Name: İnsan Osteosarkom Hücrelerinde Uzun Kodlamayan RNA Lokalizasyonu için RNA Floresan In Situ Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Öğrenin, insan osteosarkom hücrelerinde uzun kodlamayan RNA lokalizasyonu için RNA FISH yöntemini. SNHG6 lncRNA'sının sitoplazmada başarıyla lokalize edilmesi, kanser biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, (1) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFE0201600); (2) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408); (3) Şangay Hastane TCM Hazırlığının Endüstriyel Dönüşümü İşbirlikçi İnovasyon Merkezi; (4) Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Bütçesi Kapsamındaki Araştırma Projeleri (2021LK047).

Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerin, reaktiflerin ve aletlerin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın. Şekil 1 , RNA FISH için genel protokolü göstermektedir; Tablo 1 , tüm çözeltilerin bileşimini içerir ve Tablo 2 , bu protokolde kullanılan primer dizilerini içerir.
1. Prob hazırlığı
<ol><li>İlgilenilen bir hedef lncRNA'nın FASTA dizisini tanımlayın ve edinin, örneğin GenBank'tan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Web sitesindeki endikasyonları takiben, ISH problarını çevrimiçi olarak tasarlayın19 ve Cy3 etiketi ile sipariş edilecek probları listelemek için tasarım algoritmasının önerilerini inceleyin.</li>
	<li>Hibridizasyon tamponunu 37 °C'de 2 saat önceden inkübe edin.</li>
	<li>4 optik yoğunluk (OD) probunu 160 μL dietilpirokarbonat (DEPC) ile muamele edilmiş ddH2O içinde ışıktan 1 mg / mL konsantrasyonda çözün. NOT: Optik yoğunluk (OD), DNA ve RNA'nın ölçüm birimini temsil eder. Genellikle, 1 OD birimi = 33 μg/mL DNA.</li>
	<li>Her kuyucuk için 200 μL prob karışımı hazırlayın (1.2 μL-10 μL prob, 70 μL hibridizasyon tamponu, DEPC ile muamele edilmiş ddH2O ila 200 μL ile hacmi oluşturun) ve bir dizi 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12.5 μg/mL ve 6 μg/mL. NOT: Prob konsantrasyonunun önceden deneysel olarak araştırılması gerekir. Yüksek bir prob konsantrasyonu, lncRNA'ların spesifik olmayan bağlanmasına yol açarken, düşük bir prob konsantrasyonu, lncRNA'ların duyarsız veya başarısız tespitine yol açacaktır.</li>
	<li>Prob karışımını 73 °C'de 5 dakika denatüre edin. NOT: Cy3 etiketli DNA probu çift sarmallıysa, probu 95 °C'de 5 dakika boyunca tek sarmallı DNA'ya denatüre edin, ardından buz üzerinde 2 dakika hızla soğutun.</li>
</ol>2. Hücre hazırlığı
<ol><li>12 oyuklu bir hücre kültürü plakasında steril cam lameller üzerinde oyuk başına 50.000 143B hücre tohumlayın ve bunları DMEM'de 24 saat (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin. NOT: Burada ekilen spesifik hücre sayısı, tohumlanan hücrelerin 24 saat inkübe edildikten sonra %50'lik bir birleşmeye ulaşması için uygun olan hücre boyutuna göre değişir. Steril cam lameller, 12 oyuklu plaka için uygun olacak şekilde yuvarlaktır.</li>
	<li>Ortamı çıkarın ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 x 5 dakika yıkayın. NOT: DEPC ile muamele edilmiş ddH2O ile 1x PBS hazırlayın. DEPC tedavisi olmayan PBS, RNase içerdiğinden kullanılamaz. Aşağıdaki adımların tümünü RNase içermeyen koşullarda gerçekleştirin.</li>
	<li>1x PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika sabitlemek için her bir oyuğa 200 μL %100 etanol ekleyin.</li>
	<li>Etanolü çıkarın, her bir oyuğa 200 μL% 0.1 Triton X-100 (1x PBS'de) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. NOT: Sürenin Triton X-100 geçirgenliği ile sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekir ve çok uzun olamaz.</li>
	<li>% 0.1 Triton X-100'ü çıkarın ve 1x PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın. NOT: Protokolün burada duraklatılması gerekiyorsa, PBS'yi %70 etanol ile değiştirin (%100 etanolün RNaz içermeyen ddH2O ile seyreltilmesi) ve numuneyi 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.</li>
	<li>1x PBS'yi çıkarın, her bir oyuğa 200 μL 2x sodyum salin sitrat (SSC) tamponu (20x SSC'nin RNaz içermeyen ddH2O ile seyreltilmesi) ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>2x SSC tamponunu çıkarın, her bir oyuğa 200 μL% 70 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>% 70 etanolü atın, her bir oyuğa 200 μL %85 etanol (% 100 etanolün RNaz içermeyen ddH2O ile seyreltilmesi) ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>% 85 etanolü atın, her oyuğa 200 μL% 100 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>% 100 etanolü emdirin ve atın; Kuyuların kurumasını bekleyin.</li>
</ol>3. Floresan in situ hibridizasyon (FISH)
<ol><li>Her bir oyuğa 200 μL prob karışımı (adım 1.5'te olduğu gibi denatüre) ekleyin ve gece boyunca (16-18 saat) 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Hibridizasyon sıcaklığı ile prob konsantrasyonu arasında güçlü bir pozitif korelasyon vardır; Bu nedenle, arka planı optimize etmek için hem hibridizasyon sıcaklığı hem de prob konsantrasyonu azaltılmalıdır.</li>
	<li>Ertesi gün, 37 °C'den numuneler alın ve prob karışımını atın. Her kuyucuğa 200 μL 0.4x SSC/%0.3 Tween-20 tamponu ekleyin (65 °C'de önceden ısıtılmış) ve oda sıcaklığında 2 dakika yıkayın.</li>
	<li>0.4x SSC/%0.3 Tween-20 tamponunu çıkarın, her oyuğa 200 μL 2x SSC/%0.1 Tween-20 tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika yıkayın.</li>
	<li>2x SSC /% 0.1 Tween-20 tamponunu çıkarın, 200 μL 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama solüsyonu (1 μg / mL) ekleyin ve ışıktan 20 dakika uzakta boyayın.</li>
	<li>DAPI boya solüsyonunu atın ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Sürgünün üzerine 50 μL sakız içeren montaj ortamı ekleyin ve sabitlemek için cam lamel sürgünün üzerine yerleştirin. NOT: Lameli hücre tarafı aşağı bakacak şekilde slayta yerleştirdiğinizden emin olun.</li>
	<li>Floresan mikroskobu altında gözlemleyin. NOT: Floresan mikroskobu veya lazer konfokal mikroskop kullanın; İkincisi, daha yüksek bir hassasiyet ve netlikte görüntüleme üretir.</li>
</ol>

İnsan Osteosarkom Hücrelerinde Uzun Kodlamayan RNA Lokalizasyonu için FISH

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li>
<li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation%2C+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li>
<li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research%22%5BJournal%5D)">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li>
<li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li>
<li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a%2FRASSF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li>
<li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K%2FAKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ceRNA+in+cancer%3A+possible+functions+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li>
<li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li>
<li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+%28bDNA%29+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li>
<li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261(2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a%2Fb+and+miR-214+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3(2019).</li>
<li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li>
<li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p%2FULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82(2019).</li>
<li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+Oncology+Research%3A+POR%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li>
<li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853(2018).</li>
<li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+RNA+FISH+%28smFISH%29+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79(2019).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu RNA FISH protokolü, yalnızca hücrelerdeki lncRNA'ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda hücrelerdeki diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir, bu da parafine gömülü dokulardaki lncRNA'ların yerini tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu gibi durumlarda spesifik protokol farklıdır çünkü parafine gömülü dokuların mumdan arındırılması gerekir21. Bu deneysel prosedür 48 veya 96 oyuklu plakalarda uygulanabilir, ancak 384 oyuklu...

İnsan genomu hakkındaki anlayışımız, tüm genom teknolojisindeki son gelişmelerle büyük ölçüde genişledi. İnsan genomunun yaklaşık% 93'ü RNA'lara kopyalanabilir, ancak RNA'ların sadece% 2'si proteinlere çevrilebilir; protein translasyon işlevi olmayan RNA'ların geri kalan %98'ine kodlamayan RNA (ncRNA)1 denir. Kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar) bir sınıfı olarak, 200'den fazla nükleotid2 içeren uzun ncRNA'lar (lncRNA'lar), hücrelerin farklılaşma, döngü kontrolü, apoptoz, göç ve invazyon gibi birçok fizyolojik ve patolojik sürecine dahil olmaları nedeniyle artan bir ilgi görmüştür 3,4,5. LncRNA'lar, kromatin yapısını ve nükleer gen ekspresyonunu düzenlemek, mRNA ekleme sürecini kontrol etmek ve transkripsiyon sonrası modifikasyon6 gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla rollerini oynarlar. LncRNA'lar, hem transkripsiyonel hem de transkripsiyon sonrası seviyelerde malignitelerin oluşumunu, gelişimini ve metastazını düzenler. Transkripsiyonel regülasyon, kromozomal yapılara bağlanarak RNA transkripsiyonunu etkileyerek çekirdekte gerçekleştirilirken, transkripsiyon sonrası regülasyon, endojen rekabetçi bir RNA (ceRNA) mekanizması 5,7,8 aracılığıyla hedef genlerin kontrol edilmesiyle sitoplazmada gerçekleştirilir. CeRNA, yeni bir RNA etkileşimi mekanizması ortaya çıkardı, yani lncRNA'lar, miRNA'ları adsorbe etmek ve ilgili hedef genlerin miRNA aracılı bozunmasını inhibe etmek için bir sünger görevi görebilir9. Bu nedenle, lncRNA'ların hücre altı lokalizasyonu ile ilgili bilgiler, belirli bir lncRNA'nın sitoplazmada mı yoksa çekirdekte mi bulunduğu, biyolojik işlevlerini tanımlamaya yardımcı olmak için önemlidir.
Şu anda, lncRNA lokalizasyonu esas olarak iki yöntemle tespit edilmektedir, biri nükleus/sitoplazma fraksiyon izolasyon deneyi ve diğeri RNA BALIĞI ile. İlkinde, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlardaki RNA'lar sırasıyla ekstrakte edilir ve daha sonra sitoplazma ve çekirdekteki lncRNA'ların oranını tespit etmek için spesifik lncRNA primerleri ile PCR amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajı zaman verimliliği iken, dezavantajı gerçek lncRNA lokalizasyonunun sitoplazma ve çekirdekteki lncRNA'ların nispi oranı tarafından doğrudan yansıtılmamasıdır. RNA FISH, lncRNA'ya özgü antisens zincir dizilerinin tasarımı ve ardından floresan boyalarla etiketleme yoluyla hücrelerdeki lncRNA lokalizasyonunu tespit edebilir10. RNA FISH yöntemleri, florofor etiketli çoklu oligo prob setleri11, LNA probları12 ve dallanmış DNA (bDNA) probları13 dahil olmak üzere prob teknikleri ve tespit yöntemlerindeki gelişmelerle geliştirilmiştir. RNA FISH sadece lncRNA'nın lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda çift renkli veya çok renkli immünofloresan14 kullanarak diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir.
Bu çalışmada, RNA FISH ile osteosarkom hücrelerinde (143B) lncRNA küçük nükleolar RNA konak geni 6'nın (SNHG6) ayrıntılı hücre içi lokalizasyon saptama protokolünü örnek olarak dahil ettik. SNHG6, olgun eklenmiş formunda bir 600-730 nükleotid lncRNA'dır ve kolorektal kanser, mide kanseri, yumurtalık berrak hücreli karsinomu, osteosarkom ve hepatoselüler karsinomdahil olmak üzere çeşitli insan kanserlerinde yeni bir onkogen olarak tanımlanmıştır 15,16,17,18. Çalışmalar, SNHG6'nın proliferasyon, EMT ve otofaji gibi kanser hücrelerinin biyolojik davranışlarına katılımını doğruladı ve SNHG6'nın sitoplazmik lokalizasyonunu, miRNA'ları bağlayarak (süngerleyerek) hedef genleri etkileyebileceğini gösterdi15,16,17. RNA FISH tarafından SNHG6 hücre içi lokalizasyonunun bu ayrıntılı tespit protokolü burada sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>Sayma hücreleri</td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakası-12</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>3513, corning</td><td>Lamelleri tabağa yerleştirin</td></tr><tr><td>&nbsp; Hücre hattı (143B)</td><td>Çin Bilimler Akademisi Hücre Bankası</td><td>CRL-8303</td><td>osteosarkom kanseri hücre hattı</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü (15 mL, 50 mL)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp; 430790, Corning</td><td>Hücreleri Santrifüjleyin</td></tr><tr><td>Lameller Shanghai</td><td>YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>abs7026</td><td>Hücreler lameller üzerine ekilir</td></tr><tr><td>Cy3 etiketi-SNHG6 DNA probu</td><td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td><td>A10005</td><td>SNHG6 konumunu tespit</td></tr> et <tr><td>DMEM ortamı</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>LM-E1141</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Kuru Banyo İnkübatörü</td><td>Haimen Kylin-Bell Laboratuvar Aletleri Co., Ltd.</td><td>DKT200-2&nbsp;</td><td>Farklı yüksek sıcaklıklarda inkübasyon</td></tr><tr><td>Etanol% 100 ve nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td>dehidrasyon</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td><td>Olympus BX43, Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus</td><td>Gözlem ve konumlandırma</td></tr><tr><td>İnkübatörü</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td><td>DHP-9051</td><td>Numuneler 37 ° C'de inkübe edildi.</td></tr><tr><td>Montaj Ortamı</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>E675004</td><td>Lamelleri sürgüye takın</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td><td>TS-8S</td><td>Yıkama numunesi</td></tr><tr><td>Slayt Shanghai</td><td>YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>188105</td><td>Lameller sürgü Triton</td></tr><tr><td>X-100</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td> üzerine yerleştirilir.<td>A600198</td><td>Geçirgen membran ve nükleer membran</td></tr><tr><td>&nbsp; Tripsin (% 0.25)</td> <td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>tripsin hücrelerinin tedavisi</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600560</td><td>deterjan</td></tr></tbody></table>

İnsan osteosarkom hücrelerinde uzun kodlamayan rna lokalizasyonu için rna floresan in situ hibridizasyon

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

Kanser hücrelerinin proliferasyonunu, epitelyal-mezenkimal geçişini (EMT), göçünü, infiltrasyonunu ve otofajisini düzenlemek gibi uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) kanserdeki önemli rolleri incelenmiştir. Hücrelerdeki lncRNA'ların lokalizasyon tespiti, işlevleri hakkında fikir verebilir. lncRNA'ya özgü antisens zincir dizisini tasarlayarak ve ardından floresan boyalarla etiketleyerek, lncRNA'ların hücresel lokalizasyonunu tespit etmek için RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) uygulanabilir. Mikroskopinin geliştirilmesiyle birlikte, RNA FISH teknikleri artık zayıf ifade edilen lncRNA'ların görselleştirilmesine bile izin veriyor. Bu yöntem sadece tek başına lncRNA'ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda çift renkli veya çok renkli immünofloresan kullanarak diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir. Burada, insan osteosarkom hücrelerinde (143B) lncRNA küçük nükleolar RNA konak geni 6 (SNHG6) kullanılarak, RNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara, özellikle lncRNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara referans olması açısından RNA FISH'in detaylı deneysel çalışma prosedürü ve önlemlerine örnek olarak yer verdik.

İnsan osteosarkom hücrelerinde SNHG6 FISH'in temsili görüntüleri gösterilmiştir (Şekil 2). Negatif kontrol, negatif Ctrl probu ile tedavi edilir; pozitif kontrol U6 probu 20 ile tedavi edilir. SNHG6 probu ve U6 probu, kırmızı floresan yayan Cy3 ile etiketlenmiştir. DAPI, mavi floresan yayan DNA'yı boyayan bir boyadır. Bu sonuç, SNHG6'nın esas olarak sitoplazmada lokalize olduğunu göstermektedir ve bu bilgi, SNHG6'nın daha fazla incelenmesi için önemli bir yön sağlayab...

Mevcut protokol, insan osteosarkom hücrelerinde lncRNA'ları lokalize etmek için bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini açıklamaktadır.

İnsan Osteosarkom Hücrelerinde Uzun Kodlamayan RNA Lokalizasyonu için RNA Floresan In Situ Hibridizasyon

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

Araştırmamızın kapsamı, RNA FISH deneyleri yapmak isteyen bilim adamları için bir referans sağlayan ayrıntılı bir RNA FISH protokolü sağlamaktır. Araştırmamız, RNA FISH'in insan osteosarkom hücrelerinde lncRNA'yı lokalize etmek için kullanılabileceğini ortaya koymuştur. Protokolümüz, insan osteosarkom hücrelerinde lncRNA-SNHG6'yı referans olarak kullanan RNA FISH için kapsamlı bir deneysel prosedür ve önlemler sağlamıştır.

rna-fluorescence-situ-hybridization-for-long-non-coding-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

Bu protokol başarıyla kantitatif omurgalı türlerin birden çok doku tipleri düzeyleri ve mRNA mekansal kalıpları tespit etmek için kullanılır. Yöntem, düşük bolluk transkript algılamak ve aynı anda slayt yüzlerce işleme izin edebilirsiniz. Biz örnek olarak kuş embriyonik beyin oluşumu ekspresyon profili kullanarak bu protokolü sunarız.

Radyoaktif In situ</emDoku Çeşitli Gen Patterns Saptayan> Hibridizasyon

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Bu protokol, MeRIP-qPCR kullanılarak belirli RNA'nın m6Amodifikasyon seviyelerini değerlendirmek için ayrıntılı bir yaklaşım sunar.

Osteosarkom Hücrelerinde Spesifik RNA Modifikasyon Seviyeleriiçin MeRIP-qPCRTesti

Bu deneysel protokol, lncRNA'nın koloni oluşturan testlerle birleştirerek lncRNA'nın osteosarkom hücre çoğalması üzerindeki etkisini niceleyen istikrarlı, maliyet etkin ve verimli bir yöntem sunar.

Koloni Oluşumu Testi LncRNA Knockdown Osteosarkom Hücrelerinin Proliferatif Kapasitesini Tespit Ediyor

Kemik sarkomlarda kanser kök hücrelerinin varlığı (rulmanları) son zamanlarda onların patogenezi ile bağlantılı olmuştur. Bu makalede, yapışmayan koşullarda büyümeye CSCS yeteneğini kullanılarak geleneksel osteosarkoma (OS) insan biyopsilerinden elde edilen birincil hücre kültürlerinden CSCS izole sunulmuştur.

Kanser kurulması İnsan Konvansiyonel Osteosarkom Hücre Kültürleri Kök

Öğrenin, insan osteosarkom hücrelerinde uzun kodlamayan RNA lokalizasyonu için RNA FISH yöntemini. SNHG6 lncRNA'sının sitoplazmada başarıyla lokalize edilmesi, kanser biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

İnsan Osteosarkom Hücrelerinde Uzun Kodlamayan RNA Lokalizasyonu için RNA Floresan In Situ Hibridizasyon

Daha fazla video keşfet