monte numunelerle uyumludur ve bu da onu çok yönlü bir araç haline getirir. Tek objektif ışıklı sayfa kılavuzlarının ezici çoğunluğu, kapsamlı optik deneyime sahip kullanıcılar için yazılmıştır. Karmaşık tek objektifli ışık sayfası stili kurulumunu daha erişilebilir hale getirmek için bu ayrıntılı kılavuz, giriş seviyesi optik kursu bilgi derinliğine sahip bir kullanıcının izleyebileceği adımları sağlar.

design-building-customizable-single-objective-light-sheet

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Onlar kendi ana mikroçevresinin geliştikçe birçok biyolojik ve klinik durumlarda hücresel süreçleri incelemek için avantajlıdır. Burada montaj ve hücre kültürü, hayvan çalışmaları ve klinik hasta çalışmaları, gerçek zamanlı görüntüleme sağlayacak bir düşük maliyetli, fiber-optik mikroskop kullanımını tanımlamak.

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

GFP-aktin ifade canlı endotel hücreleri mikroskobik görüntüleme iskelet yapıları dinamik değişimlere karakterizasyonu sağlar. Sabit örneklerinde kullanan teknolojilerden farklı olarak, bu yöntem önce aynı hücrelerde aktin hücre iskeletinin temporal değişikliklerin ayrıntılı bir değerlendirme sırasında, çeşitli fiziksel, farmakolojik veya inflamatuvar uyaranlara sonra sağlar.

GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

Bu protokol, bir ışık mikroskobu tabaka setup ve C in vivo görüntüleme için uygulanmasını açıklamaktadır elegans embriyolar.

Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma<em&gt; Toto yılında</em&gt; Gürüntülenmesi<em&gt; C. elegans</em&gt; Gelişme

Tek düzlem aydınlatma mikroskopi için bir modül (SPIM) kolay bir şekilde ters geniş alan mikroskobu üzere uyarlanmıştır ve 3-boyutlu hücre kültürleri için optimize edildiği açıklanmaktadır. Numune bir dikdörtgen kılcal içinde yer almaktadır ve mikro-akışkan sistem floresan boyalar ile, farmasötik maddeler ya da ilaç küçük miktarlarda uygulanabilir.

Tek Düzlem Aydınlatma Modülü ve geniş alan Mikroskop Mikro-kılcal Yaklaşım

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Ayrıntılı bir talimat nasıl son derece eğimli kurmak için kiremit (HIST) mikroskop ve onun kullanım için tek molekül düşsel süpürüldü açıklanmıştır.

Son derece eğimli oluşturmak için bir kılavuz döşeme mikroskop genişletilmiş görünümü alan tek molekül görüntüleme için süpürüldü.

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, tek objektifli ışık tabakalı floresan mikroskobu kullanarak hücre iskeleti ağlarını görselleştirme yöntemini. Bu protokol, yoğun üç boyutlu biyolojik örnekleri minimum fotobeyazlama ile görüntülemeyi sağlar.

Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası (Video) | JoVE Journal

Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası

Daha fazla video keşfet