Name: MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Keşfedin, salidrosidin MCF-7 meme kanseri hücrelerinde proliferasyon ve migrasyonu PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1 yolağı üzerinden inhibe etme mekanizmalarını. Bu yöntem, doğal bileşiklerin terapötik potansiyelini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sichuan Eyaleti Sağlık Komisyonu (120025) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma için kullanılan MCF-7 hücreleri ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.
1. Hücre kültürü
<ol><li>MCF-7 hücrelerini, %10 FBS ve %1 penisilin (10.000 U/mL)/streptomisin (10.000 μg/mL) içeren DMEM ile 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde kültürleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Deneyin için çanağın tabanının %90'ını kaplayan hücreler kullanıldı ve aşağıdaki gruplara ayrıldı: kontrol grubu, doksorubisin hidroklorür grubu (DXR, 5 μM) ve Sal grupları (20 μM, 40 μM ve 80 μM) veya kontrol grubu, LY294002 (10 μM, bir PI3K inhibitörü) grubu, Sal (80 μM) grubu ve LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grubu ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
</ol>2. Hücre canlılığı testi
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 27.
<ol><li>96 oyuklu plakalarda 8 x 104 hücre/kuyu yoğunluğuna sahip MCF-7 hücrelerini tohumlayın ve hücreler yapışana kadar gece boyunca Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM ve 320 μM) ile inkübe edin veya Sal (20, 40, 80 μM) 12 saat / 24 saat / 36 saat / 48 saat boyunca.</li>
	<li>İşlemden sonra, MCF-7 hücrelerini 10 μL / kuyu CCK-8 çözeltisi ile 2 saat boyunca birlikte inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ardından, otomatik bir mikroplaka okuyucu ile optik yoğunluğu 450 nm'de (OD450) ölçün.</li>
</ol>3. Hücre göçü ve istilası
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 35.
<ol><li>Yemeğin tabanının %90'ını kaplayacak şekilde 6 oyuklu plakalara ekilmiş 2 mL 5 x 106 hücre/mL hücreyi inkübe edin.</li>
	<li>Steril bir pipet ucu ile hücre tek tabakasının merkezi boyunca doğrusal bir çizik sarımı gerçekleştirin. 0 saat, 24 saat ve 48 saatte optik mikroskop kullanarak görüntüler elde edin.</li>
	<li>Çizik yaralarının genişliğini ölçmek için Image J yazılımını kullanın.</li>
	<li>Transwell testi için, MCF-7 hücrelerini serum ortamı olmadan askıya alın ve Matrigel ile veya Matrigel olmadan önceden kaplanmış üst transwell odasında tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Transwell odasının dibinde, kimyasal bir indükleyici olarak DMEM tam ortamı kullanın. 24 saat sonra, üst odadaki hücreleri çıkarın ve kalan istilacı ve göçmen hücreleri metanol35'e sabitleyin.</li>
	<li>MCF-7 hücrelerini kristal viyole solüsyonu ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Optik mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın.</li>
</ol>4. Na + - K + -ATPaz ve Ca 2 + - Mg2 + -ATPaz'ın aktivite değerlendirmesi
<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek parçalanmış MCF-7 hücrelerindeki protein konsantrasyonunu ölçmek için bir bikinkoninik asit (BCA) kiti kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).<ol><li>Parçalanmış hücrelerin örneklerini karşılık gelen gruplarında 96 oyuklu plakalara ekleyin. Bundan sonra, 37 ° C'de 5 dakika inkübe etmek için çalışma solüsyonunu ekleyin. Son olarak, OD636 değerlerini çok işlevli bir mikroplaka okuyucu ile ölçün.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Apoptoz ve hücre döngüsünün akış sitometrisi analizi
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 31.
<ol><li>Hücreleri sindirin ve ekin V-FITC ve propidyum iyodür (PI) ile 20 dakikalık bir boyama için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse etmek için hasat edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından bir akış sitometresi kullanarak apoptotik hücrelerin sayısını belirleyin.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş numune çözeltisini 30 dakikalık bir inkübasyon için PI çözeltisi ile karıştırın, ardından bir akış sitometresi ile tespit edin.</li>
</ol>6. DCFH-DA ve Fluo-4 floresan boyama
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 29.
<ol><li>MCF-7 hücrelerini 37 °C'de 10 μM DCFH-DA floresan probu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile 20 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayarak fazla DCFH-DA'yı iyice çıkardıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak sırasıyla 488 nm ve 525 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında floresan yoğunluğunu test edin.</li>
	<li>MCF-7 hücrelerini 5 μM Fluo-4 floresan prob çözeltisi ile 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak sırasıyla 488 nm ve 516 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında floresan yoğunluk değerlerini belirleyin.</li>
</ol>7. Batı lekesi
<ol><li>6 oyuklu plakalara farklı ilaçlar içeren 2 mL 5 x 106 hücre/mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 24 saat boyunca 37 °C,% 5CO2 inkübatörde kültürleyin. NOT: Western blot analizi için gruplar şu şekilde belirlenmiştir: kontrol grubu, LY294002 (10 μM) grubu, Sal (80 μM) grubu ve LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grubu ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Hücreleri ve süpernatanı toplayın ve 560 × g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve önceden soğutulmuş PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra hücreleri 560 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>15 dakikalık bir buz banyosu için 7.2. adımdan hücre örneğine 50 μL lizis tamponu ekleyin. Süpernatan protein örneğini toplamak için 8550 × g'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Bir BCA yöntemi kullanarak protein konsantrasyonunu tespit ettikten sonra, protein örneğini adım 7.3'te 4:1 oranında yükleme tamponu ile karıştırın, metal bir banyoda 100 °C'de 10 dakika denatüre edin ve oda sıcaklığına soğutun.</li>
	<li>Adım 7.4'ten 20 μg protein numunesi ekleyin, %10 SDS-PAGE kullanarak farklı moleküler ağırlıklara35sahip proteinleri ayırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından 0.22 μm PVDF membranlarına aktarın. % 5 BSA ile blokajdan sonra, membranları karşılık gelen primer antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. NOT: Aşağıdaki primer antikorların seyreltik konsantrasyonu 1:1.000'dir: bölünmüş kaspaz-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 ve β-aktin (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Ertesi gün, membranları keçi anti-tavşan IgG sekonder antikoru ile 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Bir ECL kemilüminesan çözeltisi kullanarak membranları geliştirin ve temassız bir kantitatif western blot görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleri yakalayın (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
</ol>8. qRT-PCR
<ol><li>MCF-7 hücrelerini 3 dakika boyunca 4 ° C'de 560 x g'de toplamak için santrifüjleme yapın ve 5 × 106 hücreye 500 μL tampon RL1 ekleyin. Üfleyin ve hiçbir hücre kütlesi görünmeyene kadar bir pipetle tekrar tekrar karıştırın. NOT: Tampon RL1, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Adım 8.1'deki hücre homojenatlarını toplama tüpüne gömülü DNA temizleme kolonuna aktarın ve 2 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. DNA temizleme kolonunu çıkarın ve süpernatanı toplama tüpünde tutun. NOT: DNA temizleme sütunu ve toplama tüpü, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden ikisidir (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Adım 8.2'den itibaren 500 μL süpernatan için 800 μL tampon RL2 ekleyin ve hafifçe karıştırın. NOT: Tampon RL2, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın). Kullanmadan önce 60 mL tampon RL2'ye 120 mL susuz etanol ekleyin.</li>
	<li>Adım 8.3'teki karışımın 700 μL'sini toplama tüpüne gömülü yalnızca RNA kolonuna aktarın ve 1 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın. NOT: Yalnızca RNA sütunu, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Adım 8.3'ten kalan karışımı işlemek için adım 8.4'ü tekrarlayın.</li>
	<li>Yalnızca RNA kolonuna 500 μL tampon RW1 ekleyin ve 1 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın. NOT: Tampon RW1, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Yalnızca RNA kolonuna 700 μL tampon RW2 ekleyin ve 1 dakika boyunca 4 ◦C'de 8.550 × g'de santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın. Adım 8.7'yi bir kez tekrarlayın. NOT: Tampon RW2, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Yalnızca RNA kolonunu toplama tüpüne geri yerleştirin ve kalan tampon RW2'yi çıkarmak için 8550 × g'de 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Yalnızca RNA kolonunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 65 ° C'de önceden ısıtılmış 100 μL RNaz içermeyen ddH2O'yu yalnızca RNA sütunu için zarın merkezine damlatın. 25 °C'de 2 dakika bekletin ve RNA çözeltisini 1 dakika boyunca 4 °C'de 8.550 × g'da santrifüjleyerek toplayın. NOT: RNaz içermeyen ddH2O, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>4 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL oligo (dT)18 primeri, 1 μL rastgele heksamer primeri, 1 μL gene özgü primer (bakınız Tablo 1), 1 μL enzim karışımı ve 5 μg ekleyin RNA çözeltisi adım 8.9'dan 100 μL 8 tüplü bir şeride yerleştirin. Reaksiyon sistemini 20 μL'ye kadar RNaz içermeyen su ile destekleyin.</li>
	<li>Sistemin reaksiyon koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: (1): 95 °C, 30 s, 1 döngü; (2): 95 °C, 5 sn, 50 döngü, 60 °C, 34 sn; (3): 95 °C, 5 sn, 1 döngü, 65 °C, 60 sn, 97 °C, 1 sn; ve (4): 42 °C, 30 sn, 1 döngü. qRT-PCR prosedürünü yürütün. NOT: Hedef genlerin nispi ekspresyon seviyeleri 2−ΔΔCT yöntemi36,37 ile kantitatif olarak analiz edildi. qRT-PCR analizi için kullanılan her bir genin primer bilgisi Tablo 1'de listelenmiştir.</li>
</ol>9. İstatistiksel analiz
<ol><li>Verileri, üç bağımsız deneyin ortalama ± standart sapması olarak ifade edin.</li>
	<li>Grafik ve analiz yazılımı kullanarak birden fazla grup arasındaki karşılaştırmaları analiz edin (Malzeme Tablosuna bakınız) tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından bir Tukey testi ile. Bu çalışmada P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak tanımlanmıştır.</li>
</ol>

Salidrosid'in MCF-7 Hücre Göçünü ve Proliferasyonunu Baskılama Mekanizması

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Meme kanseri her yaştan bireyi etkilemekte ve hesaplanamayan fiziksel ve zihinsel yüke ve büyük ekonomik baskıya neden olmaktadır1. Meme kanseri, her geçen yıl artan morbidite ve mortalitesi ile konvansiyonel tedavilerin ötesinde etkili bitkisel bazlı bileşik tedaviler arayışı açısından da dünya çapında ilgi görmektedir 4,5. Umut verici bir şekilde, çok sayıda kanıt Sal 24,25,38'in<sup class="x...

En sık teşhis edilen kanserlerden ve en yaygın malignitelerden biri olan son istatistikler, 2020 yılına kadar dünya çapında 2,3 milyon meme kanseri vakasının ortaya çıktığını ve tüm kanser vakalarının %11,7'sini oluşturduğunu göstermektedir1. Meme kanserinin yaygın semptomları arasında memede hassasiyet ve karıncalanma, memede yumrular ve ağrı, meme başı akıntısı, erozyon veya çökük cilt ve genişlemiş koltuk altı lenf düğümleribulunur 1,2. Daha da endişe verici olanı, yeni vakaların sayısı ve genel meme kanseri insidansı her yıl ezici bir oranda artmaya devam ediyor ve kansere bağlı ölümlerin %6,9'unu oluşturuyor1. Şu anda, meme kanseri müdahalesi hala esas olarak kemoterapi, cerrahi, radyoterapi ve kapsamlı tedaviyi içermektedir. Tedavi, hastaların nüks oranını ve mortalite oranını etkili bir şekilde azaltabilse de, uzun süreli tedavi uygulaması sıklıkla çoklu ilaç direncine, geniş alan saç dökülmesine, bulantı ve kusmaya ve ciddi zihinsel ve psikolojik yüke neden olur 2,3. Özellikle, meme kanserinden kaynaklanan çoklu organ metastazı riski, insanları yeni bitkisel ilaç tedavisi kaynakları aramaya zorlamaktadır 4,5.
Fosfoinositid 3 kinaz (PI3K) aracılı sinyalleme, çoklu genlerin ekspresyonunu etkileyen ekleme yoluyla meme kanserinin büyümesi, çoğalması ve hayatta kalmasındarol oynar 6. PI3K'nın aşağı akış sinyal algılayıcı bir proteini olarak, çok sayıda kanıt, protein kinaz B'nin (AKT) meme kanserini daha da artırmak için memeli rapamisin (mTOR) proteini hedefi ile birleşebileceğini düşündürmektedir 7,8,9. Ayrıca, PI3K/AKT/mTOR sinyalinin devre dışı bırakılmasının, meme kanserinde malign proliferasyonu inhibe eden ve apoptozu uyaran ilaçlarda da önemli bir bileşen olduğu iddia edilmiştir10,11,12. Tümör mikroçevresindeki aşırı hipoksin, hipoksi ile indüklenebilir faktör 1 alfa'da (HIF-1α) büyük bir artışa neden olduğu ve bu da meme kanserinin ilerlemesini daha da kötüleştirdiğiiyi bilinmektedir 13,14,15. Buna paralel olarak, AKT stimülasyonu da aşırı HIF-1α birikimine yol açarak meme kanseri örneklerinde apoptozu sınırlar16,17. İlginç bir şekilde, PI3K-AKT-HIF-1α sinyalinin aktivasyonunun, akciğer kanseri18, kolorektal kanser19, yumurtalık kanseri 20 ve prostat kanseri21 dahil olmak üzere çeşitli kanserlerde patolojik ilerleme ve metastazda rol oynadığı doğrulanmıştır. HIF-1α tarafından düzenlenmesine ek olarak, çatallı kafa transkripsiyon faktörü 1 (FoxO1) aşırı ekspresyonu, meme kanseri hücrelerinde döngü durmasını ve apoptozun inhibisyonunu destekleyen AKT sinyal stimülasyonu tarafından da tetiklenir22,23. Birlikte, yukarıdaki sağlam kanıtlar, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sinyalinin kaskadının inhibisyonunun meme kanserinde ilaç tedavisi için potansiyel yeni bir hedef olabileceğini düşündürmektedir.
Salidrosidin (Sal) anti-kanser24,25, anti-hipoksi 26,27,28,29 ve bağışıklık arttırıcı farmakolojik aktiviteler30 uyguladığı yaygın olarak gösterilmiştir. Suda kolayca çözünebilen, bir tür feniletilanoid glikozit olan ve kimyasal yapı formülüC14H20O7ve moleküler ağırlığı 300.331,32 olan açık kahverengi veya kahverengi bir tozdur. Modern farmakolojik araştırmalar, Sal'ın PI3K-AKT-mTOR sinyalini24 kısıtlayarak mide kanseri hücrelerinin apoptozunu destekleyebileceğini göstermiştir. Daha fazla kanıt ayrıca, PI3K-AKT-HIF-1α sinyalinin Sal tedavisi ile baskılanmasının, kemoterapötik ajanlara duyarlılıklarını artırarak kanser hücrelerinin apoptozuna katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir25. Kanıtlar ayrıca Sal'ın hücre göçünü ve istilasını kısıtladığını ve insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinde apoptozu teşvik ederek döngü durmasına neden olduğunu göstermektedir33,34. Bununla birlikte, Sal'ın PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sinyalini düzenleyip düzenleyemeyeceği ve MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu inhibe edip edemeyeceği henüz belli değil. Bu nedenle, bu protokol, Sal'ın PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolu yoluyla MCF-7 hücre göçü, invazyonu, hücre döngüsü ve apoptoz üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladı. Hücre göçü ve invazyon değerlendirmeleri, akış sitometrisi ile apoptoz ve hücre döngüsü tespiti, reaktif oksijen türleri (ROS) ve Ca2 + floresan tayini gibi geleneksel, düşük maliyetli ve bağımsız deneyleri içeren entegre araştırma stratejileri, geleneksel bitkisel ilaçlarla anti-kanser araştırmaları için deneylerin genel tasarımı için bir referans sağlayabilir. Bu çalışmanın deneysel süreci Şekil 1'de gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>% 1 penisilin / streptomisin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>AKT antikoru</td><td>ImmunoWay Biyoteknoloji Şirketi</td><td>YT0185</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC / PI kiti</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>AP101</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik mikroplaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>Bax antikor</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi, Inc.</td><td># 5023</td><td></td></tr><tr><td>BCA kiti</td><td>Biosharp Yaşam Bilimleri</td><td>BL521A</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-2 antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi, Inc.</td><td>#15071</td><td></td></tr><tr><td>Bim antikor</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi, Inc.</td><td>#2933</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+– ATPase tahlil kiti</td><td>Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü</td><td>A070-4-2</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sayma kiti-8</td><td>Biosharp Yaşam Bilimleri</td><td>BS350B</td><td></td></tr><tr><td>Hücre döngüsü boyama kiti</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>CCS012</td><td></td></tr><tr><td>bölünmüş kaspaz-3</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, Inc.</td><td># 9661</td><td></td></tr><tr><td>bölünmüş kaspaz-7</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, Inc.</td><td>#8438</td><td></td></tr><tr><td>bölünmüş kaspaz-9</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, Inc.</td><td># 20750</td><td></td></tr><tr><td>Kristal viyole çözeltisi</td><td>Beyotime Biyoteknoloji</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikoz kültürü ortamı</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G4510</td><td></td></tr><tr><td>Doksorubisin hidroklorür</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-15142</td><td></td></tr><tr><td>ECL kemilüminesan çözeltisi</td><td>Biosharp Yaşam Bilimleri</td><td>BL520B</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Procell Yaşam Bilimleri &amp; Teknoloji Co., Ltd.</td><td>164210</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD</td><td>FACSCanto <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Beyotime Biyoteknoloji</td><td>S1060</td><td></td></tr><tr><td>FoxO1 antikoru</td><td>ImmunoWay Biyoteknoloji Şirketi</td><td>YT1758</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG ikincil antikoru</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>70-GAR0072</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prizma yazılımı</td><td>La Jolla</td><td>Sürüm 6.0</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 ve alfa antikoru</td><td>Affinity Biosciences</td><td>BF8002</td><td></td></tr><tr><td>İnsan meme kanseri hücre hattı MCF-7</td><td>Procell Yaşam Bilimleri &amp; Teknoloji Co., Ltd.</td><td>CL-0149</td><td></td></tr><tr><td>Yükleme tamponu</td><td>Biosharp Yaşam Bilimleri</td><td>BL502B</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10108</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Thermo </td><td></td><td></td>356234</tr><tr><td>mTOR antikoru</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GB11405</tr><tr><td>Na+– K+– ATPase test kiti</td><td>Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü</td><td>A070-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Optik mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71PH</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT antikoru</td><td>ImmunoWay Biyoteknoloji Şirketi</td><td>YP0006</td><td></td></tr><tr><td>PI3K antikoru</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GB11525</tr><tr><td>p-PI3K antikoru</td><td>Affinity Biosciences</td><td>AF3241</td><td></td></tr><tr><td>Kantitatif western blot görüntüleme sistemi</td><td>Touch Image Pro</td><td>eBlot</td><td></td></tr><tr><td>Ters transkripsiyon birinci iplikli cDNA sentez kiti</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G3330-100</td><td></td></tr><tr><td>ROS tahlil kiti</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S0033S</td><td>DCFH-DA floresan probu burada yer almaktadır</td></tr><tr><td>Salidroside</td><td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td><td>H-040</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kiti</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G2003-50T</td><td></td></tr><tr><td>Toplam RNA izolasyon kiti</td><td>Foregene</td><td>RE-03014</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -aktin</td><td>Afinite Biosciences</td><td>AF7018</td><td></td></tr></tbody></table>

mcf-7 hücre proliferasyonunu ve migrasyonunu İnhibe etmede salidrosidin farmakolojik etkisinin ve moleküler mekanizmasının araştırılması

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidrosid (Sal), anti-kanserojen, anti-hipoksik ve anti-inflamatuar farmakolojik aktiviteler içerir. Bununla birlikte, altta yatan anti-meme kanseri mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, bu protokol, insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunda PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu düzenlemede Sal'ın potansiyelini çözmeyi amaçladı. İlk olarak, Sal'ın MCF-7'ye karşı farmakolojik aktivitesi CCK-8 ve hücre çizik testleri ile değerlendirildi. Ayrıca, MCF-7 hücrelerinin direnci migrasyon ve Matrigel invazyon testleri ile ölçüldü. Hücre apoptozu ve siklus tahlilleri için, MCF-7 hücreleri, akış sitometrisi analizleri için sırasıyla annexin V-FITC/PI ve hücre döngüsü boyama tespit kitleri ile adım adım işlendi. Reaktif oksijen türleri (ROS) ve Ca2+ düzeyleri DCFH-DA ve Fluo-4 immünofloresan boyama ile incelendi. Na+-K+-ATPaz veCa2+-ATPaz aktiviteleri, ilgili ticari kitler kullanılarak belirlendi. Apoptozdaki protein ve gen ekspresyon seviyeleri ve PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolağı sırasıyla western blot ve qRT-PCR analizleri kullanılarak belirlendi. Sal tedavisinin, doza bağlı etkilerle MCF-7 hücrelerinin çoğalmasını, göçünü ve invazyonunu önemli ölçüde kısıtladığını bulduk. Bu arada, Sal uygulaması ayrıca MCF-7 hücrelerini apoptoz ve hücre döngüsü durmasına maruz kalmaya zorladı. İmmünofloresan testleri, Sal'ın MCF-7 hücrelerinde ROS ve Ca2+ üretimini gözle görülür şekilde uyardığını gösterdi. Diğer veriler, Sal'ın pro-apoptotik proteinlerin, Bax, Bim, bölünmüş kaspaz-9/7/3 ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyon seviyelerini desteklediğini doğruladı. Tutarlı bir şekilde, Sal müdahalesi Bcl-2, p-PI3K / PI3K, p-AKT / AKT, mTOR, HIF-1α ve FoxO1 proteinlerinin ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyonunu belirgin şekilde azalttı. Sonuç olarak, Sal, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu inhibe ederek MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu, göçünü ve istilasını azaltabileceğinden, meme kanserini tedavi etmek için potansiyel bir bitki türevi bileşik olarak kullanılabilir.

Sal'ın MCF-7 hücrelerinde aşırı proliferasyonu inhibe etme ve yara iyileşmesini geciktirme üzerindeki etkileri Sal'ın meme kanserine karşı potansiyelini araştırmak için, ilk önce insan meme kanseri MCF-7 hücre hattının hücre proliferasyon toksisitesi ve çizik testlerini kullanarak antikanser özelliklerini test ettik. Bu hücreler, 24 saat boyunca bir Sal konsantrasyon serisi (5-320 μM) ile birlikte inkübe edildi ve hücre proliferasyonu bir CCK-8 testi kullanılarak değerlendirildi. 40 μM'de hücre canlıl...

Mevcut protokol, MCF-7 hücre proliferasyonunu ve göçünü inhibe etmede salidrosidin farmakolojik etkisini ve mekanizmasını değerlendirmek için kapsamlı bir stratejiyi tanımlamaktadır.

MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Doğal ürünlerden elde edilen aktif bileşikleri ve bunların meme kanseri tedavisindeki potansiyellerini keşfetmeye odaklanıyoruz. Bu nedenle spesifik olarak meme kanserinin kombinesinde salidrosidin farmakolojik etkilerini ve moleküler mekanizmalarını aydınlatmayı amaçlıyoruz. Şu anda, meme kanseri tedavisinde salidrositin moleküler hedeflerini doğrulamak için güvenilir deneysel teknikler eksiktir.Alandaki önemli bir bulgu, PI3K / AKT / HIF-1 alfa / FoxO1 sinyalinin düzenlenmesi yoluyla MCF7 hücrelerinin proliferasyonunu ve göçünü arttırmada salidrositin potansiyel bir moleküler mekanizmasıdır. Laboratuvarın gelecekteki araştırmaları doğrudan meme kanseri başlangıcının, gelişiminin, prognozunun ve sonucunun altında yatan patofizyolojik mekanizmaları araştırmaktır. Ek olarak, meme kanserinin önlenmesi ve tedavisine katkıda bulunabilecek doğal kaynaklardan elde edilen aktif küçük moleküler ilaçları tarıyoruz.

exploring-pharmacological-action-molecular-mechanism-salidroside

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Insan retinoblastom farelerde tümörlerin yaymak için bir yöntem açıklanmıştır. Tümör hücreleri bağışıklık eksikliği olan farelerde gözlerinin içine doğrudan enjekte edilir. İkincil tümörlerin başarıyla doğrudan insan tümörleri ve kültürlü tumorspheres hasat hücreler kullanılarak kurulmuştur.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Bir yapılandırılmış protokol hücresel dielektrik spektroskopi (CDS) kullanarak idiopatik skolyoz prognozu tahmin etmek için bir fonksiyonel test olarak bir hücre bazlı deney için sunulmuştur. Deney, taze ya da dondurulmuş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ile yapılabilir ve prosedür 4 gün içinde tamamlanır.

Hücresel Dielektrik Spektroskopisi kullanarak İdiopatik Skolyoz Prognostik Tahmininde Hücre-tabanlı Deney Protokolü

Korneanın neovaskülarizasyon (NV) çoklu görsel patolojileri karmaşık hale getirebilir. Kontrollü, alkali-yanık yaralanması modeli kullanılarak, korneal NV bir ölçülebilir düzeyde neovasküler hastalıkları için potansiyel tedavilerinin kornea NV ve değerlendirme mekanik çalışma için üretilebilir.

Fare Kornea Neovaskülarizasyonunun bir Alkali-yanık Yaralanma Modeli

Östrojene duyarlı meme kanseri hücreleri için kemik iliğinde in vitro bir uyku hali modeli geliştirdik. Bu protokolün amacı, uyku halinin moleküler ve hücresel biyolojisinin incelenmesi ve daha sonraki in vivo testler için hipotezlerin üretilmesi için modelin kullanımını göstermektir.

Bir<em&gt; In Vitro</em&gt; Kemik İliği östrojen duyarlı Meme Kanseri Dormansi Model: Moleküler Mekanizması Çalışmaları ve Hipotez Üretimi için A Takım

3D sferoidlerin iç G1 tutuklanan ve dış proliferatif bölgelerindeki hücreleri tanımlamak ve izole etmek için floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) ve görüntü analizi veya akış sitometrisi kullanarak iki tamamlayıcı yöntemi açıklıyoruz.

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Kanser hücreleri tarafından doğal katil (NK) hücre aracılı eradikasyon kaçırma kanser inisiyasyonu ve ilerlemesi için önemlidir. Burada, hepatik tümör hücrelerine doğru NK hücre aracılı sitotoksisitesini değerlendirmek için radyoaktivite ye dayalı olmayan iki protokol siyoruz. Ayrıca, NK hücre geçişini çözümlemek için üçüncü bir protokol sunulur.

Hepatik Tümör Hücreleri Bağlamında Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite ve GöçÖlçümü

Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

Keşfedin, salidrosidin MCF-7 meme kanseri hücrelerinde proliferasyon ve migrasyonu PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1 yolağı üzerinden inhibe etme mekanizmalarını. Bu yöntem, doğal bileşiklerin terapötik potansiyelini anlamaya yardımcı olur.

MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması (Video) | JoVE Journal

MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması

Daha fazla video keşfet