Name: Sipunculus nudustan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Keşfedin, Sipunculus nudus'tan fibrinolitik enzimlerin afinite saflaştırma yöntemini. Arjinin veya lizin kullanan bu basit, ekonomik ve verimli teknik, biyokimyasal araştırmalarda enzim izolasyonunu kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (3502Z20227197) ve Fujian Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 2019J01070, No.2021Y0027) tarafından finanse edilmiştir.

1. Hazırlık
<ol><li>Numune tedavisi<ol><li>Taze S. nudus'u (100 g) dikkatlice diseke edin ve bağırsağı ve iç sıvısını toplayın.</li>
		<li>Homojenizasyon (1.000 rpm, 60 sn) için 300 mL Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 7,4) ekleyin.</li>
		<li>Homojenatı 3x dondurarak çözün.</li>
		<li>Numuneyi santrifüj edin (10.956 × g, 0,5 saat, 4 °C) ve süpernatanı toplayın. Numuneyi daha sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein çökeltmesi<ol><li>Süpernatantı doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırın ve karışımın 4 ° C'de 12 saat beklemesine izin verin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve daha sonra devam edilebilir.</li>
		<li>Protein çökeltisini elde etmek için santrifüj (10.956 × g, 0.5 h, 4 °C); Daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein resüspansiyonu<ol><li>Protein çökeltisini 30 mL Tris-HCl tamponu (0.02 M, pH 7.4) ile yeniden askıya alın. Bu ham protein çözeltisini daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Afinite kromatografisi
<ol><li>Çözelti filtrasyonu<ol><li>Ham protein çözeltisini 0,22 μm'lik bir filtre membranından filtreleyin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kolon paketleme<ol><li>Arjinin-agaroz matris afinite kromatografi kolonu ve lizin-agaroz matris afinite kromatografisi kolonunu, uygun miktarda lizin-agaroz matriks ortamı ve arginin-agaroz matriks ortamını 5 mL boş kromatografi kolonuna yükleyerek paketleyin. NOT: Kolon 2-8 °C'de, matris mağaza tamponuna (%20 etanol) daldırılarak saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Afinite saflaştırma<ol><li>Afinite kromatografisi kolonunu önce ddH2O (1 mL/dak, 10 sütun hacmi), ardından Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/dak, 5 sütun hacmi) ile dengeleyin.</li>
		<li>Protein çözeltisi numunesini önceden dengelenmiş kolona yükleyin (1 mL/dak, 1/3 sütun hacmi). NOT: Numune yükleme hacmi, sFE konsantrasyonuna bağlıdır.</li>
		<li>Kolonu Tris-HCl tamponu ile yıkayın (0,02 M, pH 8,0, beş sütun hacmi).</li>
		<li>Kolonu sırasıyla 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M ve 0,65 M NaCl (1 mL/dak, beş sütun hacmi) ile kaldırın.</li>
		<li>0.15 M NaCl elüsyonunda görünmesi gereken elüsyon tepesini arayın ve ardından fraksiyonları 5 mL tüplerde toplayın.</li>
		<li>Elüsyon numunesini 3 kD ultra santrifüj filtre (3.944 × g, 1,5 saat, 4 °C) kullanarak konsantre edin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Saflık değerlendirmesi
<ol><li>Sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jel preparatı<ol><li>SDS-PAGE jeli, %5 konsantre jel ve %12 ayırma jeli13 kullanarak Laemmli'nin yöntemine göre hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektroforez<ol><li>Numuneyi (15 μL) 5x SDS-PAGE protein yükleme tamponu (1/4 hacim) ile karıştırın, kaynar suda 5 dakika ısıtın, SDS-PAGE jeline yükleyin ve jeli 80 V, 60 mA'da 1,5 saat boyunca çalıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Analiz<ol><li>Elektroforezden sonra, jeli üreticinin protokolüne göre bir Gümüş Leke Kiti ile lekeleyin ve kemilüminesan görüntüleme sistemi kullanarak lekeli jeli gözlemleyin.</li>
		<li>Aşağıdaki formülü kullanarak hedef proteinin saflığını analiz edin: hedef proteinin saflığı = hedef proteinin yoğunluk değeri / toplam proteinin yoğunluk değeri.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Fibrinolitik aktivite değerlendirmesi
<ol><li>Fibrin plaka hazırlama<ol><li>25 mg fibrinojen çözeltisini 1.25 mL fizyolojik salin ile karıştırarak hazırlayın.</li>
		<li>100 U trombini 1.05 mL fizyolojik salin ile tamamen karıştırarak trombin çözeltisini hazırlayın.</li>
		<li>22.5 mL Tris-HCl tamponuna (0.02 mol / L, pH 7.4) 0.5 g agaroz ekleyerek agaroz çözeltisini hazırlayın. Agaroz çözeltisini karıştırın ve tamamen çözünene kadar 100 ° C'de ısıtın.</li>
		<li>Agaroz çözeltisini yaklaşık 50 ° C'ye kadar soğutun ve fibrinojen çözeltisi ekleyin. Ardından, hemen trombin çözeltisini ekleyin, hızlıca karıştırın ve 60 mm'lik bir kültür kabına dökün.</li>
	</ol></li>
	<li>Yükleme<ol><li>Steril bir delici kullanarak hazırlanan fibrin plakalara 3 mm'lik kuyular delin ve kuyucukları 10 μL numunelerle doldurun.</li>
	</ol></li>
	<li>Analiz<ol><li>37 ° C'de 18 saatlik inkübasyondan sonra, bozunma bölgelerinin boyutunu hesaplayarak fibrinolitik aktiviteyi ölçün. Fibrinolitik aktivite = (numunenin bölge büyüklüğü / ürokinazın bölge boyutu) x 100 U. Bölge boyutu = çap x çap. NOT: Fizyolojik salin tamponu, ham protein (protokol adım 1.3.1'de elde edilen örnek) ve ürokinaz sırasıyla boş, negatif kontrol ve pozitif kontrol için kullanılmıştır. Ürokinaz ile karşılaştırıldığında, saflaştırılmış sFE'nin fibrinolitik aktivitesinin ~ 19.200 U / mL olduğunu bulduk.</li>
	</ol></li>
</ol>

Fibrinolitik Bir Enzimin Sipunculus nudus'tan Afinite Kromatografisi ile Saflaştırılması

<ol><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li>
<li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li>
<li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li>
<li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmin-antiplasmin+system%3A+structural+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li>
<li>Ge, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li>
<li>Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starase%3A+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris%3A+purification%2C+identification%2C+antithrombotic+evaluation%2C+and+mechanisms+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
<li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li>
<li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li>
<li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li>
<li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-chromatographic+purification+of+human+%CE%B12-antiplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li>
<li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li>
<li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+plasma%2Fcellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li>
<li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+%28rt-PA%29+from+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li>
<li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

sFE'nin tam gen dizisinin bulunamaması nedeniyle, şu anda kullanılan sFE, taze S. nudus14'ten ekstrakte edildi. Ayrıca, literatürde bildirilen sFE'nin saflaştırma prosedürleri, moleküler ağırlık, izoelektrik nokta, iyonik mukavemet ve polarite15,16 gibi sFE'nin bazı genel özelliklerine dayandığı için karmaşık ve maliyetliydi. Bugüne kadar sFE'nin afinite saflaştırma protokolü bildirilmemiştir. Bu çalışmada, sFE'nin afinite saflaşt...

Tromboz, özellikle Covid-19 küresel pandemisi 1,2 sonrasında halk sağlığı için büyük bir tehdittir. Klinik olarak, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ve ürokinaz (İngiltere) gibi birçok plazminojen aktivatörü (PA), trombolitik ilaçlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. PA'lar, fibrini bozmak için hastaların plazminojenini aktif plazmine aktive edebilir. Bu nedenle, trombolitik verimlilikleri hastaların plazminojen durumu 3,4 ile büyük ölçüde kısıtlanmaktadır. Metalloproteinaz plazmin ve serin plazmin gibi fibrinolitik ajanlar, pıhtıları doğrudan çözebilen ancak çeşitli plazmin inhibitörleri tarafından hızla inaktive edilen plazmin gibi fibrinolitik enzimleri (FE) de içeren başka bir klinik trombolitik ilaç türüdür5. Daha sonra, sadece plazminojeni plazmine aktive etmekle kalmayıp, aynı zamanda eski fıstık solucanı Sipunculus nudus'tan (sFE) 6 fibrinolitik enzim olan fibrinidoğrudan parçalayarak trombüsü çözebilen yeni bir fibrinolitik ajan türü bildirilmiştir. Bu çift fonksiyonlu sFE'ye geleneksel trombolitik ilaçlara göre, özellikle anormal plazminojen durumu açısından başka avantajlar sağlar. Diğer iki fonksiyonlu fibrinolitik ajanlarla karşılaştırıldığında 7,8,9, sFE, özellikle oral ilaçlar için, ilaç geliştirme için gıda dışı türetilmiş ajanlara göre güvenlik de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar göstermektedir. Bunun nedeni, Sipunculus nudus'un biyogüvenliği ve biyouyumluluğunun iyi kurulmuş olmasıdır10.
Mikroorganizmalardan, solucanlardan ve mantarlardan izole edilen diğer doğal fibrinolitik ajanlara benzer şekilde, sFE'nin S. nudus'tan saflaştırılması çok karmaşıktır ve doku homojenizasyonu, amonyum sülfat çökeltmesi, tuzdan arındırma, anyon değişim kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografisi ve moleküler eleme gibi çoklu aşamaları içerir10,11,12. Böyle bir saflaştırma sistemi sadece yetkin becerilere ve pahalı malzemelere bağlı değildir, aynı zamanda tüm prosedürü tamamlamak için birkaç gün gerektirir. Bu nedenle, sFE'nin basit bir saflaştırma programı, sFE'nin daha da geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Neyse ki, iki kristal sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) başarıyla elde edilmiştir (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Yapısal analiz ve moleküler yerleştirme deneyleri sayesinde, sFE'nin katalitik çekirdeğinin özellikle arginin veya lizin kalıntıları içeren hedeflere bağlanabileceğini bulduk.
Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez bir afinite arıtma sistemi önerilmiştir. Bu protokolü izleyerek, son derece saf ve oldukça aktif sFE, tek bir afinite saflaştırma aşamasında ham ekstraktlardan saflaştırılabilir. Burada geliştirilen protokol sadece sFE'nin büyük ölçekli hazırlanması için önemli değildir, aynı zamanda diğer fibrinolitik ajanların saflaştırılması için de uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>%30 Akrilamid-Bisakrilamid (29:1)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose G-10</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arginin-Sefaroz 4B</td><td>Solarbio</td><td>Arginin-agaroz matrisi</td><td></td></tr><tr><td>Bromoxylenol Blue (BPB)</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Silver Stain Kit</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinojen</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinaz</td><td>RHAWN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lizin-Sefaroz 4B</td><td>Solarbio</td><td>Lizin-agaroz matrisi</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boyalı Renkli Protein İşaretleyici (10-170 kD)</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfonat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>SINOPHARM Trombin</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Meilunbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (Hidroksimetil) Aminometan</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (Hidroksimetil) Aminometan Hidroklorür</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>AKT Aprotein Arıtma Sistemi saf</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Dikey Basınçlı Buhar Sterilizatörü MLS-3750</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kemilüminesans Görüntüleme Sistemi</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sabit Akış Pompası BT-100</td><td>QITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sabit Sıcaklık İnkübatörü</td><td>JINGHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Soğutmalı Santrifüj 3-30KS</td><td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DHG Serisi Isıtma ve Kurutma Fırını DGG-9140AD</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli Cam Homojenizatör DY89-II</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronik Analitik Terazi</td><td>DENVER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektro-Termostatik Su Banyosu DK-S12</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yatay Renk Giderme Çalkalayıcı</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz Makinesi AF 103</td><td>Scotsman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KQ-500E Ultrasonik Temizleyici</td><td>ShuMei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırıcı</td><td>Zhi wei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro Soğutmalı Santrifüj H1650-W</td><td>Cence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga Fırın</td><td>Galanz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Referans</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetleyici</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hassas Masaüstü pH Metre</td><td>Sartorious</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük Boyutlu Vorteks Osilatör</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dikey Elektroforez Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Sarf Malzemesi&nbsp; < / Güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 ve mikro; L PCR Tüpü (200 ve mikro; L)</td> <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpü (1.5 mL)</td> <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpü (5 mL)</td> <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpü (50 mL)</td> <td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpü (7 mL)</td> <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kültür Kabı (60 mm)</td> <td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre Membranı (0.22 ve mikro; m)</td><td>Millex GP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet Ucu (1 mL )</td><td>KIRGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet Ucu (10 & mikro; L)</td> <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet Ucu (200 & mikro; L)</td> <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Özel İndikatör Kağıdı</td><td>TZAKZY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Santrifüj Filtre Ünitesi (15 mL 3 KDa)</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Santrifüj Filtre Ünitesi (4 mL 3 KDa)</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Üniversal pH İndikatörü</td><td>SSS Reaktifi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sipunculus nudus'tan bir fibrinolitik enzimin afinite saflaştırılması

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Sipunculus nudus'un (sFE) fibrinolitik enzimi, hem plazminojeni plazmine aktive edebilen hem de fibrini doğrudan parçalayabilen, geleneksel trombolitik ajanlara göre büyük avantajlar gösteren yeni bir fibrinolitik ajandır. Bununla birlikte, yapısal bilgi eksikliği nedeniyle, sFE için tüm saflaştırma programları, çok karmaşık ve maliyetli olan çok adımlı kromatografi saflaştırmalarına dayanmaktadır. Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez sFE'nin bir afinite saflaştırma protokolü geliştirilmiştir; ham numunenin hazırlanmasını ve lizin/arginin-agaroz matrisi afinite kromatografisi kolonunu, afinite saflaştırmasını ve saflaştırılmış sFE'nin karakterizasyonunu içerir. Bu protokolü takiben, bir grup sFE 1 gün içinde saflaştırılabilir. Ayrıca, saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve aktivitesi sırasıyla% 92 ve 19.200 U / mL'ye yükselir. Bu nedenle, bu sFE saflaştırması için basit, ucuz ve verimli bir yaklaşımdır. Bu protokolün geliştirilmesi, sFE ve diğer benzer ajanların daha fazla kullanımı için büyük önem taşımaktadır.

Bu protokolü takiben, ham doku lizatları ekstrakte edildi, arginin-agaroz matriksi ve lizin-agaroz matriks afinite kromatografisi kolonları oluşturuldu, saflaştırılmış sFE elde edildi ve saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve fibrinolitik aktivitesi sırasıyla SDS-PAGE ve fibrin plakaları ile ölçüldü.
Santrifüjlemeden sonra, toplanan süpernatant şeffaf bronz viskoz bir sıvıydı. Yağış, bu süpernatant doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırıldığında başladı. 12 saat bekletildikten s...

Burada, Sipunculus nudus'tan fibrinolitik bir enzimin basit, ucuz ve verimli bir afinite saflaştırma yöntemi sunuyoruz.

Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Araştırmamız esas olarak fibrinolitik enzimin saflaştırılması ile ilgilidir. Bu çalışma, fibrinolitik enzim için basit bir saflaştırma yöntemi oluşturmaya çalışmaktadır. Bu çalışmada, fibrinolitik enzimin arginin veya lizin en iyi afiniteli saflaştırma sistemini ilk kez sunuyoruz.Geleneksel saflaştırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu, fibrinolitik enzimlerin Sipunculus nudus'tan saflaştırılması için basit, ucuz ve etkili bir yaklaşımdır. Bu protokolün geliştirilmesi, Sipunculus nudus ve diğer benzer ajanlardan fibrinolitik enzimlerin daha fazla kullanılması için daha büyük önem taşımaktadır.

affinity-purification-of-a-fibrinolytic-enzyme-from-sipunculus-nudus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Mama magnetosome aktivasyonu dahil olmak gösterildi eşsiz bir Magnetosome ilişkili protein. Burada Mama silme mutant arıtma protokolü (MamAΔ41)...

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Rekombinant prototip köpüklü virüs integrase protein genellikle arıtma sırasında bakteriyel nükleaz ile kirlenmiş. Bu yöntem nükleaz kirlenme belirler ve enzim son hazırlık kaldırır.

Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

Bu protokol, domuz böbreği ve fare karaciğerinden fumarilasetotat hidrolaz alan içeren protein 1'in (FAHD1) nasıl çıkarılacağını açıklar. Listelenen yöntemler ilgilenilen diğer proteinlere uyarlanabilir ve diğer dokular için modifiye edilebilir.

FAHD1 Proteininin Domuz Böbreği ve Fare Karaciğerinden Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Burada, Sipunculus nudus'un fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için bir fibrinojen-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) protokolü sunuyoruz.

Fibrinojen-Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Sipunculus nudus'ta Aktif Fibrinojenolitik Ajanların Hızlı Ayrılması ve Görüntülenmesi

Bu makale, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde toksik bir nükleaz olan rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak etiketli proteinin saflaştırılmasını açıklamaktadır. Bu protokoller diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Çeşitli uygulamalarda uygulama için gelişmiş enzim stabilitesi sağlayan enzim paketli dış zar veziküllerinin (OMV) üretimi, saflaştırılması ve kullanımı için bir protokol sunulmaktadır.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Burada, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin ekspresyonu, izolasyonu ve karakterizasyonu için yeni, sağlam ve verimli bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, ayrık komplekslerin biyokimyasal karakterizasyonunun yanı sıra yeni interaktörlerin ve işlevlerini düzenleyen translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanması için kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

Keşfedin, Sipunculus nudus'tan fibrinolitik enzimlerin afinite saflaştırma yöntemini. Arjinin veya lizin kullanan bu basit, ekonomik ve verimli teknik, biyokimyasal araştırmalarda enzim izolasyonunu kolaylaştırır.

Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet