Name: Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Sert Mercan Örneklerinin Hedefli Metabolomikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Keşfedin sert mercan holobiontlarından polar ve yarı polar metabolitlerin gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile hedefli metabolomik analizini. Bu yöntem mercan beslenmesi ve çevresel stres dayanıklılığı araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L.M., UTS Şansölyesi Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir.

GC-MS Kullanılarak Sert Mercan Örneklerinin Metabolit Profillemesi

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Konakçı ve simbiyotun ayrılması, basit santrifüjleme yoluyla kolay ve hızlı bir şekilde elde edilebilir ve buradaki sonuçlar, fraksiyonların ayrılmasının, mercan sağlığının fonksiyonel analizine katkıda bulunabilecek spesifik holobiont üye katkılarının göstergesi olan değerli bilgiler sağlayabileceğini göstermektedir. Yetişkin mercanlarda, lipid sentezi esas olarak lipitler (örneğin, triaçilgliserol ve fosfolipitler)41 ve stres iyileşmesini teşvik edebilen yağ asitleri11,42 sağlayan yerle...

Metabolitler, hücresel süreçlerin son ürünlerini temsil eder ve metabolomikler - belirli bir organizma veya ekosistem tarafından üretilen metabolitler paketinin incelenmesi - organizma işleyişinin doğrudan bir ölçüsünü sağlayabilir1. Bu, ekosistemleri, simbiyotik etkileşimleri ve restorasyon araçlarını keşfetmek için özellikle kritiktir, çünkü çoğu yönetim stratejisinin amacı belirli ekosistem hizmet işlevlerini korumak (veya geri yüklemek)2. Mercan resifleri, simbiyotik etkileşimleri aydınlatmak ve mercan fizyolojik tepkilerini topluluk düzeyinde ve ekosistem düzeyinde etkilere bağlamak için metabolomiklerin potansiyel değerini gösteren bir su ekosistemidir3. Yüksek verimli gaz kromatografisi-kütle spektrometrisinin (GC-MS) uygulanması, yüksek seçicilik ve hassasiyetle aynı anda çok çeşitli metabolit sınıflarını hızlı bir şekilde analiz etme, spektral kitaplıklar mevcut olduğunda hızlı bileşik tanımlaması sağlama ve numune başına nispeten düşük bir maliyetle yüksek düzeyde tekrarlanabilirlik ve doğruluk sağlama kapasitesi nedeniyle özellikle değerlidir.
Mercanlar, mercan hayvanı, fotosentetik dinoflagellat endosimbiyontlar (aile: Symbiodiniaceae4) ve karmaşık bir mikrobiyom 5,6'dan oluşan holobiontlardır. Genel olarak, holobiontun uygunluğu, öncelikle her bir üyeninmetabolik işleyişini desteklemek için küçük moleküllerin ve elementlerin değiş tokuşu yoluyla korunur 7,8,9,10. Metabolomik yaklaşımların, simbiyoz özgüllüğününmetabolik temelini aydınlatmak için özellikle güçlü olduğu kanıtlanmıştır 9,11, termal strese ağartma tepkisi 7,8,12,13, hastalık tepkileri 14, kirliliğe maruz kalma tepkileri 15, fotoiklimlendirme 16 ve kimyasal sinyalleşme 17 mercanlarda ve ayrıca biyobelirteç keşfine yardımcı olmak 18,19. Ek olarak, metabolomikler, DNA ve RNA tabanlı tekniklerdençıkarılan sonuçların değerli bir şekilde doğrulanmasını sağlayabilir 9,20. Bu nedenle, resif sağlığını değerlendirmek ve resiflerin korunması için araçlar geliştirmek için metabolomiklerinkullanımı için önemli bir potansiyel vardır 3, örneğin stresin metabolik biyobelirteçlerininsaptanması 18,19 ve beslenme sübvansiyonları gibi aktif yönetim stratejilerinin potansiyelini incelemek için21.
Konakçı ve simbiyont hücreleri ayırmak ve metabolit profillerini holobiont olarak birlikte değil, bağımsız olarak analiz etmek, partner etkileşimleri, bağımsız fizyolojik ve metabolik durumlar ve adaptasyon için potansiyel moleküler mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi verebilir 11,12,22,23,24. Mercan ve Symbiodiniaceae'yi ayırmadan, karmaşık genom rekonstrüksiyonu ve metabolik modelleme25 dışında, mercan ve/veya Symbiodiniaceae'nin katkısını ve metabolizmasını bağımsız olarak aydınlatmak neredeyse imkansızdır, ancak bu henüz mercan-dinoflagellat simbiyozuna uygulanmamıştır. Ayrıca, konakçının veya alg simbiyontunun bireysel metabolizması hakkında holobiontun metabolit profilinden bilgi çıkarmaya çalışmak yanlış yorumlamaya yol açabilir.
Örneğin, yakın zamana kadar, mercan ve holobiont dokularından elde edilen ekstraktlarda C18: 3n-6, C18: 4n-3 ve C16 çoklu doymamış yağ asitlerinin varlığının, mercanların omega-3 (ω3) yağ asitlerinin üretimi için gerekli olan ωx desatürazlara sahip olmadığı varsayıldığından, alg simbiyontundan türetildiği düşünülüyordu; bununla birlikte, son genomik kanıtlar, çoklu cnidarian'ın ω3 PUFA de novo üretme ve daha fazla biyosentez yapma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.3 uzun zincirli PUFA26. GC-MS'nin kararlı izotopik etiketleme (örneğin, 13 C-bikarbonat, NaH 13CO 3) ile birleştirilmesi, hem kontrol koşulları altında hem de dış stres faktörlerine yanıt olarak mercan holobiont metabolik ağları yoluyla fotosentetik olarak sabitlenmiş karbonun kaderini izlemek için kullanılabilir27,28. Bununla birlikte, 13 ° C'nin kaderinin izlenmesinde kritik bir adım, mercan dokusunun alg hücrelerinden ayrılmasıdır - ancak o zaman mercan konakçı fraksiyonunda 13C etiketli bir bileşiğin varlığı, mercana translokasyonlu bir Symbiodiniaceae türevi metabolit veya translokasyonlu etiketli bir bileşiğin aşağı akış ürünü olarak kesin olarak atanabilir. Bu teknik, gliserolün, fotosentezin ortakyaşamdan konakçıya29 yer değiştirdiği birincil form olduğu varsayımına meydan okuyarak ve ayrıca ağartma27,28 sırasında ve uyumsuz Symbiodiniaceae türlerine yanıt olarak eşler arası beslenme akışının nasıl değiştiğini açıklayarak gücünü göstermiştir11.
Dokuları ayırma kararı öncelikle araştırma sorusu tarafından yönlendirilirken, bu yaklaşımın pratikliği, güvenilirliği ve potansiyel metabolik etkilerinin dikkate alınması önemlidir. Burada, holobionttan metabolitlerin yanı sıra ayrı konakçı ve simbiyont fraksiyonlarından ekstraksiyonu için ayrıntılı, kanıtlanmış yöntemler sunuyoruz. Konak ve simbiyotun metabolit profillerini bağımsız olarak karşılaştırıyoruz ve bu profillerin holobiont metabolit profiliyle nasıl karşılaştırıldığını karşılaştırıyoruz.

<table><tbody><tr><td>%100 LC sınıfı metanol</td><td>Merck</td><td>439193</td><td>LC sınıfı esansiyel</td></tr><tr><td>2 mL mikrosantrifüj tüpleri, PP</td><td>Eppendorf</td><td>30121880</td><td>Polipropilen kimyasallara, mekanik strese ve aşırı sıcaklıklara karşı yüksek direnç sağlar</td></tr><tr><td>2030 Shimadzu gaz kromatografı</td><td>Shimadzu</td><td>GC-2030</td><td></td></tr><tr><td>710-1180 ve mikro; m asitle yıkanmış cam boncuklar</td><td>Merck</td><td> G1152</td><td>Bu boyut, Symbiodiniaceae hücrelerini kırmak için idealdir</td></tr><tr><td>AOC-6000 Plus Çok fonksiyonlu otomatik numune alma cihazı</td><td>Shimadzu</td><td>AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reaktifi</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td>Herhangi bir protein kolorimetrik reaktif kabul edilebilir</td></tr><tr><td>Basınçlı hava tabancası</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>Benzer tasarım kabul edilebilir. 1 mL'lik bir uç takmak için bir bağlantı parçasına sahip olmak çok önemlidir.</td></tr><tr><td>&nbsp; 0,25 mm iç çaplı kolonlu DB-5 kolon ve 1 &mikro; m film kalınlığı</td><td>Agilent</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Merck</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol-6-13C ve / veya 13C 5 ndash; 15N Valine</td><td>Merck</td><td>605514/ 600148</td> Dahili <td>standartlardan biri veya her ikisi de metanole eklenebilir.</td></tr><tr><td>Düz tabanlı 96 kuyulu plaka</td><td>Merck</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>Cam sintilasyon şişeleri</td><td>Merck</td><td>V7130</td><td>20 mL, plastik olmayan contalı</td></tr><tr><td>Immunoglogin G</td><td>Merck</td><td>56834</td><td>mevcut değilse, Sığır Serumu Albümini kabul edilebilir</td></tr><tr><td>Primer</td><td></td><td>v4</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>v4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu LabSolutions Insight yazılımı</td><td></td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td>1 M çözelti yapmak için peletler</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td></td><td>v1.3.1</td><td>R paketi</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>Veya benzeri</td></tr><tr><td>TQ8050NX üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi</td><td>Shimadzu</td><td>GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>UV-96 kuyu plakası</td><td>Greiner</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>Whirl-Pak numune çantası</td><td>Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>Numune toplama çantası; Boyut: ~ 5 cm'lik bir mercan parçasını barındıracak kadar büyük, ancak suyun çok yayılmasına neden olacak kadar büyük değil</td></tr></tbody></table>

gaz kromatografisi-kütle spektrometresi tabanlı sert mercan Örneklerinin hedefli metabolomikleri

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

Gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) tabanlı yaklaşımların, cnidarian-dinoflagellat simbiyozunun metabolik temelini ve mercanın strese nasıl tepki verdiğini (yani, sıcaklığa bağlı ağartma sırasında) aydınlatmak için güçlü olduğu kanıtlanmıştır. Cnidarian konakçısını ve onunla ilişkili mikropları (Symbiodiniaceae ve diğer protistler, bakteriler, arkeler, mantarlar ve virüsler) içeren mercan holobiontunun kararlı durum metabolit profili, mercanın bütünsel metabolik durumunu karakterize etmek için ortam ve stres koşulları altında başarıyla uygulanmıştır.
Bununla birlikte, simbiyotik etkileşimleri çevreleyen soruları cevaplamak için, mercan konakçısının ve alg simbiyontlarının metabolit profillerini bağımsız olarak analiz etmek gerekir, bu da yalnızca dokuların fiziksel olarak ayrılması ve izolasyonu ile elde edilebilir, ardından bağımsız ekstraksiyon ve analiz ile elde edilebilir. Metabolomiklerin uygulanması mercan alanı için nispeten yeni olsa da, araştırma gruplarının sürekli çabaları, mercan konakçı dokusunun ve alg simbiyontlarının ayrılması da dahil olmak üzere mercanlardaki metabolitleri analiz etmek için sağlam yöntemlerin geliştirilmesiyle sonuçlanmıştır.
Bu makale, dikkate alınması gereken temel optimizasyon adımları da dahil olmak üzere, GC-MS analizi için holobiont ayrımı ve metabolitlerin ekstraksiyonu için adım adım bir kılavuz sunmaktadır. Bağımsız olarak analiz edildikten sonra, iki fraksiyonun (mercan ve Symbiodiniaceae) birleşik metabolit profilinin bütünün profiline (holobiont) nasıl benzer olduğunu gösteriyoruz, ancak dokuları ayırarak, iki ortağın metabolizması ve etkileşimleri hakkında tek başına bütünden elde edilemeyen önemli bilgiler de elde edebiliriz.

Bu çalışma sırasında üretilen tüm veriler ek bilgilerde mevcuttur.
Konak-simbiyont ayrımı
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> Şekil 1: Mercan konakçı dokularının ve Symbiodiniaceae hücrelerinin ayrılmasının kurulumu ve doğrulanması. (A) Mercan dokusunun mercan iskeletinden çıkarılması için hava t...

Burada, gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi analizi için bir mercan holobiontundan polar ve yarı polar metabolitlerin yanı sıra ayrılmış mercan konakçı dokusu ve Symbiodiniaceae hücre fraksiyonlarının ekstraksiyonunu ve hazırlanmasını sunuyoruz.

Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Sert Mercan Örneklerinin Hedefli Metabolomikleri

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

Her organizmada olduğu gibi, mercanlar da bağışıklık ve üreme için resifler yetiştirmek ve inşa etmek ve değişen çevresel koşullara dayanmak için üstün beslenmeye bağlıdır. Ancak, normal veya değişen koşullar altında mercanlar için en uygun beslenme ve mercan holobiontunun her bir üyesinin bu beslenme durumuna nasıl katkıda bulunduğu hakkında çok az şey biliyoruz. Mercanlar, konakçı ve çeşitli simbiyotik mikroorganizmalardan oluşan holobiontlardır.Bunlara Symbiodiniaceae, protistler, bakteriler, virüsler ve mantarlar dahildir. Holobiont'un uygunluğu, bu üyeler arasındaki metabolik etkileşimlere bağlıdır. Örneğin, Symbiodiniaceae, konakçının metabolizmasını desteklemek ve değişen koşullara uyum sağlamasına yardımcı olmak için fotosentez sağlar.Bu önemli ortaklığı anlamak için, her ortağın kimyasal ve metabolik bileşimini ayrı ayrı incelememiz gerekir. Bu bulgular, metabolik analiz için konakçı ve simbiyont fraksiyonlarının ayrılmasıyla daha fazla bilgi elde edilebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, holobiont'a karşı ayrı kesirleri analiz etme kararı, nihayetinde araştırma sorusu tarafından yönetilir.Bu nedenle, holobiont analizinin tercih edildiği durumlarda, holobiont metabolit ekstraksiyonları için bir metodoloji ve analiz sırasında mümkün olduğunca fazla bilgi elde etmek için öneriler sağladık. Bu çalışmada kullanılan yöntemler araştırma için yeni yollar açmaktadır. Bunlar, potansiyel biyobelirteçleri ortaya çıkarmayı, belirli yaşam evreleri veya stres koşulları sırasında temel metabolitleri tanımlamayı, belirli türlerle ilişkilendirmenin avantajlarını anlamayı ve holobiont içindeki etkileşimleri keşfetmeyi içerir.Gelecekteki araştırmalar, burada oluşturulan protokollerin, mercan resiflerinin korunması ve restorasyonundaki uygulamalarla biyobelirteçlerin tespiti de dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarına uygulanmasına odaklanacaktır. Bu metodoloji, diğer fizyolojik önlemler için fraksiyonların ayrılmasının mümkün olmadığı durumlarda da uygulanabilir. Örneğin, mercan kolonilerinden uçucu metabolit emisyonlarını analiz ederken.

gas-chromatography-mass-spectrometry-based-targeted-metabolomics-hard

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir.  Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Bu protokol, deniz suyundan toplanan mikrobiyal biyokütleden protein ve DNA'nın ekstraksiyonu ve konsantrasyonu ve ardından tandem kütle spektrometresi tabanlı proteomik analiz için uygun triptik peptitlerin üretilmesi içindir.

Bir Aquatic Mikrobiyal Metaproteomics İş Akışı: Tandem Kütle Spektrometre tabanlı analiz için uygun Triptik Peptitler için Hücreleri itibaren

Alglerin hidrotermal sıvılaştırılmasından üretilen biyo-ham petrolün sulu fraksiyonunun karakterizasyonu için iki boyutlu bir gaz kromatografisi-uçuş zamanı kütle spektrometresi yöntemi açıklanmıştır. Bu protokol aynı zamanda hızlı piroliz, katalitik hızlı piroliz, katalitik deoksijenasyon ve hidro-işlemden kaynaklanan sıvı ürünlerin sulu fraksiyonunu analiz etmek için de kullanılabilir.

Zaman-of-flight Kütle Spektrometre ile 2D Gaz Kromatografisi Kullanarak Alg Hidrotermal Sıvılaşma gelen Sulu Kesir Nitel Karakterizasyonu

sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi ile pufferfish türleri genotipleme için geliştirilmiş bir polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon parça uzunluk polimorfizm yöntemi tarif edilmektedir. Ters-faz silis yekpare kolonu sindirilmiş amplıkonları ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, baz bileşimi tanımlamak için yararlıdır oligonükleotidlerin Monoizotopik kitleleri aydınlatmak olabilir.

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

Bu iletişim kuralı, Drosophila larva metabolomic GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak açıklar.

Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı

Bu iletişim kuralı tek bir üretim için doğal organik madde ve mikrobiyal proteomik farklı ekosistemleri içinde tam olarak eşleştirilmiş karakterizasyonu sonuçlanan tamamlayıcı analitik ve omics teknikleri açıklar. Bu yaklaşım sağlam karşılaştırmalar metabolik yollar ve sera gazı üretim tanımlamak ve çevresel değişimin yanıt tahmin için önemli dönüşümleri tanımlamak için izin verir.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Buğday tanemetabolitleri ve lipitlerinin hedeflenmemiş analizi için bir yöntem sunulmuştur. Protokol, pozitif ve negatif elektrosprey iyonizasyon modlarında edinim ile bir asetonnril metabolit çıkarma yöntemi ve ters faz sıvı kromatografi-kütle spektrometresi metodolojisi içerir.

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

El yazması, katı faz mikroekstraksiyonu ile insan beyin tümörlerinin yerinde örneklemesini ve ardından biyobelirteçlerin keşfine yönelik biyokimyasal profillemelerini sunmaktadır.

Metabolomik ve Lipidomik Analizler için Beyin Tümörlerinin Yerinde Örnekleme sivesi ve ekstraksiyonu

Arpanın metabolomik analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yöntem, metabolitlerin fraksiyonlanmasını ve türetilmesini ve bunların gaz kromatografisi/kütle spektrometresi (GC/MS) ile analizini gerektirir. Metabolomik analiz, ara ekim ve kuraklık stresinin tahıl üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılabilir.

Arpanın Gaz Kromatografisi/Kütle Spektrometresi ile Metabolomik Analizi

Keşfedin sert mercan holobiontlarından polar ve yarı polar metabolitlerin gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile hedefli metabolomik analizini. Bu yöntem mercan beslenmesi ve çevresel stres dayanıklılığı araştırmalarına katkı sağlar.

Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Sert Mercan Örneklerinin Hedefli Metabolomikleri

Daha fazla video keşfet