Name: Kriyoelektron mikroskobu için tek katmanlı grafen kaplı ızgaraların imalatı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Öğrenin, kriyoelektron mikroskobu için tek katmanlı grafen kaplı ızgaraların üretimini. Bu yöntem, arka plan gürültüsünü azaltarak biyolojik örneklerin korunmasını ve yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Scripps Research'te bu yöntemleri oluştururken faydalı tartışmalar için Dr. Xiao Fan'a teşekkür ederiz. B.B., Hewitt Tıbbi Araştırma Vakfı'ndan doktora sonrası araştırma bursu ile desteklenmiştir. WC, Ulusal Bilim Vakfı doktora öncesi bursu tarafından desteklenmektedir. D.E.P, G.C.L.'ye NS095892 Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) HIBESI TARAFINDAN DESTEKLENMEKTEDIR. Bu proje aynı zamanda NIH hibeleri GM142196, GM143805 ve GCL'ye S10OD032467 tarafından da desteklenmiştir.

1. Grafen ızgaraların imalatı için gerekli malzeme ve aksesuarların hazırlanması
NOT: Grafen kolayca kirlenir, bu da grafen kaplamanın verimliliğini ve grafen ızgaralarının kalitesini düşürür; Bu nedenle, grafen ile temas eden tüm malzemelerin iyice temizlenmesi önemlidir. Malzemelerin hazırlanması ve tüm adımlar çeker ocakta yapılmalıdır.
<ol><li>Izgaraları grafen ile kaplamak için kullanılacak gerekli malzemeleri toplayın (Şekil 2A).</li>
	<li>Toz, tüy ve yağlı kalıntıları temizlemek için cam eşyayı deiyonize (DI) suyla birkaç kez durulayın.</li>
	<li>Cam lamelleri %75 etanol ile temizlemek için tek kullanımlık mendiller kullanın ve kirleticileri temizlemek için hava silgi kullanın. NOT: Bu protokolde kullanılan kenetleme TEM ızgara tutucu bloğu 45'e kadar ızgara tutabilir. Grafen ızgaralarının büyük bir seri üretimi için, bir kerede 45 veya daha az ızgara hazırlanabilir. Bununla birlikte, yöntem laboratuvarda oluşturulana kadar küçük bir seri üretimle (dört ila altı ızgara) başlanması önerilir.</li>
</ol>2. Suda 0.2 M amonyum persülfat (APS) hazırlanması
NOT: Bu APS çözümü, daha sonraki bir adımda grafen/Cu tabakasından bakır (Cu) desteğini çıkarmak için bir dağlayıcı olarak kullanılır. Her zaman taze APS çözeltisi hazırlayın. Yeniden kullanılmış veya eski çözeltiler bakırı etkili bir şekilde aşındırmaz ve sonraki adımlarda grafen üzerinde bakır kalıntısı bırakabilir.
<ol><li>500 mL'lik bir şişeyi deiyonize su (DI) suyla durulayın, ardından suyun gazını gidermek için yaklaşık 1 dakika boyunca maksimum ayarları kullanarak 200 mL DI su ve mikrodalga ekleyin.</li>
	<li>0.2 M APS'lik bir çözelti üretmek için 200 mL DI suya 9 g amonyum persülfat ekleyin. DİKKAT: APS zehirlidir, APS ile çalışırken kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmesi tavsiye edilir. APS atıklarını onaylı bir atık bertaraf tesisinde atın.</li>
	<li>Şişeyi çeker ocak altındaki bir vakum kaynağına bağlarken çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı üzerinde bir karıştırma çubuğu ile karıştırın. NOT: APS solüsyonunun gazdan arındırılması, 6. adımda Cu aşındırma verimliliğini azaltabilecek kabarcık oluşumunu önlemeye yardımcı olacaktır.</li>
</ol>3. Grafen / bakırı bir parça kurutma kağıdı ile temiz bir lamel içine aktarın
NOT: Bir grafen tedarikçisinden Cu üzerinde 15 x 15 cm kimyasal buhar biriktirme (CVD) grafen filmi kullanıyoruz. Ticari olarak satın alınan tek katmanlı grafen / Cu levhalar vakum altında saklanmalıdır. Grafen, CVD yöntemi ile Cu'nun her iki tarafında da yetiştirildiğinden, grafen tedarikçileri genellikle kalite kontrolleri yapar ve kullanım için daha iyi tarafı önerir. Grafenin bu önerilen tarafını "üst" taraf, diğer tarafı ise bu protokolde "arka" taraf olarak adlandırıyoruz.
<ol><li>Bir parça kurutma kağıdını yaklaşık 20 mm x 40 mm dikdörtgen şeklinde kesin. Bu kurutma kağıdı, grafen / Cu tabakası için dolgu olarak kullanılır ve grafen / Cu tabakasını kaplamak için kullanılan fazla metil metakrilatı (MMA (8.5) MMA EL6) emer; bu nedenle, kullanılacak grafen/Cu tabakasından daha büyük bir boyutta kestiğinizden emin olun.</li>
	<li>Kurutma kağıdının dört köşesini, ev yapımı bir sıkma kaplayıcıya sığacak temiz bir lamel üstüne bantlamak için poliimid bant kullanın. NOT: Poliimid bant, ince olduğu ve kolayca çıkarılabildiği için kullanılır, bu da kullanımı kolaylaştırır.</li>
	<li>Grafen/Cu tabakasının bir parçasını vakumlu depodan çıkarın.</li>
	<li>Hazırlanacak ızgara sayısını tamamen kaplamak için yeterli olacak Cu-grafen tabakasının küçük bir karesini dikkatlice kesmek için temiz ve tozsuz makas kullanın. Örneğin, 5 x 5 dizide düzenlenmiş 25 ızgara için 18 mm x 18 mm boyutlarında bir parça kesin. Grafen/Cu sayfasını temiz, kuru cımbızla kurutma kağıdının üzerine yerleştirin. Grafen/Cu tabakasının arka tarafının aşağı baktığından emin olun ve üst tarafı arka taraftan ayırt etmek zor olduğundan grafen/Cu tabakasını yanlışlıkla çevirmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Grafen/Cu tabakasının dört köşesini kurutma kağıdına/lamel kağıdına bantlayın, bant ile grafen/Cu tabakası arasındaki temas miktarını en aza indirin, çünkü bantla kaplı herhangi bir bölge bir sonraki adımda MMA ile kaplanmayacaktır. NOT: Statik deşarj grafen filmlere zarar verebilir ve bu nedenle, grafen veya grafen ızgaraları tutarken elektriksel olarak topraklanmış kalmanız ve statik yük birikimini en aza indirmeniz önerilir. Bu, grafen veya grafen ızgaralarını tutmadan hemen önce bir bilek topraklama kayışı takarak veya topraklanmış metal bir nesneye dokunarak gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>4. Tek katmanlı grafen / Cu tabakasını ince bir MMA (8.5) MMA EL6 (MMA) tabakası ile kaplayın
NOT: Cu kazındıktan sonra, bu MMA katmanı, gelecekteki adımlarda grafen tabakasının işlenmesini sağlamak için grafen tek tabakasını destekleyecektir. MMA kaplaması ayrıca grafen filminin görselleştirilmesini de sağlar, çünkü tek başına bir grafen tabakası şeffaf olacaktır.
<ol><li>Lameli bantlanmış grafen/Cu tabakası ile birlikte ev yapımı bir spin kaplayıcı üzerine yerleştirin (bu, bir bilgisayar fanı kullanılarak monte edilebilir) daha önce Han ve ark.25 tarafından açıklandığı gibi bir çeker ocak içine (Şekil 2B).</li>
	<li>Koruyucu gözlük takarak, grafen tabakasına bir cam pipet kullanarak iki damla MMA ekleyin ve hemen maksimum hızda dönmeye başlayın.</li>
	<li>Dönerken, ortasına iki damla daha ekleyin. 1 dakika döndürün. NOT: Grafeni tamamen kaplamak için yeterli MMA'nın uygulandığından emin olun. Emin değilseniz, birkaç damla daha ekleyin. Grafen tam olarak kaplanmamışsa, Cu kazındıktan sonra filmde "delikler" belirir.</li>
	<li>Çeker ocak içinde 10 dakika kurumaya bırakın.</li>
</ol>5. Grafen / Cu tabakasının arka tarafındaki grafeni çıkarın
NOT: Bakırın arka tarafında (MMA ile kaplanmamış taraf) yetiştirilen grafen, sonraki adımlara geçmeden önce çıkarılmalıdır çünkü bu fazla grafen, Cu aşındırmanın etkinliğini azaltacaktır. Bu grafeni, biyolojik numune hazırlama için EM ızgaralarını hazırlamak için tipik olarak kullanılan herhangi bir kızdırma deşarj cihazı kullanılarak gerçekleştirilebilen plazmaya maruz bırakarak çıkarıyoruz.
<ol><li>Bandı dikkatlice çıkarın ve MMA kaplı grafen/Cu tabakasını temiz, kuru cımbızla lamelden kaldırın.</li>
	<li>MMA / grafen / Cu tabakasının parçasını, MMA tarafı aşağı bakacak şekilde temiz ve tozsuz bir cam lamel ile bantlayın.</li>
	<li>MMA/grafen/Cu tabakası ile lamel kızdırma deşarj cihazına yerleştirin ve negatif leke veya cryoEM numune hazırlama için ızgaralar hazırlarken tipik olarak kullanılacak ayarları uygulayın. NOT: Arka tarafta Cu'nun oksidasyonunu önlemek için uzun süreli kızdırma deşarjından kaçınılmalıdır, bu da grafen film üzerindeki bakır oksit (CuO) (nano) parçacıklarının kirlenmesine neden olabilir.</li>
</ol>6. APS çözeltisinde MMA / grafen / Cu tabakasından Cu'yu aşındırın
<ol><li>Çeker ocakta, 200 mL taze yapılmış APS solüsyonunu temiz ve tozsuz bir kristalizasyon kabına (150 x 75 mm) dökün.</li>
	<li>MMA/grafen/Cu tabakasını cam slayttan çıkarın. MMA'nın hangi tarafta olduğunu takip edin.</li>
	<li>Aşındırmaya başlamak için, MMA/grafen/Cu tabakasını, plazma ile işlenmiş Cu tarafı aşağı bakacak şekilde APS çözeltisinin yüzeyine yerleştirin. Tozun girmesini önlemek için geniş cam kabı bir parça alüminyum folyo veya bir kapakla örtün.</li>
	<li>3 saat inkübe edin. Cu'nun çoğu 1 saat sonra kazınmamışsa, bölüm 2-6'daki adımları tekrarlayın ve ardından bir sonraki adıma geçin. NOT: Cu'nun çoğu 1 saat sonra kazınmazsa, filmin MMA/grafen tarafının Cu tarafı yerine APS çözeltisinin yüzeyine yerleştirilmiş olması muhtemeldir. Cu 3 saat sonra tamamen kazınmalıdır ve Cu tamamen kazınmışsa MMA/grafen filmi renksizdir. Grafen kolayca kirletir, bu nedenle yüzeylerde tiftik veya yağlı kalıntı birikmesini önlemek için tüm kapları kapattığınızdan emin olun, çünkü bu grafenin kalitesini olumsuz yönde etkileyecektir.</li>
</ol>7. MMA / grafen filmini DI suyunda durulayın
<ol><li>Çeker ocakta, temiz ve tozsuz bir kristalizasyon kabını DI su ile doldurun.</li>
	<li>APS çözelti yüzeyine göre ~45° açıyla konumlandırılmış temiz, tozsuz bir cam lamel ile grafen-MMA filmini nazikçe alın.</li>
	<li>Cam lameti suya yaklaşık 90° açıyla yerleştirin ve cam lamel yavaşça suya indirin, böylece MMA / grafen slayttan yavaşça kayar ve su yüzeyinde yüzer.</li>
	<li>Herhangi bir APS'yi yıkamak için MMA/grafen filmini 1 saat su yüzeyinde bırakın.</li>
</ol>8. Tek katmanlı grafen ile kaplanacak ızgaraları temizleyin
NOT: Grafenin ızgara folyo yüzeyine yapışmasını en üst düzeye çıkarmak için grafenin aktarılacağı ızgaralar mümkün olduğunca temiz olmalıdır. Ticari olarak satın alınan ızgaralar genellikle grafen transferinden önce çıkarılması gereken artık kirleticiler içerir.
<ol><li>Üç kristalize kabı tozdan arındırılacak şekilde temizleyin ve kurulayın.</li>
	<li>Bir çeker ocakta, üç kristalleştirici kabın her birine 200 mL kloroform, aseton ve izopropil alkol (IPA) dökün. Organik çözücülerin buharlaşmasını en aza indirmek için kristalleşen kapları alüminyum folyo ile örtün. DİKKAT: Kloroform ve aseton cilt tahrişine neden olur ve solunduğunda toksik olabilir. Bu organik çözücülere maruz kalmayı sınırlayın ve KKD giyin.</li>
	<li>Sıkıştırma TEM ızgara tutucu bloğunun tabanını, 200 mL kloroform içeren ilk kristalizasyon kabının dibine yerleştirin.</li>
	<li>Her ızgarayı ızgara kutusundan ızgara tutucu bloğundaki bir kuyuya ayrı ayrı aktarın ve fenestre film tarafının yukarı baktığından emin olun. Kristalleşen kabı alüminyum folyo ile örtün, bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve 30 dakika hafifçe çalkalayın.</li>
	<li>Metal kapağı, bir sonraki kristalleşme kabına aktarım sırasında ızgaraları sabitleyecek olan ızgara tutucu bloğuna yerleştirin. Izgara tutucu bloğunu bükülmüş bir çatal ve uzun cımbızla kristalleştirme kabından dikkatlice kaldırın ve 200 mL aseton içeren ikinci kristalleştirme kabının dibine yerleştirin. Kapağı ızgara tutucu bloğundan çıkarın ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca hafifçe sallayın.</li>
	<li>Kapağı ızgara tutucu bloğun üzerine yerleştirin ve aseton kalıntısını temizlemek için 200 mL IPA çözeltisi içeren kristalleştirici bir kaba aktarın. Kapağı ızgara tutucu bloğundan çıkarın ve 20 dakika boyunca hafifçe sallayın.</li>
	<li>Izgaraları, fenestre film tarafı yukarı bakacak şekilde ızgara tutucu bloğundan kurutma kağıdı ile kaplı bir cam Petri kabına ayrı ayrı aktarın.</li>
	<li>Izgaraları çeker ocak altında en az 30 dakika kurutun ve üzerine toz düşmesini önlemek için ızgaraların örtüldüğünden emin olun.</li>
</ol>9. Temiz ızgaraları, DI su altında paslanmaz çelik tel örgü veya delikli tepsi üzerine yerleştirilmiş kurutma kağıdına aktarın
NOT: Grafenin su üzerinde yüzdürülebilmesi ve ızgaraların üzerine indirilebilmesi için ızgaralar düz bir yüzeyde DI su altına daldırılmalıdır. Bu, Palovcak ve ark.18 tarafından tarif edildiği gibi, grafen-oksit ızgaraları oluşturmak için kullanıldığı gibi, ticari bir ızgara kaplama teknesi veya bir Petri kabı ve bir peristaltik pompa kullanılarak gerçekleştirilebilir.
<ol><li>Paslanmaz çelik ağı veya tepsiyi bir ızgara kaplama oluğuna yerleştirin ve DI suyla durulayın.</li>
	<li>Paslanmaz çelik ağdan/tepsiden biraz daha küçük olan kurutma kağıdını kesin ve DI suyuna batırılmış platformun üzerine yerleştirin. NOT: Kurutma kağıdı, hareket ve kullanım sağlamak için platformdan biraz daha küçüktür.</li>
	<li>Temizlenmiş ızgaraları, fenestre film tarafı kurutma kağıdının üzerine bakacak şekilde nazikçe aktarın. Izgaralar muhtemelen hidrofobik olacaktır, bu nedenle ızgaraları dikey olarak suya daldırın veya su gerilimi nedeniyle bükülebilirler. Izgaraları, birbirlerine mümkün olduğunca yakın olacak, ancak üst üste binmeyecek şekilde kare bir diziye yerleştirin (Şekil 2C).</li>
	<li>Izgaralar artık bir grafen tek tabakası ile kaplanmaya hazırdır. Izgara kaplama oluğunu, suyun yüzeyi ızgaraların en az 5 mm üzerinde olacak şekilde daha fazla DI su ile doldurun.</li>
</ol>10. Grafeni ızgaralara aktarın
<ol><li>MMA/grafen filmini, grafen filmden biraz uzakta bir açıyla oluğa yavaşça indirerek, kristalleştirici tabaktan temiz bir lamel ile dikkatlice çıkarın. Lameli grafen-MMA tabakasının altına, tabakanın kenarları ve lamel paralel olacak şekilde yerleştirin ve ardından lamel dikey olarak sudan kaldırın ve MMA/grafen filmini beraberinde getirin.</li>
	<li>Lameli ~45° açıyla suya indirerek MMA/grafen filmini oluğa aktarın, böylece MMA/grafen filmi lamelden ayrılır ve su yüzeyinde yüzer.</li>
	<li>Su seviyesi düşürülmeden önce MMA/grafen filmini doğrudan ızgaraların üzerine yerleştirin. MMA/grafen filmin konumunu dikkatli bir şekilde manipüle etmek için açıklığı kapatmak için ucu eritilmiş bir cam Pasteur pipeti kullanın.</li>
	<li>Su seviyesini şırınga ile yaklaşık 1.25 mL/dk'da, MMA/grafen filmi filtre kağıdına inerken ızgara yüzeylerini tamamen kaplayacak şekilde yavaşça düşürün NOT: Su seviyesi düştükçe ızgaraların üzerindeki konumunu korumak için grafen-MMA tabakasının daha fazla manipülasyonu gerekebilir.</li>
	<li>Izgaraları tutan kurutma kağıdını temiz, kuru, tozsuz bir Petri kabına kaldırmak için temiz, kuru bir cımbız kullanın veya tüm paslanmaz çelik platformu aktarın.</li>
	<li>MMA/grafen ızgaralarını çeker ocak altında en az 30 dakika havayla kurutun. Toz parçacıklarından kaynaklanan herhangi bir kirlenmeyi önlemek için ızgaraları alüminyum folyo veya kapakla kapalı tutun.</li>
	<li>Izgaraları bir inkübatöre aktarın ve ızgaraları 65 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika pişirin.</li>
	<li>Izgaraları inkübatörden çıkarın ve ızgaraları oda sıcaklığına soğutmak için oda sıcaklığında 5 dakika kapalı bırakın.</li>
</ol>11. MMA'nın çıkarılması ve ızgaraların temizlenmesi
NOT: Grafen kaplı ızgaralarda MMA kalmasını önlemek için MMA asetonda iyice yıkanmalıdır.
<ol><li>Bir çeker ocakta, oda sıcaklığında 200 mL aseton içeren iki kristalleştirici kap ve 200 mL izopropanol (IPA) içeren bir kristalleştirici kap hazırlayın. Organik çözücülerin buharlaşmasını en aza indirmek için kristalleşen kapları alüminyum folyo ile örtün. DİKKAT: Aseton kullanırken cilt tahrişine neden olabileceğinden ve solunduğunda zararlı olabileceğinden KKD giyin.</li>
	<li>Sıkıştırma TEM ızgara tutucu bloğunun tabanını, 200 mL taze aseton içeren ilk kristalizasyon kabının altına yerleştirin.</li>
	<li>MMA tarafının yukarı baktığından emin olarak, her ızgarayı kurutma kağıdından ızgara tutucu bloğundaki bir kuyuya ayrı ayrı aktarın. Kristalleşen kabı folyo ile örtün, orbital bir çalkalayıcıya yerleştirin ve 30 dakika hafifçe çalkalayın.</li>
	<li>Metal kapağı, bir sonraki kristalleşme kabına aktarım sırasında ızgaraları sabitleyecek olan ızgara tutucu bloğuna yerleştirin. Izgara tutucu bloğunu bükülmüş bir çatal ve uzun cımbızla kristalizasyon kabından dikkatlice kaldırın ve 200 mL taze aseton içeren ikinci kristalleştirme kabının dibine yerleştirin. Kapağı ızgara tutucu bloğundan çıkarın ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca hafifçe sallayın.</li>
	<li>Kapağı ızgara tutucu bloğun üzerine yerleştirin ve aseton kalıntısını temizlemek için 200 mL IPA çözeltisi içeren kristalizasyon kabına aktarın. Kapağı ızgara tutucu bloğundan çıkarın ve 20 dakika boyunca hafifçe sallayın.</li>
	<li>Izgaraları kurutma kağıdıyla kaplı küçük bir cam Petri kabına aktarın ve ızgaraları en az 10 dakika havayla kurutun. Toz parçacıklarından kaynaklanan herhangi bir kirlenmeyi önlemek için ızgaraları bir kapakla kapalı tutun.</li>
	<li>Izgaralar kullanıma hazırdır veya bir vakumlu desikatör içinde alüminyum folyo ile sarılmış bir ızgara kutusuna aktarılır. NOT: Grafen ızgaralarının bir vakumlu desikatör içinde saklanması, hidrofobik parçacıkların ortam koşullarından kirlenmesini önleyebilir. Bu ızgaralar kullanımdan önce birkaç aya kadar saklanabilir27.</li>
</ol>12. UV / Ozon tedavisi ile grafen ızgaralarını hidrofilik hale getirin
NOT: Grafen son derece hidrofobiktir ve bu, kriyoEM numune hazırlama ile uyumlu değildir, çünkü leke daldırma yaklaşımları, üzerine bir damla numunenin eşit olarak yayılabileceği hidrofilik bir yüzey gerektirir. Geleneksel kızdırma deşarj cihazları, grafen yüzeyini hidrofilik hale getirmek için plazmayı hafifçe darbeleyecek şekilde yapılandırılabilirken, bu cihazlar ince grafen tek tabakasını yok etme eğilimindedir. Daha önce, grafen25'in yüzeyini kısmen oksijenlendirmek için bir UV/ozon temizleyicinin kullanılabileceği ve tek tabakaya zarar vermeden kriyoEM numune hazırlama için hidrofilik hale getirilebileceği gösterilmişti.
<ol><li>Astarlama gerektiren bir UV/Ozon sistemi kullanıyorsanız, sistemi açın ve lambayı 10 dakika boyunca ısıtın (bu adımda hiçbir ızgaranın açıkta kalmadığından emin olun). UV/ozon temizleyici astarlanırken, ızgaraları vakumlu kurutucudan çıkarın ve temiz bir lamel üzerine aktarın.</li>
	<li>UV/Ozon sistemi hazır olduğunda, ızgaraları içeren lamel grafen tarafı yukarı bakacak şekilde UV/ozon temizleyiciye yerleştirin ve ızgaraları 4 dakika boyunca ozon gazına maruz bırakın.</li>
	<li>Ozona maruz kaldıktan sonra, cryoEM numune hazırlama için ızgaraları hemen kullanın. NOT: Astarlama gerektiren bir UV/Ozon sistemi kullanılıyorsa, lamba 10 dakika bekletildikten hemen sonra temizleyiciye ızgaralar yerleştirilmelidir, aksi takdirde numune hazırlama için grafeni oksijenlendirmek için yeterli ozon gazı üretemeyecek kadar soğuk olacaktır. Grafen tabakasını tahrip edeceği için ızgaraları 6 dakikadan fazla ozon gazına maruz bırakmayın.</li>
</ol>

TEM Izgaralarının Grafen Tek Tabaka ile Kaplanması

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Biyolojik numunelerin ince bir camsı buz tabakasında korunması, yüksek çözünürlüklü kriyoEM yapısının belirlenmesi için kritik öneme sahip bir adımdır. Bununla birlikte, araştırmacılar genellikle tercih edilen oryantasyon, karmaşık sökme, denatürasyon ve agregasyon getiren AWI ile etkileşimlerden kaynaklanan sorunlarla karşılaşırlar. Ayrıca, numuneler, fenestre edilmiş bir filmin delikleri boyunca asılı duran ince buzu doldurmak için her zaman yeterince konsantre edilemez. Birkaç araştırma grubu, bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmeye yardımcı olmak için EM ızgaralarını tek katmanlı bir grafen ile kaplamak için yöntemler geliştirmiştir 24,25,26,27,28,29,30 ve grafen ızgaraları büyük bir başarı ile kullanılmıştır. Burada, şirket içinde grafen ızgara gruplarını etkili bir şekilde hazırlamak ve TEM tarafından grafen ızgaralarının kalitesini incelemek için adım adım talimatlar sunuyoruz. Aşağıda ana hatlarıyla belirttiğimiz bazı kritik adımlar sırasında özel dikkat gösterilmesi gerektiğini vurguluyoruz.
Grafen, havadaki kirleticileri çekme konusunda güçlü bir eğilime sahiptir. Bu nedenle, grafen ızgara üretim işlemi sırasında, grafen/Cu levha veya ızgaralarla temas eden tüm aletlerin temiz ve tozsuz olduğundan emin olmak önemlidir. Grafeni aktarmak için kullanılan cam lameller, etanol ve DI su ile durulanarak veya bir hava silgi kullanılarak temizlenebilir. Ayrıca çeker ocak altında çalışılması ve grafen levhaların ve ızgaraların her zaman folyo veya temiz bir cam plaka ile kaplı tutulması tavsiye edilir. Izgaralardaki toz veya kirleticiler, grafenin EM ızgaralarına tamamen yapışmasını engelleyebilir. Grafen veya grafen kaplı ızgaraları tutarken, grafen filmin statik boşalmadan zarar görmesini önlemek için elektriksel olarak topraklanması önemlidir. Statik boşalma, bir bilek topraklama kayışı kullanılarak, grafen veya grafen ızgaraları her tutulduğunda topraklanmış metal bir nesneye dokunarak ve/veya cımbızı tutan ele eldiven takmayarakönlenebilir 24.
Tek bir grafen tabakası çok ince olduğundan (bir karbon atomunun genişliği), grafenin ızgaralara aktarılması sırasında grafenin MMA veya poli-MMA (PMMA) gibi organik bir tabaka ile desteklenmesi önemlidir. PMMA, grafen transferi için en yaygın kullanılan malzemedir. Bununla birlikte, PMMA'nın grafen ile güçlü bir afinitesi vardır ve genellikle grafen film üzerinde polimer kontaminasyonuna neden olabilir. MMA, daha az kalıntı kontaminasyon bıraktığı için bu protokolde kullanılır25. Bununla birlikte, hem PMMA hem de MMA, grafen filmin bazı bölgelerinde gözlemlenebilen kırışıklıklar ve çatlaklar oluşturma dezavantajına sahiptir (Şekil 3B). CVD yöntemi31 ile grafen büyümesi sırasında yaygın olarak meydana geldikleri için bu kırışıklıklardan kaçınmak zor olabilir. Son zamanlarda ultra düz grafenin kırışıklık olmadan büyütülmesi için bir yöntem geliştirilmiştir, bu sayede bakır folyo, bir büyüme substratı olarak bir Cu (111) / safir gofret ile değiştirilir32.
Deneyimlerimize dayanarak, bakır aşındırma işleminden sonra kırılgan hale gelen ve sonraki adımlarda işlenmesi zor olan üreticilerden polimer kaplı Cu-grafen levhalar satın almaktansa, grafen/Cu levhaları satın almak ve grafeni şirket içinde MMA ile desteklemek daha iyidir. MMA kaplama için kullandığımız spin kaplayıcı, daha önce açıklandığı gibi yerel bir bilgisayar/donanım mağazasından parçalar kullanılarak ucuza üretilebilir25.
MMA kaplama aşamasında, Cu-grafen levha üzerindeki grafen yüzeyinin tamamının MMA ile kaplanması önemlidir. Cu kazındıktan sonra, MMA-grafen yarı saydam hale gelecek ve MMA kapsamı olmayan alanlar boş delikler gibi görünecektir. Bakır tarafta MMA kaplamasını önlemek için, kaplama sırasında CVD filminden çıkan fazla MMA'yı emecek şekilde altına küçük bir parça kurutma kağıdı yerleştirmek önemlidir.
Aşındırma ve durulamadan sonra, MMA/grafen tabakası, su seviyesini kontrol etmek için bir şırınga veya peristaltik pompa ile ticari veya ev yapımı bir oluk sistemi kullanılarak EM ızgaralarına aktarılmaya hazırdır. Transfer adımından önce, ızgaraları ardışık kloroform, aseton ve IPA banyolarında iyice durulamak önemlidir. Grafen kaplı ızgaraların 65 °C'de pişirilmesi, grafen bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur ve grafenin ızgaralara adsorpsiyonunu destekler. Son olarak, ızgaralarda MMA kontaminasyonunu önlemek için, MMA'yı bir aseton banyosunda iyice çıkarmak ve ızgaraları IPA'da temizlemek önemlidir. Yıkanmamış herhangi bir MMA kalıntısı EM ızgaralarında gözlemlenecek ve görüntülerin sinyal-gürültü oranını azaltacaktır (Şekil 3C). Grafen yüzeylerini daha fazla temizlemek için aseton-IPA yıkama işlemi tekrarlanabilir.
Grafen ızgaralarını hidrofilik hale getirmek için ızgaraları UV / Ozon'a maruz bıraktık. Farklı UV/ozon temizleyici modelleri, grafene zarar vermeden cryoEM numune hazırlama için grafen katmanını yeterince oksijenlendirmek için optimizasyon gerektirebilir. Sistemden bağımsız olarak, UV/Ozon tedavisinden hemen sonra kriyoEM numune uygulaması için bu ızgaraların kullanılması çok önemlidir. Grafen ızgaralarını hidrofilik hale getirmek için alternatif yöntemler diğer çalışmalardaaçıklanmıştır 33,34.

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM), biyomakromoleküllerin 3D yapılarını araştırmak için kullanılan, giderek daha uygulanabilir hale gelen bir teknolojidir. Son on yılda elektron mikroskobu optiği, doğrudan elektron algılama1 ve bilgisayar algoritmaları2,3,4'teki teknolojik gelişmeler, cryoEM kullanıcılarının biyokimyasal olarak kararlı makromoleküler komplekslerin yapılarını atomik çözünürlüğe yakın 5,6,7,8'e kadar belirlemelerini sağlamıştır . Bu ilerlemelere rağmen, biyolojik örneklerin çoğunun bu kadar yüksek çözünürlüklerde çözülmesini engelleyen kriyoEM görüntüleme için numunelerin korunmasında dikkate değer engeller bulunmaktadır.
Yüksek çözünürlüklü kriyoEM analizi için numune hazırlama, ince bir vitrifiye buz tabakası içinde çok çeşitli yönlerde eşit olarak dağılmış makromoleküllerin yakalanmasını içerir. "Leke ve daldırma" dondurma yöntemleri, kriyoEM çalışmalarıiçin ızgaralar üzerinde biyolojik numunelerin ince filmlerini oluşturmak için kullanılan en yaygın kullanılan yöntemlerdir 9,10. Bu yöntemler, hidrofilik hale getirilmiş fenestrat bir film içeren bir EM ızgarasına birkaç mikrolitre numune çözeltisinin uygulanmasını ve ardından ızgarayı hızla bir sıvı etan veya etan-propan karışımı kriyojenine daldırmadan önce numunenin çoğunluğunun filtre kağıdı ile lekelenmesiniiçerir 9.
Bu yöntem, çok çeşitli biyolojik örneklerin yapılarını belirlemek için başarıyla kullanılmış olsa da, yaygın olarak kullanılan tüm cryoEM örnek hazırlama yöntemleri, örnekleri hidrofobik hava-su arayüzüne (AWI) maruz bırakır ve bu da genellikle yüksek çözünürlüklü yapı belirlemeyi sınırlayan sorunları ortaya çıkarır. Biyolojik örneklerin AWI'ye maruz kaldıklarında denatüre olma eğiliminin yüksek olduğu tespit edilmiştir, bu da karmaşık toplama ve sökmeyeyol açabilir 11,12,13,14. Ayrıca, biyolojik örneklerin yüzeylerindeki hidrofobik yamalar, parçacıkların buzda tercih edilen yönelimleri benimsemesine neden olur12. Birçok senaryoda, numunenin tek bir hidrofobik bölgesi, tüm parçacıkları buzda tekil bir yönelim benimsemeye zorlar ve böylece güvenilir bir yeniden yapılandırma oluşturma yeteneğini ortadan kaldırır. AWI ile ilgili sorunlara ek olarak, numuneler, delikler15 içindeki buzda asılı kalan parçacıkların sayısını sınırlayarak, fenestre edilmiş film tabakasının yüzeyi için bir afinite gösterebilir.
AWI veya filmler ile etkileşimlerden kaynaklanan bu sorunları azaltmak için çeşitli metodolojik ve teknolojik çözümler geliştirilmiştir16,17. Popüler bir yaklaşım, EM ızgaralarının fenestre filmini ince (onlarca nanometre) amorf karbon tabakası ile kaplamaktır. Bu kaplama, numuneyi AWI15,18,19,20 ile etkileşimlerden kısmen koruma avantajıyla, partiküllerin adsorbe edilebileceği delikler boyunca kesintisiz bir yüzey sağlar. Bununla birlikte, ek karbon katmanı, görüntülenen bölgelerdeki arka plan sinyali miktarını artırarak, özellikle küçük (<150 kDa) numuneler için ulaşılabilir çözünürlüğü tehlikeye atabilecek gürültüye neden olur. Son yıllarda, cryoEM ızgaralarında destekleyici filmler üretmek için grafen oksit (GO) pullarının kullanılmasının geleneksel amorf karbona göre avantajları olduğu gösterilmiştir. GO pulları, grafit katmanlarının oksidasyonu yoluyla üretilir, bu da yüzeylerde ve kenarlarda karboksil, hidroksil ve epoksi grupları formundaki önemli oksijen içeriği nedeniyle hidrofilik olan sözde kristalli tek katmanlı grafit tabakaları ile sonuçlanır. Sulu süspansiyonlardaki ticari GO pulları ucuzdur ve GO pullarını EM ızgaralarına uygulamak için çok sayıda yayınlanmış yöntem vardır18,21. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle yalnızca kısmen GO pulları ile kaplanmış ızgaraların yanı sıra birden fazla GO pulu katmanı içeren bölgelerle sonuçlanır. Ayrıca, GO pulları, ince amorf karbon22,23 ile gözlemlenene yakın olan cryoEM görüntülerine gözle görülür bir arka plan sinyaline katkıda bulunur.
Tek bir 2D kristal karbon atomu dizisinden oluşan bozulmamış tek katmanlı grafen, elektron mikroskobunda faz kontrastı üretmediği için GO'dan farklıdır. Böylece tek katmanlı grafen, biyolojik numunelerin görüntülenmesi için görünmez bir destek tabakası oluşturmak için kullanılabilir. Tek katmanlı grafen ayrıca GO'dan daha güçlüdür ve bir EM ızgarası üzerinde tek bir tek katman olarak uygulanabilir ve grafen kaplı EM ızgaralarının imalatındaki son gelişmeler, şirket içinde yüksek kapsamlı tek katmanlı grafen ızgaraları hazırlamayı mümkün kılmıştır 24,25,26,27,28,29,30. Bununla birlikte, kriyoEM yapı tayini için grafen kaplı ızgaraların kullanılmasının faydalarına rağmen, ticari seçeneklerin engelleyici maliyeti ve şirket içi üretimin karmaşıklığı nedeniyle yaygın olarak kullanılmamaktadır. Burada, biyolojik örneklerin kriyoEM yapısının belirlenmesi için tek katmanlı bir grafen ile kaplanmış EM ızgaralarını etkili bir şekilde üretmek için adım adım bir kılavuz açıklıyoruz (Şekil 1). Bu ayrıntılı protokolü izleyerek, cryoEM araştırmacıları tek bir günde düzinelerce yüksek kaliteli grafen destek ızgarasını tekrarlanabilir bir şekilde hazırlayabilirler. Grafen kaplı ızgaraların kalitesi, bir LaB6 filamenti ile donatılmış düşük kaliteli bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak kolayca incelenebilir.

<table><tbody><tr><td>% 70 EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td> <td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>Tehlikeli; çok dikkatli kullanın</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>45 Izgara için Sıkıştırma TEM Izgara Tutucu Bloğu</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar fanı</td><td>Amazon (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td> Kapak kayması, <td></td></tr><tr><td></td><td>Bellco Glass</td><td>1203J71</td>, <td>Standart kapak kaymaları</td></tr>, <tr><td>Kristalleştirici kap</td>, <td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr>, <tr><td>Elektronik silgi,</td><td>Falcon, Güvenlik Ürünleri</td><td>75-37-6</td><td></td></tr>, <tr><td>Falcon Tozdan Arındırılmış Hava Silgisi</td>, <td>Zımba Yok</td>, <td>Filtre</td><td></td></tr><tr><td>kağıtları</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu cımbız</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Şişe</td><td>Pyrex</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>Çatal Süpermarket</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cam pastör pipeti</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Grafen/Cu</td><td>Grafen</td><td>N/A</td><td>CVD tek katmanlı grafen cu</td></tr><tr><td>Izgara Kaplama Teknesi</td><td>Ladd Araştırma Endüstrileri</td><td>10840</td><td>Kırılgan</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Kapton Bant</td><td>Amazon (MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>Poliimid bant Kimwipes</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Uzun twzeer</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>Metal ızgara tutucu</td><td>Ted Pella</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU Gelişmiş Malzemeler</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>Model 10 Laboratuvar Fırını</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td></td><td></td>FO19013</tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Pyrex</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>Standart Analog Orbital Çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>Holey altın ızgaralar</td></tr><tr><td>Ultraviyole Ozon Temizleme Sistemleri</td><td>UVOCS</td><td>modeli T10X10/OES</td><td></td></tr></tbody></table>

kriyoelektron mikroskobu için tek katmanlı grafen kaplı ızgaraların imalatı

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

Kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM), makromoleküler komplekslerin atomik yapısını araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. CryoEM için numune hazırlama, numunelerin tipik olarak fenestre edilmiş bir destek filminin delikleri içinde asılı duran ince bir camsı buz tabakasında korunmasını gerektirir. Bununla birlikte, kriyoEM çalışmaları için yaygın olarak kullanılan tüm numune hazırlama yaklaşımları, numuneyi hava-su arayüzüne maruz bırakarak, numune üzerinde genellikle denatürasyon, agregasyon ve karmaşık ayrışma ile sonuçlanan güçlü bir hidrofobik etki yaratır. Ayrıca, numunenin bölgeleri ile hava-su arayüzü arasında tercih edilen hidrofobik etkileşimler, makromoleküller tarafından benimsenen yönelimleri etkileyerek anizotropik yönlü çözünürlüğe sahip 3D rekonstrüksiyonlarla sonuçlanır. 
CryoEM numunelerinin tek bir grafen tabakasına adsorpsiyonunun, arka plan gürültüsünün girişini en aza indirirken hava-su arayüzü ile etkileşimleri azaltmaya yardımcı olduğu gösterilmiştir. Grafen destekleri, cryoEM görüntüleme için gerekli protein konsantrasyonunu önemli ölçüde düşürme avantajını da sunar. Bu desteklerin avantajlarına rağmen, grafen kaplı ızgaralar, ticari seçeneklerin engelleyici maliyeti ve büyük ölçekli şirket içi üretimle ilgili zorluklar nedeniyle kriyoEM topluluğu tarafından yaygın olarak kullanılmamaktadır. Bu makale, neredeyse tam tek katmanlı grafen kaplamasına sahip kriyoEM ızgara gruplarını hazırlamak için etkili bir yöntemi açıklamaktadır.

Burada açıklanan grafen ızgara üretim protokolünün başarılı bir şekilde yürütülmesi, tamamen tek bir tek katmanlı grafen ile kaplanmış EM ızgaraları ile sonuçlanacaktır. Izgaraların grafen kapsamı herhangi bir TEM kullanılarak kontrol edilebilir. Temiz bir grafen tek tabakası TEM'de neredeyse görünmez olduğundan, mikroskobun kırınım modunu kullanarak incelenmeli ve grafeni oluşturan karbon atomlarının altıgen organizasyonuna karşılık gelen Bragg noktaları gözlemlenmelidir (Şekil 3A). MMA kaplama sırasında ortaya çıkan tek katmanlı grafenin bazı kırışıklıklarını zaman zaman gözlemlemek normaldir (Şekil 3B). Grafen kaplı deliklerden birinin ortasında yüksek büyütmeli bir görüntü elde ederek grafen üzerinde bulunan kirlilik seviyesi de kontrol edilebilir (Şekil 3C). Yüksek çözünürlüklü bir detektörle elde edilirse, bu görüntünün bir Fourier dönüşümü, 2.14 Å'de karbon-karbon aralığına karşılık gelen Bragg noktaları içermelidir (Şekil 4C). Karbon atomlarının tek tabakası, faz kontrastı oluşturmak için yeterli elektron saçılımı üretmez ve bu nedenle temiz grafen görüntüsü, görüntünün Fourier Dönüşümünde kontrast transfer fonksiyonu ile ilişkili Thon halkalarını sunmayacaktır. Bununla birlikte, grafen ızgaralarının üretildikten sonra kirlenmesini önlemek çok zordur ve EM ızgaralarının yetersiz yıkanması veya grafen kaplamadan sonra MMA'nın çıkarılması, gerçek alan görüntülerinde görülebilen ızgaralarda dikkate değer kirleticilere neden olacaktır (Şekil 3C). Şekil 4'te gösterildiği gibi, grafen ızgaraları, grafen desteği olan (Şekil 4A) ve grafen desteği olmayan (Şekil 4B) delikli altın ızgaralara 0,5 mg/mL apoferritin uygulandığında gözlemlendiği gibi, bir numune üzerinde konsantre edici bir etkiye sahiptir. Apoferritin gibi proteinlerin kriyoEM yapılarını yüksek çözünürlükte çözmek için benzer grafen üretim protokolleridaha önce tanımlanmıştır 25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> Şekil 1: Grafen kaplı cryoEM ızgaralarının hazırlanması için şematik. Grafen ızgara üretim sürecindeki temel adımlar gösterilmektedir. Kısaltmalar: cryoEM = kriyojenik elektron mikroskobu; MMA = metil metakrilat; APS = amonyum persülfat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> Şekil 2: Grafen ızgaraları yapmak için gerekli malzemeler. (A) Kriyo-EM ızgaralarını kaplamak için gerekli malzemeler buna göre etiketlenir. (B) Bir cam slayt üzerinde bir kurutma kağıdına bantlanmış grafen/Cu tabakası ile kaplayıcının yakından görünümü. Spin kaplayıcı, yerel bir bilgisayar/donanım mağazasından parça satın alınarak monte edilebilir. (C) Su seviyesini kontrol etmek için kullanılabilecek bir şırıngaya bağlı ızgara kaplama oluğunun yakından görünümü. Izgaralar, paslanmaz çelik bir ağ üzerinde bir kurutma kağıdının üzerine yerleştirilir. Kurutma kağıdı, grafen tabakasının onunla eşleştirilebilmesi için ızgaraların konumunu manevra etmeye yardımcı olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> Şekil 3: Kırışıklıkları veya MMA kontaminasyonunu gösteren bir grafen ızgarasının temsili bir kırınım deseni görüntüsü ve parlak alan görüntüleri . (A) Tek katmanlı bir grafen ile kaplanmış EM ızgaraları, kırınım modunda bir TEM'de görüntülendiğinde grafenin altıgen kafesine karşılık gelen Bragg tepe noktalarını gösterecektir. 2.14 şkarbon-karbon aralığına karşılık gelen Bragg tepe noktası daire içine alınır ve bir okla gösterilir. (B) Grafen tek katmanında bazı kırışıklıklar (okla gösterilir) bulunan tek katmanlı bir grafen ızgarasının parlak alan görüntüsü. (C) MMA kontaminasyonlu tek katmanlı grafenin parlak alan görüntüsü (bir okla gösterilir). Ölçek çubukları = 100 nm (B,C). Kısaltmalar: EM = elektron mikroskobu; MMA = metil metakrilat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> Şekil 4: Grafen kaplı altın ızgaralarda apoferritin: (A) Grafen kaplı altın ızgaralarda 0.5 mg / mL apoferritin CryoEM mikrografı. (B) Aynı konsantrasyonda görüntülenen apoferritin, grafen içermeyen delikli altın ızgaralar kullanılarak hazırlandığında önemli ölçüde daha düşük konsantrasyonda görülebilir. (C) Grafen kaplı altın ızgaralar üzerinde 0.5 mg / mL apoferritin kriyoEM mikrografının FFT'si, Bragg tepe noktaları altıgen grafen kafesine karşılık gelir. Ölçek çubukları = 100 nm (A,B). Kısaltmalar: cryoEM = kriyojenik elektron mikroskobu; FFT = hızlı Fourier dönüşümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, elektron mikroskobu ızgaralarına tek bir tek katmanlı grafen uygulamak için bir protokol ve bunların kriyoEM yapı belirlemede kullanılmak üzere nasıl hazırlanacağını açıklıyoruz.

Kriyoelektron mikroskobu için tek katmanlı grafen kaplı ızgaraların imalatı

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

Şu anda biyolojik numunelerin en iyi şekilde korunması, yüksek çözünürlüklü CryoEM yapılarının elde edilmesinde büyük bir zorluktur. Numune hazırlama işlemi sırasında numuneler, numuneler üzerinde denatüre edici etkileri olan ve stabil numunelerin buzda tercihli bir yönelim benimsemesine neden olabilen ve bu da yüksek çözünürlüklü yapı tayinini önleyen hidrofobik hava-su arayüzüne maruz bırakılır. CryoEM ızgaralarının yumuşak grafen oksit gibi ince bir karbon tabakası ile kaplanması, hava-su arayüzü ile etkileşimlerle ilgili sorunları ele almak için yaygın olarak kullanılmıştır.Bununla birlikte, bu katmanlar genellikle görüntülerimizdeki arka plan gürültüsünü artırır ve bu da yapımızın çözünürlüklerini tehlikeye atar. Izgarayı tek katmanlı bir grafen ile kaplamak, önemli bir arka plan gürültüsü oluşturmadan benzer bir koruma sağlar. Grafen kaplı CryoEM ızgaralarının kullanılması, hava-su arayüzü ile etkileşimlerle ilgili sorunların üstesinden gelmeye yardımcı olabilir, ancak ticari grafen ızgaraları pahalıdır ve birçok laboratuvar, grafen ızgaralarının şirket içinde hazırlanamayacak kadar karmaşık olduğunu düşünmektedir.CryoEM alanındaki araştırmacılar artık bir günde tamamen üretilmiş düzinelerce yüksek kaliteli grafeni yeniden üretmek için bu adım adım protokolü kullanabilirler.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Destek katmanlarının kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM) ızgaralarına uygulanması, parçacık yoğunluğunu artırabilir, hava-su arayüzü ile etkileşimleri sınırlayabilir, ışın kaynaklı hareketi azaltabilir ve parçacık yönelimlerinin dağılımını iyileştirebilir. Bu belge, gelişmiş kriyo numunesi hazırlama için cryoEM ızgaralarını tek katmanlı bir grafen ile kaplamak için sağlam bir protokolü açıklamaktadır.

Yüksek Çözünürlüklü Yapı Belirleme için Tek Katmanlı Grafenin Kriyo-Elektron Mikroskobu Izgaralarına Uygulanması

Bu video plazma bağı olmayan nöron mikroakışkan cihazın nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Ucuz mikroakışkan Cihazlar İmalat PDMS Non-plazma Yapışma

Bu protokol, karbon fiber elektrotlar oluşturmak anlatılmaktadır. Bu elektrotlar daha sonra, karbon fiber amperometri ile veziküller katekolamin sürüm algılamak için kullanılır.

Amperometrik Elektrotlar imalatı

6 plaka mekansal ve zamansal oksijenasyonu üzerinden gelişmiş kontrol imkanı sağlayan bir add-on bir platform imalatı ve doğrulama. Cihaz bir dizi kültür sistemleri uyarlanabilir ve yara iyileşmesi üzerine oksijen etkilerini araştırmak amacıyla kullanılabilir.

İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Yüksek kaliteli transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri elde etmek, özellikle bol miktarda büyük su dolu vakuollere ve havalandırılmış alanlara sahip bitki hücreleri söz konusu olduğunda zordur. Tandem yüksek basınçlı dondurma ve hızlı dondurma ikamesi, mükemmel ultrastrüktürel korumaya sahip numuneler üretirken TEM için tesis numunelerinin hazırlanma süresini büyük ölçüde azaltır.

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Burada iki örnek işleme teknikleri, buz gibi yüksek basınç birleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve mikrodalga destekli örnek işleme, veri odaklı iyon demeti Taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile edinme için gömme en az reçine izledi. Bu bir fare tibial sinir örnek ve Caenorhabditis eleganskullanarak gösterilmiştir.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Burada sunulan protokol, sıvı kriyojende vitrifikasyondan önce en az 90 ms karıştırılan kendi kendine fitillenen nanotel ızgaraya iki ilgi örneği sunmak için yeni bir robotik sistem olan Spotiton'un kullanımını açıklamaktadır.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

Kriyojenik elektron tomografisinde büyük ölçekli veri toplama için artan talep, yüksek verimli görüntü alma rutinleri gerektirir. Burada açıklanan, tomografik veri toplamanın zaman verimliliğini ve verimini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan gelişmiş satın alma stratejilerinin son gelişmelerini uygulayan bir protokoldür.

Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri

Öğrenin, kriyoelektron mikroskobu için tek katmanlı grafen kaplı ızgaraların üretimini. Bu yöntem, arka plan gürültüsünü azaltarak biyolojik örneklerin korunmasını ve yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi geliştirir.

Kriyoelektron mikroskobu için tek katmanlı grafen kaplı ızgaraların imalatı

Daha fazla video keşfet