Name: Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitte Merkezi Sinir Sistemi İnflamasyonu, Demiyelinizasyon ve Akson Hasarının Skorlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin, deneysel otoimmün ensefalomiyelit fare modelinde omurilik ve beyin inflamasyonu, demiyelinizasyon ile akson hasarının histolojik skorlanması yöntemini. Bu protokol, multipl skleroz patolojisini hassas şekilde değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Raymond Sobel'e (Stanford Üniversitesi) beyin ve omurilik bölümlerini küçültme ve düzeltme yöntemini gösterdiği için teşekkür ederiz. Toronto Fenogenomik Merkezi'nden Kyle Roberton ve Milan Ganguly'ye gömme yöntemini öğrendikleri ve beyin ve omurilik bölümlerimizin çoğunu kestikleri için teşekkür ederiz. Dr. Matthew Cussick ve Dr. Robert Fujinami'ye (Utah Üniversitesi) omurilikte submeningeal ve perivasküler inflamasyonu puanlama protokollerini paylaştıkları için teşekkür ederiz. CD45 antikorunun klonunu paylaştığı için Shalina Ousman'a teşekkür ederiz. Xiofang Lu'ya doku işlemcisi ve doku gömme istasyonu eğitimi ve bu ekipmanın St. Michael Hastanesi'ndeki Keenan Biyomedikal Araştırma Merkezi'ndeki bakımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, MS Kanada'dan (SED'ye) bir Biyomedikal hibe ile desteklenmiştir. Carmen Ucciferri, Kanada Hükümeti'nden bir öğrenci tarafından desteklenmektedir. Nuria Alvarez-Sanchez, Keenan doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir.

EAE Hastalık Şiddetini Değerlendirmek için Omuriliğin Histolojik Boyanması

<ol><li>Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+a+model+for+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS).</a> Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).</li>
<li>Rasouli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GM-CSF+in+T+is+increased+in+multiple+sclerosis+and+suppressed+by+IFN-beta+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy.</a> J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).</li>
<li>Zrzavy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+%27homeostatic%27+microglia+and+patterns+of+their+activation+in+active+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis.</a> Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).</li>
<li>Kutzelnigg, A., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+multiple+sclerosis+and+related+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases.</a> Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).</li>
<li>Glatigny, S., Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+animal+models+of+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS).</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).</li>
<li>Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+animal+models%3A+A+clinical+and+histopathological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective.</a> Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).</li>
<li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Croxford, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokine+GM-CSF+the+inflammatory+signature+of+CCR2%2B+monocytes+and+licenses+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity.</a> Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).</li>
<li>Jones, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+pathological+outcomes+in+MOG+35-55+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).</li>
<li>Zuo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+gray+matter+demyelination+is+associated+with+leptomeningeal+neutrophil+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation.</a> JCI Insight. 7 (12), 158144(2022).</li>
<li>Bannerman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+pathology+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%3A+Studies+in+thy1-yfp+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice.</a> Brain. 128, 1877-1886 (2005).</li>
<li>Cahill, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+hind-limb+clasping+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+models+aspects+of+the+neurodegenerative+process+seen+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).</li>
<li>Drohomyrecky, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+acts+within+peripheral+myeloid+cells+to+limit+the+expansion+of+myelin-reactive+T+cells+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).</li>
<li>Osorio-Querejeta, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innovative+animal+monitoring+device+for+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28%26%2334%3BI+am+D+EAE%26%2334%3B%29%3A+A+more+detailed+evaluation+for+improved+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis (&#34;I am D EAE&#34;): A more detailed evaluation for improved results.</a> Mult Scler Relat Disord. 63, 103836(2022).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+diverse+assessment+indicators+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. (187), e63866(2022).</li>
<li>Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+disease+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+using+a+novel+infrared-based+automated+activity-monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system.</a> Sci Rep. 9, 19194(2019).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).</li>
<li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light%3A+A+biomarker+of+neuronal+damage+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).</li>
<li>Novakova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+disease+activity+in+multiple+sclerosis+using+serum+neurofilament+light+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein.</a> Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).</li>
<li>Pouzol, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Act-1004-1239%2C+a+first-in-class+CXCR7+antagonist+with+both+immunomodulatory+and+promyelinating+effects+for+the+treatment+of+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases.</a> FASEB J. 35 (3), 21431(2021).</li>
<li>Breakell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obinutuzumab-induced+B-cell+depletion+reduces+spinal+cord+pathology+in+a+CD20+double+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6864(2020).</li>
<li>Aharoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+glatiramer+acetate+on+neurofilament+light+chain+leakage+and+glutamate+excess+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 22 (24), 13419(2021).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Mouse spinal brain map. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html">Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html</a> (2023).</li>
<li>Kuhle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+is+associated+with+progression+of+brain+atrophy+and+disability+in+early+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS.</a> Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).</li>
<li>Benkert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light+chain+for+individual+prognostication+of+disease+activity+in+people+with+multiple+sclerosis%3A+A+retrospective+modelling+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study.</a> Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).</li>
<li>D'Souza, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OGR1%2FGPR68+modulates+the+severity+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+regulates+nitric+oxide+production+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages.</a> PLoS One. 11 (2), 0148439(2016).</li>
<li>Imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html">Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html</a> (2023).</li>
<li>Openmicroscopy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads">Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads</a> (2023).</li>
<li>Doroshenko, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+deficiency+in+microglia+results+in+exacerbated+axonal+injury+and+tissue+loss+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 12, 570425(2021).</li>
<li>Soulika, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+progression+of+axonopathy+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).</li>
<li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
</ol>

Shannon Dunn, FSD Lucid Psycheceuticals'a danışmanlık yapıyor.

Omuriliğin histolojik boyanması, özellikle hastalığın akut sonrası fazında hastalığın iyileşme derecesinde tedavi grupları arasında farklılıklar olduğu durumlarda, EAE hastalığının ciddiyetini değerlendirmede önemli bir araçtır. İmmün hücre infiltrasyonu (CD45), miyelin (LFB) ve aksonal hasar (SMI-32) için boyama, farelerde değişen klinik skorların altında yatan nedeni karakterize etmeye yardımcı olur. Burada tarif edilen histolojik boyama protokolü, miyelin ve aksonal hasarın derecesinin yanı sıra inflamasyonun bir perspektifini sağlar. Ayrıca, gösterilen sonuçlar, EAE'deki genel nöronal hasarın derecesini değerlendirmek için bir yöntem olarak sNF-L ölçümünü doğrulamaktadır.
Bu analiz için kritik parametreler, araştırmacıların bölümlerin kimliğine kör olmalarını ve farklı fareler arasında omuriliğin her seviyesinde eşdeğer örnekleme olmasını sağlamaktır. Bunun nedeni, inflamasyonun şiddetinin kordonun daha düşük seviyelerinde daha yüksek olabilmesidir. Bir diğer kritik parametre ise deney gruplarının büyüklüğüdür. Omurilikler ve beyinler, mütevazı etki boyutlarına sahip tedaviler veya genotiplere sahip gruplar arasında önemli farklılıklar görmek için tipik olarak son noktada grup başına 6-8 fareden toplanır. Seçilen farelerin, ortalaması alındığında, tüm grubun temsili ortalama puanlarına sahip olmasını sağlamak da önemlidir. Sorun giderme ile ilgili olarak, protokol konusunda deneyimsiz olanların karşılaştığı yaygın bir sorun, omuriliğin yetersiz bir süre boyunca sabitlenmesi ve omurgadan kolayca ekstrüde edilmemesidir. Bu durumda, omurilik, ince makas kullanılarak dikenli süreçler boyunca kırpılarak ve omuriliği ortaya çıkarmak için kolonu açarak kolondan manuel olarak diseke edilebilir. Alternatif olarak, dokular antikor boyamanın başarısına müdahale etmeden birkaç gün daha sabitlenebilir. Burada tarif edilen antikor klonları, formalin içinde 2 haftaya kadar sabitlenmiş dokuda çalışır.
Omurilik parçalarını gömmek beceri ve pratik gerektirir. Bölümlerin enine kesitte mi yoksa uzunlamasına kesitte mi düştüğünü daha iyi görselleştirmek için göz luplarının takılması ve gömme istasyonunun üzerine bir lamba yönlendirilmesi önerilir. Omurilik parçalarının boylarının brütlenme sırasında 2 mm'den az tutulması, enine kesitte düşmelerine yardımcı olacaktır. Daha az deneyimli kullanıcılar için karşılaşılan bir diğer yaygın sorun, LFB'nin gece boyunca inkübasyon sırasında buharlaşması ve lamın yarısının lekeli ve yarısının lekesiz kalmasıdır. Buharlaşmayı önlemek için, cam boyama kabı termoplastik film ve ardından plastik sargı ile kapatılmalıdır. Buharlaşma meydana gelirse ve bölümler eşit olmayan şekilde lekelenirse, slaytların lityum karbonat ile tamamen maviden arındırılması ve gece boyunca LFB'de tekrar boyanması önerilir. Diğer bir yaygın sorun, kullanıcıların LFB'den sonra gri maddeyi tamamen maviden arındırmamasıdır. Protokoldeki diğer adımlara geçmeden önce yeterli miktarda mavilikten arındırmaya ulaşıldığından emin olmak için mikroskop altında tek tek bölümleri incelemek çok önemlidir. Ek olarak, CD45 ve SMI-32 IHC boyaları sağlam bir performans gösterse de, alınan her yeni antikor lotu için ön deneylerde antikor konsantrasyonlarını kontrol etmek hala önemlidir. Bu, pozitif bir kontrol bölümünde (EAE omuriliği) çeşitli antikor konsantrasyonlarının test edilmesiyle yapılabilir. İlk kez boyama, primer antikor eklenmeden tek başına sekonder antikordan oluşan negatif bir kontrol de içermelidir. Son olarak, slaytlar veya bölümler arasında boyama eşit olmayabileceğinden, görüntü analizinde tek tek görüntülerin eşiklenmesi çok önemlidir.
Bu protokol ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımları kullanır. Bir işlemciye, katıştırıcıya veya mikrotoma erişiminiz yoksa, bu adımlar bu hizmetleri sunan hastane tabanlı bir patoloji çekirdeğine kaynaklanabilir. Ayrıca, bir slayt tarayıcıya erişiminiz yoksa, omurilik veya beyin bölgelerinin TIFF görüntülerini kaydetmek için bir video kamera ile donatılmış bir ışık mikroskobu kullanılabilir. Mikroskop tabanlı bir iş akışı için, LFB veya LFB/H&E kesitlerini düşük güçte (40x büyütme) yakalayın ve CD45 ve SMI-32 boyama için, omuriliğin ventral, dorsal ve lateral kısımlarında ortalanmış en az dört pencereyi görüntüleyin (CD45 için 200x büyütme ve SMI-32 için 400x büyütme). Lekelenmeyi tarif edilene benzer şekilde ölçmek için bu görüntüler üzerinde görüntü analizi yapılabilir.
EAE'yi skorlamak için hangi histolojik yaklaşımın benimseneceği kararı, klinik skorların gruplar arasında ne kadar farklılık gösterdiğine bağlıdır. Örneğin, EAE klinik skorunda ciddi farklılıklar varsa (bir grup EAE aldı ve bir grup almadı), bu genellikle periferik aracılı inflamasyondaki farklılıklarla ilgilidir. Bu durumda, LFB/H&E boyalı kesitlerde demiyelinizan lezyonların varlığı için skorlama yeterlidir ve gruplar arasındaki farklılıkları ortaya koyacaktır. Gruplar başlangıçta klinik skorda daha benzerse ve bunun yerine klinik iyileşme derecesinde farklılıklar varsa (örneğin, Şekil 5A'daki deney), hastalık kronikliğindeki farklılıkların inflamasyon veya doku hasarındaki farklılıklarla ilişkili olup olmadığını ayırt etmek için beyin sapı ve beyincikteki beyin iltihabının skorlanması da dahil olmak üzere burada özetlenen tam histolojik iş akışını uygulamak en iyisidir.  CD45 sayımı ile değerlendirildiği gibi inflamasyondaki farklılıklar bulunursa, T hücreleri (anti-CD3), infiltre eden monosit / makrofajlar (Mac3) ve mikroglia (Iba-1 / TMEM119) için boyama yapmak için daha fazla IHC çalışması yapılabilir (önerilen antikor klonları Ek Tablo 3'tedir). Mikroglia aktivasyonu, çift etiketli Iba-1+TMEM-19+ mikroglia üzerinde Iba-1 boyamanın yoğunluğundaki bir artış ve bölüm32'de Sholl analizi ile değerlendirilebilen mikroglia süreçlerinin artan geri çekilmesi ile yansıtılır. Ayrıca, beyin ve omurilikteki bağışıklık popülasyonlarının sıklığı ve fenotipinin daha derin bir karakterizasyonunu yapmak için akış sitometrisi veya tek hücreli RNA dizilimi gibi teknikler uygulanabilir.
SMI-32+ aksonlarının sayımı, EAE 32,33 ve MS34'te akson hasarını tespit etmek için hassas bir yöntemdir. SMI-32, kesilen nörofilamentlerin uç ampullerinde biriken ağır veya orta fosforile olmayan nörofilament formunu tespit eder. Yaralı aksonları tespit etmenin bir alternatifi, akson taşınmasının bozulmasının bir sonucu olarak aksonlarda birikebilen amiloid öncü proteini (APP) ile boyamadır33. SMI-32 ve APP için boyama paterni, her ikisi de akson hasarını yansıtsa da, tipik olarak örtüşmez, bu da farklı patolojileri tespit ettiklerini gösterir33. Hem omurilikte hem de beyinde devam eden aksonal hasarın hızlı ve hassas bir ölçüsü olan sNF-L'yi ölçerek akson hasarının histolojik ölçümleri de tamamlanabilir. Canlı farelerde yarım günde yapılabilmesi avantajını sunar. Bu yöntemin bir dezavantajı, kitlerin pahalı olması ve makinenin oldukça uzmanlaşmış olmasıdır. sNF-L kitini satan şirket, SIMOA makinesine erişimi olmayanlar için servis ücreti sunuyor. Akson hasarını değerlendirmenin bir alternatifi, omuriliğin12 toluidin mavisi lekeli bölümlerindeki aksonları sayarak veya omurilik beyaz cevheri32 alanlarında SMI-31 tarafından tespit edilen nörofilament demetlerini sayarak akson kaybını puanlamaktır. Bunların her ikisi de SMI-32 veya sNF-L ölçümünden daha zahmetli yaklaşımlardır.
EAE klinik skorları gruplar arasında farklılık gösteriyorsa, ancak inflamasyon, demiyelinizasyon ve aksonal hasar için skorlama gruplar arasında farklılıklar ortaya koymuyorsa, GFAP kullanarak astrosit aktivasyonu için boyama yapmak yararlı olabilir (önerilen antikor klonu için Ek Tablo 3'e bakınız). Astrosit aktivasyonu, GFAP boyamasında bir artış ile ilişkilidir ve bunun, DA sıçanındaki kronik EAE dahil olmak üzere bazı EAE modellerinde EAE ilerlemesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir35.
Sonuç olarak, bu protokol EAE'nin histolojik skorlamasını yapmak için yöntemleri açıklar ve bir analiz iş akışı sağlar.

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan demiyelinizan hastalığı Multipl Skleroz (MS) için en yaygın fare modelidir1. IFN-γ (gama) ve IL-17 üreten T yardımcı hücrelerinin2 infiltrasyonu, inflamatuar monositlerin3 infiltrasyonu, perivasküler ve submeningeal inflamatuar demiyelinizan lezyonların4 oluşumu ve merkezi sinir sisteminde (MSS) akson hasarı4 oluşumunu içeren klasik MS inflamatuar patolojisi de EAE 5,6,7,8,9'da gözlenir. EAE ve MS arasındaki immün mekanizmalardaki benzerlik, EAE'yi MS için natalizumab, fingolimod, dimetil fumarat ve glatiramer asetat dahil olmak üzere bir dizi onaylanmış immün temelli tedavinin etkinliğini ve etki mekanizmalarını test etmek için uygun bir klinik öncesi model haline getirmiştir (1,5'te gözden geçirilmiştir). Bazı EAE rejimleri, beyinde submeningeal inflamasyon, kronik demiyelinizasyon, omurilik atrofisi, sinaps ve nöron kaybıdahil olmak üzere aksonal hasarın ötesinde ilerleyici MS patolojisinin diğer yönlerini modellemektedir 6,10,11,12. Bu nedenle, EAE, MS için nöroprotektif tedavilerin etkinliğini taramak için faydalıdır.
EAE, kemirgenlerde çeşitli şekillerde indüklenir. Aktif bağışıklama en yaygın indüksiyon yöntemidir ve kemirgenlerin ısıyla öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis13 ile desteklenmiş CFA'da emülsifiye edilmiş miyelin antijenleri (tam proteinler veya peptitler) ile aşılanmasını içerir. Farenin türüne bağlı olarak, boğmaca toksini (PTX), hastalığın penetransını artırmak için aşılamanın 0. ve 2. gününde de uygulanır13. EAE ayrıca, miyelin / CFA primli farelerden elde edilen miyelin spesifik T hücrelerinin sağlıklı farelere14 evlat edinilerek aktarılmasıyla indüklenebilir veya ana miyelin antijenlerine özgü T hücresi reseptörlerini aşırı eksprese eden farelerde kendiliğinden gelişebilir5.
EAE hastalığının şiddeti ve ilerlemesi genellikle ayrı bir 5 puanlık klinik ölçek kullanılarak puanlanır: 1 – kuyruk gevşekliği, 2 – arka bacak veya ayak güçsüzlüğü, 3 – bir veya her iki arka bacakta tam felç, 4 – ön ayak zayıflığı, 5 – can çekişen veya ölü13. Bu klinik skorlama sistemi, hastalık başlangıcında ortaya çıkan artan felcin ilerlemesini belgelemede sağlamdır, ancak CNS inflamatuar ataklarından iyileşme derecesini yakalamada daha az hassastır. Örneğin, hem zorlukla yürüyen farelere hem de kolayca yürüyen ancak ayak kavrama zayıflığı sergileyen farelere EAE ölçeğinde 2 puan verilir. Kalıcı akson hasarı veya kaybının varlığına bağlı olarak, enflamatuar yanıtın çözülmesine rağmen EAE'nin akut sonrası fazında skorlar yüksek kalabilir9. EAE 9,16,17,18'de klinik eksikliklerdeki farklılıkları daha iyi yakalamak için daha rafine skorlama sistemleri, davranış testleri, arka bacak ve kavrama gücü ölçümleri ve kızılötesi izleme sistemleri geliştirmeye yönelik çeşitli girişimlerde bulunulmuştur; Bununla birlikte, bu daha karmaşık skorlama ölçümleri, altta yatan nörolojik defisitlere karşı doku hasarına karşı inflamasyonun katkısını ayırt etmemektedir. Bu nedenle, EAE'nin şiddetini skorlamak için altın standart yaklaşım hem klinik hem de histolojik skorlama yapmaktır.
Burada, fare omuriliği ve beyin örneklerinin, EAE'de meydana gelen stokastik lezyon oluşumu sürecini yakalayacak şekilde parafine nasıl kesileceği ve gömüleceği için bir protokol açıklanmaktadır. Orijinal olarak Kluver ve Barrera19 tarafından oluşturulan ve CNS'deki miyelini tespit eden Luxol fast blue (LFB) ile bölümlerin nasıl boyanacağına dair bir protokol de sunulmaktadır. Kesitler ya tek başına LFB ile boyanır (demiyelinizasyon analizi için) ya da enflamatuar lezyonları görselleştirmeye ve skorlamaya yardımcı olmak için hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyanır. Ticari olarak temin edilebilen antikorlar, immünohistokimyasal (IHC) teknikler ve halka açık yazılımlar kullanılarak omurilikteki toplam lökositlerin (CD45), miyelin kaybını ve yaralı akson sayısını (SMI-32) ölçmek için protokoller de sağlanmıştır. Omurilikteki lökositleri ölçmek için kullanılan protokol, beyindeki lökositleri ölçmek için de uygulanabilir.
Beyindeki aksonal kayıp ve hasarın histolojik değerlendirmesi, beyin beyaz cevher yolları birbirine paralel çalışmadığı için omurilikten nispeten daha zordur. Serum nörofilament ışığının (sNF-L) ölçümü, MS20,21'de nöronal hasar için umut verici bir biyobelirteç olarak ortaya çıkmıştır. Son çalışmalar bu teknolojiyi EAE 22,23,24'e genişletmiştir. Burada, bir Küçük Molekül Testi (SIMOA) testi kullanılarak canlı farelerde serum nörofilament ışığını (sNF-L) ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem sadece az miktarda serum gerektirir ve canlı farelerde sadece yarım gün içinde yapılabilir ve test edilen bir tedavinin genel CNS hasarını nasıl etkilediğine dair hızlı geri bildirim sağlar. Burada açıklanan yöntemlerin tümü, herhangi bir cinsiyet veya suştaki farelere uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>%10 Nötr Tamponlu Formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Omurilik ve beyin örneklerini sabitlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>1000 mL Cam Beher</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tube</td><td>Starstedt</td><td>62.554.100</td><td>Omurilik ve beynin sabitlenmesi ve saklanması</td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer Şişesi</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Cam Beher</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td></td></tr><tr><td>92 mm x 16 mm Petri Kapları</td><td>Starstedt</td><td>82-1473-001</td><td>Doku brütleştirme işleminde kullanılır</td></tr><tr><td>%95 Etil Alkol</td><td>Ticari Alkoller</td><td></td><td>P016EA95 Dehidrasyon ve rehidrasyon adımları</td></tr><tr><td>ABC Elite Kit</td><td>Vektör Labratories</td><td>PK6100</td><td>İmmünohistokimya etiketlemesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Aqua Hold 2 PAP Pen</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-75955-53</td><td>İmmünohistokimyasal Boyamada doku kesitlerinin etrafını çizmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Avidin / Biotin Engelleme Kiti</td><td>Vektör Labratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik Kabini</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş tavşan sıçan önleyici IgG</td><td>Vektör Labratories</td><td>BA-4000</td><td>CD45 boyama için kullanılır</td></tr><tr><td>C57BL6 / J Fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Stok # 664</td><td>Bu fareler deneylerde kullanıldı kağıt olarak gösterilmiştir.</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST Plus</td><td></td></tr><tr><td>CitriSolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-121</td><td>Mum giderme için kullanılır. Ksilen DAB Kitine bir alternatiftir</td></tr><tr><td></td><td>Vektör Labratories</td><td>SK-4100</td><td>İmmünohistokimyada geliştirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>ddH2O</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tek Kullanımlık Neşter</td><td>Magna</td><td>M92-10</td><td>Omurilik ve beyin iğrençliği için kullanılır</td></tr><tr><td>DWK Yaşam Bilimleri (Wheaton) cam boyama kabı</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-48585-60</td><td>Histokimyasal boyama ve yıkamalar için kullanılır</td></tr><tr><td>DWK Yaşam Bilimleri (Wheaton) cam boyama rafı</td><td>Cole Parmer</td><td>10061392</td><td>İmmünohistokimya ve histokimya için kullanılır</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Bioshop</td><td>173772-87-1</td><td>Sitoplazma</td></tr> lekeleri <tr><td>Tüy Mikrotom Bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-634-1C</td><td>Parafin Filtre</td></tr><tr><td>Kağıdı</td> ayırmak için kullanılır <td>Whatman</td><td>1001110</td><td>Formalini filtrelemek için kullanılır (brütleştirme sırasında) ve luxol hızlı mavi</td></tr><tr><td>İnce Cerrahi Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14160-10</td><td>Beyin ve kafatasını kesmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Dumanlık</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190944</td><td></td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>BioShop</td><td>ACE333.4</td><td>Luxol hızlı mavi boyama prosedüründe kullanılır</td></tr><tr><td>Histoplex Histoloji Kapları</td><td>Starplex Bilimsel</td><td>565-060-26</td><td>Omurilik ve beynin sabitlenmesi</td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit</td><td>Fisher Chemicals</td><td>H325-500</td><td>Dokudaki endojen peroksidazın giderilmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td>İmmünohistokimya için kullanılır</td></tr><tr><td>Lens kağıdı</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>İşleme sırasında omurilik türlerini kasette yakalamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lityum karbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>554-13-3</td><td>Luxol hızlı mavi boyamadan sonra maviden arındırma</td></tr><tr><td>Luxol mavisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1328-51-4</td><td>Lekeler CNS miyelin</td></tr><tr><td>MOM İmmünotespit Kiti</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>BMK-2202</td><td>için kullanılır leke SMI-32</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A454.2</td><td>Fiksasyon için kullanılır</td></tr><tr><td>Mayer'in Hematoksilen</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>26381-02</td><td>Dişlerle</td></tr><tr><td>Çekirdek Mikro-Adson Forseps</td><td>Lekeleri İnce Bilim Araçları</td><td>11027-12</td><td>Diseksiyonlar sırasında kafatasını yansıtmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Microvette Kılcal Borular CB 300 Z</td><td>Starstedt</td><td>16.440.100</td><td>Kan alımı için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak Camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545A</td><td>Lamel kayma için kullanılır</td></tr><tr><td>Mini Çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>12620-938</td><td>Tampon yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>NF ışık kiti</td><td>Quanterix</td><td>103186</td><td>Bu kit, serumda fare veya insanda çözünür nörofilamentin tespiti için kullanılabilir</td></tr><tr><td>Nitril Eldivenler</td><td>VWR</td><td>76307-462</td><td>Güvenlik</td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Vektör Labratories</td><td>S-1000</td><td>Bloke edici reaktif</td></tr><tr><td>Normal Tavşan Serumu Vektör</td><td>Labratories</td><td>S-5000</td><td>Bloke edici reaktif</td></tr><tr><td>OmniSette Doku Kasetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4935FS</td><td>Omurilik ve beyin gömmek için kullanılır</td></tr><tr><td>p1000 Pipet ve Uçlar</td><td>çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipet ve Uçlar</td><td>çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafin Gömme istasyonu</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Doku Sızma/Gömme Ortamı</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>Omurilik ve beyin gömmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Permount Montajı Orta Fisher</td><td>Chemicals</td><td>SP15-100</td><td>Lamellerin slaytlara montajı için kullanılır</td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Fisher Scientific</td><td>13636AB315B</td><td>pH tamponları için kullanılır</td></tr><tr><td>Plastik Transfer Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>pH tamponları için kullanılır</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>BioShop</td><td>7447-40-7</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik</td> <td>yapmak için kullanılırBioShop</td><td>7778-77-0</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Düdüklü Tencere</td> yapımında kullanılır <td>Nordic Ware</td><td>İhale Ocak</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış sıçan anti-fare CD45</td><td>Vektör Labratories</td><td>553076</td><td>Lökositleri algılar</td></tr><tr><td>Reaktif sınıfı alkol% 100</td> <td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Dehidrasyon ve rehidrasyon adımları</td></tr><tr><td>Reaktif sınıfı alkol% 70</td> <td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>Dehidrasyon ve rehidrasyon adımları</td></tr><tr><td>Döner Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Makinesi</td><td>Quanterix</td><td>HD-X</td><td></td></tr><tr><td>Slayt Tarayıcı</td><td>Zeiss</td><td>AxioScan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32 fare IgG1 antikoru</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td>Hasarlı aksonları algılar</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td>PBS yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Standart Adson Forseps</td> yapmak için kullanılır <td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11150-10</td><td>Diseksiyon adımları için kullanılır</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Bölümleri toplamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Cerrahi Sert Kesimler</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14110-15</td><td>Omurgayı, vücut duvarını ve cildi kesmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Doku İşlemcisi</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Tri-soldium sitrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-04-6132</td><td>Antijen alımı için kullanılır</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioBasic</td><td>9005-64-5</td><td>Bölümleri yıkamak için kullanılır</td></tr><tr><td>X-P Pierce XP-100 plaka contası</td><td>Excel Scientific</td><td>12-140</td><td>sNF-L Testi için kullanılır</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher Kimyasalları</td><td>1330-20-7</td><td>Mumdan arındırma ve bölümleri temizleme için kullanılır</td></tr><tr><td>Huni</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-63100-64</td><td>Dokuyu brütleştirmeden önce formalini filtrelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Karıştırma Plakası</td><td>Herhangi Çözelti</td><td></td><td>yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Herhangi Kestikten</td><td></td><td>sonra doku bölümlerini pişirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td>LFB boyama kabını kapatmak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>Mikrodalga Herhangi</td><td></td><td>Zamanlama mikrodalga modeline bağlı olarak değişebilir</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Bloke edici tampon yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408--129</td><td>Fare serum örneklerini saklamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>Herhangi</td><td></td><td>sNF-L testi için numune hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Herhangi</td><td></td><td>sNF-L testi için enzim substratını ısıtmak için kullanılır</td></tr></tbody></table>

deneysel otoimmün ensefalomiyelitte merkezi sinir sistemi İnflamasyonu, demiyelinizasyon ve akson hasarının skorlanması

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl sklerozun (MS) yaygın immün temelli bir modelidir. Bu hastalık kemirgenlerde, miyelin kılıfının protein bileşenleri ve Tam Freund adjuvanı (CFA) ile aktif bağışıklama yoluyla veya miyelin proteini / CFA ile hazırlanmış kemirgenlerden miyelin spesifik T efektör hücrelerinin saf kemirgenlere aktarılmasıyla indüklenebilir. EAE'nin şiddeti tipik olarak artan felç derecesini ölçen 5 puanlık bir klinik ölçekte puanlanır, ancak bu ölçek EAE'den iyileşme derecesini değerlendirmek için uygun değildir. Örneğin, inflamasyonun çözülmesine rağmen bazı EAE modellerinde (örneğin, miyelin oligodendrosit glikoprotein [MOG] peptit kaynaklı EAE modeli) klinik puanlar yüksek kalmaktadır. Bu nedenle, klinik skorlamayı, merkezi sinir sisteminde (MSS) hücresel hasarın altında yatan mekanizmaları incelemek için bir araç sağlayan EAE'nin histolojik skorlaması ile tamamlamak önemlidir.
Burada, farelerden omurilik ve beyin kesitlerini hazırlamak ve boyamak ve omurilikte inflamasyon, demiyelinizasyon ve aksonal hasarı puanlamak için basit bir protokol sunulmaktadır. Omurilikte lökosit infiltrasyonunu skorlama yöntemi, EAE'de beyin inflamasyonunu skorlamak için de uygulanabilir. Canlı farelerde genel CNS hasarının derecesi hakkında geri bildirim sağlayan bir Küçük Molekül Testi (SIMOA) testi kullanılarak farelerin serumundaki çözünür nörofilament ışığını (sNF-L) ölçmek için bir protokol de açıklanmaktadır.

Şekil 3, hem akut (solda) hem de daha eski EAE lezyonlarının (sağda) örnekleriyle temsili IHC ve histokimyasal boyamayı göstermektedir. Hematoksilen karşı boyama ile temsili CD45 boyaması Şekil 3A, B'de gösterilmiştir.  Şekil 3C-F, H&amp;E karşı boyası ile (Şekil 3C,D) veya H&amp;E karşı boyası olmadan (Şekil 3E,F) LFB boyama örneklerini göstermektedir. Hematoksilen bağışıklık hücrelerine özgü olmasa da, bağışıklık hücrelerinin çekirdekleri daha koyu renkte boyanır ve CNS yerleşik hücrelerinden ayırt edilebilir. Şekil 3G, H, hematoksilen ile karşı boyanmış SMI-32+ aksonlarının temsili boyanmasını göstermektedir. Eski EAE lezyonlarında bu lekenin artmış görünümüne dikkat edin.
Miyelinli izlerin hasarı, aktif murin EAE'de omurilikte en sık görülür ve bu, bu hastalıkta felcin ana itici gücüdür 7,9. Bu nedenle, histolojik analizlerde omurilikte inflamasyon ve doku hasarı varlığına yönelik skorlama önceliklendirilir. EAE lezyonları sporadik olarak omuriliğin farklı bölgelerinde (anterior, lateral veya dorsal) (Şekil 2A,B) ve farklı seviyelerde (sakral, lomber, torasik, servikal) ortaya çıkar. Tarif edilen gömme yöntemi, kord boyunca lezyonların iyi örneklenmesini sağlar. Analiz edilenden daha fazla bölüm gömülür, çünkü bazı bölümler işleme veya bölümleme sürecinde zarar görebilir. Temsili örneklemeyi sağlamak için, her fare için omuriliğin servikal, torasik ve lomber seviyelerinde en az 3 temsili bölüm analiz edilir. Analizi yapan kişinin analiz için temsili bölümleri seçerken önyargılı olmaması için her numunenin kimliği kör edilir.
EAE'nin histolojik şiddetindeki farklılıklar hakkında hızlı bir fikir edinmek için, seçilmiş kesitlerde spinal kord kadranlarında submeningeal demiyelinizan lezyonların varlığı için skorlama yapılabilir (Şekil 2A,B). Bu, taranan görüntüler üzerinde veya ışık mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilebilen hızlı bir yöntemdir. Bu analiz, EAE bir grupta şiddetli ve diğerinde hafif olduğunda, gruplar arasındaki histolojik EAE şiddetindeki farklılıkları tespit edecek kadar duyarlıdır. Örneğin, Şekil 4'teki deneyde, EAE, MOG p35-55 / CFA artı PTX kullanılarak dişi vahşi tipte (WT) ve OGR1'de (OGR1 KO) bir delesyona sahip farelerde indüklendi. WT grubundaki fareler tam felçli şiddetli EAE geliştirirken, OGR1 nakavt grubu hafif hastalık geliştirdi. Klinik skordaki bu fark, submeningeal lezyonları olan kadranların fraksiyonundaki bir farka karşılık geldi (Şekil 4C).
Otoimmün atak sırasında miyelin ve/veya miyelinli akson kaybının derecesini yakalamak için demiyelinizan lezyonların skorlamasını miyelin boyamanın yüzde alan fraksiyonu ile tamamlamak önemlidir. Şekil 4'teki örnekte, yüzde miyelin fraksiyonu da OGR1 ve WT fareleri arasında önemli ölçüde farklılık göstermiştir (Şekil 4D). Yüzde miyelin fraksiyonu, EAE'li farelerde kümülatif EAE skoru ile de önemli ölçüde ilişkilidir (Şekil 4E) ve bu nedenle bu hastalıkta genel doku hasarının iyi bir ölçüsü olarak hizmet eder. Bu protokolün miyelin lekesinin yoğunluğunu ayırt etmediğini unutmayın. İstenen sonuç buysa, proteolipid proteini veya miyelin bazik proteini gibi miyelin proteinleri için immünofloresan boyama yapılmalı ve bu boyamanın yoğunluğu ölçülmelidir.
EAE'nin her iki karşılaştırıcı grupta da şiddetli olduğu durumlarda, omurilik kadranlarının daha yüksek bir fraksiyonu inflamatuar/demiyelinizan lezyonlar içerecektir. Bu durumda, inflamasyonu puanlamak için daha hassas bir yaklaşım,mm2 beyaz cevher başına CD45+ lökosit sayısını saymaktır (bkz. Şekil 3A'daki temsili boyama). Burada tarif edilen CD45 antikor klonu, sızan tüm lökositleri tespit eder ve sadece EAE'de CD45 ekspresyonunu yukarı regüle eden ara sıra mikrogliaları boyar (Şekil 3B'deki açık oka bakınız) ve bu nedenle periferik immün hücre infiltrasyonunu yakalamada yararlıdır.
Daha uzun süreli EAE çalışmalarında (&gt;20 gün), akson yaralanması analizinin de yapılması önerilir. Omurilik kesitlerinde SMI-32 boyama, hasarlı aksonları tespit etmek için hassas bir yöntemdir. Omurilikteki inflamasyon zamanla azalsa ve korunan aksonlar yeniden miyelin yapabilse de, hayatta kalan aksonlar diferansiyel bir rezidüel yaralanmaderecesi sergiler 9 (Şekil 3G, H). Örneğin, C57BL6 / J farelerinde MOG p35-55 ile indüklenen EAE modelinde, aksonal yaralanma ve kaybın derecesi, enflamatuar süreç azaldıktan sonra klinik puanların bir itici gücüdür9. Şekil 5 , erkek ve dişi farelerde, WT farelerinde ve miyeloid bölmede (LysMCre: Ppardfl/fl) peroksizom proliferatörle aktive olan reseptör-delta (PPAR-delta) adı verilen bir gende eksik olan farelerde yapılan bir EAE deneyinde bunun bir örneğini göstermektedir. Erkeklerde, WT fareleri arka bacak fonksiyonunu geri kazandı, ancak klinik puanlar erkek LysMCre: Ppardfl / fl grubunda yüksek kaldı. Buna karşılık, kadınlarda yapılan deneyde, her iki deney grubu da yüksek puanlara sahipti. İlk bakışta, bu sonuç PPAR-delta'nın EAE'de cinsiyete özgü bir etkiye sahip olduğunu düşündürdü; bununla birlikte, omuriliğin patolojik skorlaması, LysMCre: Ppardfl / fl grubundaki her iki cinsiyetten farelerin WT muadillerine kıyasla aksonal yaralanmayı artırdığını ortaya koydu (Şekil 5B). Kadınlarda klinik skorlar üzerinde bir genotip etkisi gözlenmemiştir, çünkü WT dişi fareler, kronik nörolojik defisitlere dönüşen artmış aksonal hasar sergileme eğilimindeydi.
Aynı deneyde, dişi LysMCre: Ppardfl / fl dişi farelerin beyincikte daha kapsamlı T hücresi infiltrasyonuna sahip olduğu bulundu ve bu da beyin iltihabının EAE'de nasıl yararlı olabileceğine dair bir örnek sağladı. EAE'de, beyindeki inflamasyon ağırlıklı olarak beyincik ve beyin sapında bulunur (Şekil 6A, D, G), ancak aynı zamanda meninkslerde ( Şekil 6C'de hipokampus altında görülür), ventriküllerin yakınında (Şekil 6F) ve optik sinir ve korpus kollozum dahil olmak üzere diğer beyaz cevher yollarında da bulunabilir (Şekil 6B, E). Beyin iltihabının skorlanması, omurilik protokolü için ana hatlarıyla belirtilen aynı metodolojiyi kullanarakmm2 doku bölgesi başına CD45 hücrelerinin sayısını sayarak belirli bir beyin bölgesinde (örneğin, serebellar beyaz cevher) yapılır. Burada özetlenen brütleştirme yönteminde, beyinciğin ortasında, Şekil 6A'da gösterildiği gibi beyincik ve beyin sapının perspektifini sağlayan bir kesik vardır.
Bir SIMOA testi kullanılarak sNF-L'nin ölçülmesi, devam eden aksonal yaralanmayı ve relapsing-remitting MS20,21,27,28'de tedaviye yanıtları değerlendirmek için yararlı bir biyobelirteç haline gelmiştir. sNF-L insanlarını ölçmek için kullanılan aynı SIMOA test kiti, fare sNFL 22,23,24'ü ölçmek için uygulanabilir. Bu testin EAE'de aksonal hasarı tespit etmede ne kadar iyi performans gösterdiğini araştırmak için, bir EAE deneyinin son noktasında dişi C57BL6 / J farelerinde sNF-L ölçüldü ve seviyeler, EAE'si olmayan cinsiyet uyumlu sağlıklı kontrol farelerindekilerle karşılaştırıldı. EAE'li farelerin sağlıklı farelere göre çok daha yüksek sNF-L seviyelerine sahip olduğu bulunmuştur (Şekil 7A) ve bu seviyeler omurilikteki SMI-32+ aksonlarının yoğunluğu ile ilişkilidir (Şekil 7B). Aksonal hasarın histolojik skorlaması ile karşılaştırıldığında, SIMOA testi daha hızlıdır (kanamalı farelerden sonuçlara yarım günden biraz fazla bir sürede ulaşılabilir) ve bu nedenle canlı farelerde bir tedavinin nasıl çalıştığına dair hızlı geri bildirim sağlar. Bu tahlil aynı zamanda hem omurilikte hem de beyinde aksonal hasarı yansıtma avantajına sahiptir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig01.jpg"> Şekil 1: Beyin ve omurilik bölümlerinin temsili parafin bloğu. 5 koronal beyin bölümü ve omurilik kesiti (1,5-2 mm kalınlığında) tek bir bölümde kesilebilmeleri için aynı bloğa gömülür. Omuriliğin en az 15 bölümü gömülmeli ve analiz için yeterli bölüm seçimine izin verilmelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig02.jpg"> Şekil 2: Torasik omurilik seviyesinde meningeal inflamasyon ve yüzde miyelin alanı puanlaması. (A,B), LFB/H&amp;E ile boyanmış MOG p35-55 ile indüklenen EAE'li bir dişi C57BL6/J faresinden torasik omuriliğin görüntülerini gösterir. A'daki fare, birleşik demiyelinizan lezyonlara sahip 4 kadrandan 4'üne sahipken, B'deki fare, etkilenen 4 kadrandan 1'ine sahiptir. B'deki farenin diğer kadranlarda bir miktar iltihaplanma vardır, ancak bu birleşik bir lezyona dönüşmemiştir ve bu nedenle puanlanmamıştır. (C-E) LFB görüntüsü örneği ve imageJ'deki gri tonlamalı ve eşikli görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig03.jpg"> Şekil 3: CD45, LFB H&amp;E, LFB ve SMI-32 ile boyanmış omurilik kesitleri. Omurilikte erken (A,C,E,G) ve geç (B,D,F,H) submeningeal lezyon örnekleri, CD45 antikoru (A,B), LFB/H&amp;E (C,D), tek başına LFB (E,F) ve SMI-32 antikoru (G,H) için boyanmıştır. Siyah oklar, her bir antikorla boyanmış hücre örneklerini gösterir. Beyaz oklar, CD45 + olarak boyanmış varsayılan mikrogliaları gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şekil, EAE sırasında dişi bir C57BL6 / J faresinin omuriliğindeki lezyonların temsili boyanmasını gösterir ve patolojinin farklı omurilik bölümlerinde nasıl farklı olabileceğini vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig04v2.jpg"> Şekil 4: EAE'de lezyonlar ve demiyelinizasyon yüzdesi için skorlama uygulaması. Yumurtalık kanseri G-proteinine bağlı reseptör 1 (OGR1) geninde eksik olan dişi farelerin, C57BL6 / J arka planındaki vahşi tip (WT) dişi C57BL6 / J farelerinden daha az şiddetli klinik EAE geliştirdiği bir EAE deneyi örneği gösterilmiştir. EAE, MOG p35-55 / CFA artı PTX ile aşılama ile indüklendi ve fareler aşağıdaki klinik ölçeğe göre puanlandı: 1 = kuyruk felci. 2 = arka bacak ve ayak zayıflığı, 3 = arka bacak felci, 4 = ön bacak zayıflığı, 5 = can çekişiyor. (A) Farelerin zaman içindeki ortalama + SEM klinik puanları. (B) Ventral omurilikte LFB/H&amp;E boyamasına bir örnek gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Demiyelinizan lezyonlar içeren ortalama + SEM yüzde kadranları. (D) Her grupta ortalama + SEM yüzde demiyelinizasyonu. (E), C57BL6 / J farelerinde MOG p35-55 ile indüklenen EAE'de yapılan başka bir deneyin sonucunu gösterir, burada bireysel farelerin EAE skorları 30 günlük gözlem boyunca toplandı ve omurilikteki demiyelinizasyon yüzdesi ile ilişkilendirildi. Korelasyonlar Spearman testi kullanılarak yapıldı. (A–D)'deki paneller Souza C ve ark.29'dan uyarlanmıştır. (E)'deki veriler orijinal verilerdir. *P&lt;0.05, **P&lt;0.01, ***P&lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig04largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig05.jpg"> Şekil 5: Bir genotipin klinik EAE fenotipi üzerindeki etkisini anlamak için SMI-32 boyamanın uygulanması. Bu şekil, C57BL6 / J arka planındaki erkek ve dişi vahşi tip ( Ppard'ın floxed alelini taşır) ve miyeloid spesifik Ppard mutant farelerinin (LysMCre: Ppardfl / fl) MOG p35-55 / CFA ve PTX ile aşılandığı ve 45 gün boyunca takip edildiği bir EAE deneyinin bir örneğini göstermektedir. (A) farelerin ortalama + SEM klinik skorlarını gösterir. (B) omurilikteki SMI-32+ akson sayısının, submeningeal lezyonlarla% kadranların, perivasküler manşetlerle yüzde kadranların ve serebellumdaki #CD3 lezyonların histolojik skorlamasının ortalama + SEM sonuçlarını mm2 doku başına gösterir. Bu deney, SMI-32 boyaması üzerinde bir genotip etkisi göstermiştir. Bu rakam Drohomyrecky'den uyarlanmıştır. vd.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig06.jpg"> Şekil 6: Dişi C57BL6/J farelerinde MOG p35-55 ile indüklenen EAE'de beyin koronal kesitlerinde CD45+/hematoksilen boyama örnekleri. CD45+ lezyonları kahverengi renkte gösterilmiştir. (A) Koronal bölümlerin beyin sapındaki CD45+ lezyonları. Ölçek çubuğu = 150 μm. (B-G) Optik sinirlerde (B), hipokampus (C) altındaki meningeal uzantılarda, beyin sapında (D), korpus kollozumda (E), ventrikül yakınında medial habenula (F) ve beyincikte (G) CD45+ lezyon örnekleri.  Ölçek çubuğu: (B–G) = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig07v2.jpg"> Şekil 7: MOG p35-55 ile indüklenen EAE'de serumdaki sNF-L seviyeleri. (A) Bir deneyin son noktasında dişi kontrol ve EAE farelerinden toplanan serum NFL seviyeleri. Veriler iki kuyruklu Mann Whitney testi kullanılarak analiz edildi. (****p değeri &lt; 0,0001). (B) Omurilik kesitleri son noktada çıkarıldı ve SMI-32 ile boyandı. Beyaz cevher doku alanı başına pozitif hücre sayısı belirlendi ve bir Spearman testi kullanılarak sonlanımda serum NF-L ile ilişkilendirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig07largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Doku işlemede kullanılan banyoların tanımı. Kasetler, otomatik bir işlemci kullanılarak bu banyo serilerinde otomatik olarak hareket ettirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/JOVESupplementaryTable1.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 2: Luxol Fast Blue ve Hematoksilen ve Eozin boyama adımları. Bu tablo, Luxol Fast Blue ve Hematoksilen ve Eozin boyama protokolündeki adımların sırasını özetlemektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/JOVESupplementaryTable2.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 3: İmmünohistokimyasal boyama için kullanılan antikorlar. Bu protokolde kullanılan antikorların yanı sıra inflamasyon, mikrogliozis ve astrogliozu daha fazla araştırmak için kullanılabilecek antikorlar tarif edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/SupplementaryJOVETable3_Revised(1).zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 4: .czi dosyasını TIFF dosyalarına dönüştürme. Yüksek çözünürlüklü bir görüntü kullanmanın en uygun olduğunu, ancak bilgisayarın çalışma belleği sınırlanıyorsa bunun yerine orta çözünürlüklü görüntülerin kaydedilebileceğini unutmayın. Analizlerde aynı çözünürlükte görüntülerin kullanılması zorunludur. Ayrıca, serinin son görüntüsünün slayt etiketi olduğunu unutmayın. Analizin kör olduğundan emin olmak için etiketi okumaktan kaçının. 30,31 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/SupplementaryJOVETable4.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl sklerozun bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Bu makalede EAE'de spinal kord inflamasyonu, demiyelinizasyon ve aksonal yaralanmayı skorlamaya yönelik bir yaklaşım anlatılmaktadır. Ek olarak, canlı farelerde aksonal hasarın değerlendirilmesini kolaylaştıran, fare serumundaki çözünür nörofilament ışık seviyelerini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitte Merkezi Sinir Sistemi İnflamasyonu, Demiyelinizasyon ve Akson Hasarının Skorlanması

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

Otoimmünite ve multipl skleroz veya MS'in nasıl başladığını anlamakla ilgileniyoruz. Bu araştırma, MS ile ilişkili risk faktörlerini incelemek için çeşitli yaklaşımlar kullanmaktadır. Otoimmünitenin gelişmesine yol açar. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit veya EAE, çeşitli risk faktörlerinin otoimmünite üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilen bir fare MS modelidir.Son zamanlarda, bir MS risk faktörü obezitesinin farelerde otoimmün inflamasyonun artmasına nasıl yol açtığının biyolojik yolunu keşfettik. EAE modelindeki çalışmalar, bu mekanizmaları çözmek için kritik öneme sahipti. EAE hastalığının şiddeti genellikle beş puanlık bir klinik ölçekte puanlanır.Bununla birlikte, bu ölçeğin duyarlılığı sınırlıdır ve klinik eksikliklerin inflamasyondan mı yoksa doku hasarından mı kaynaklandığını ayırt edemez. Omurilik ve beyin histolojisi, EAE'de inflamasyon ve doku hasarını değerlendirmek için altın standart yöntemdir. Bu protokol, EAE sırasında omurilik ve beyindeki inflamasyonu ve doku hasarını ölçmek için basit bir yöntem sağlar.Protokolümüz, EAE'nin şiddetini daha iyi karakterize etmek için klinik ölçekle birlikte kullanılabilir. Protokolümüz, immün infiltrasyon, demiyelinizasyon, omurilikte aksonal hasar ve beyin inflamasyonu dahil olmak üzere EAE'nin temel histolojik özelliklerini ölçer. Ayrıca, fare serumundaki nörofilament ışığının ölçülmesini de içerir, bu da CNS hasarının derecesini gösterir.Bu kapsamlı protokol, EAE'nin tek bir işaretleyici kullanmaktan daha ayrıntılı bir karakterizasyonunu sağlar.

scoring-central-nervous-system-inflammation-demyelination-axon-injury

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

DA sıçanlarda kronik relapsing deneysel otoimmün ensefalomyelit: Bu video, multipl skleroz bir hayvan modeli indüksiyonu ve klinik skorlama göstermektedir. Tüm sıçan omurilik ve tam Freund adjuvan içeren bir emülsiyon immunizing fareler tarafından uyarılan hastalık, insan hastalığına benzer klinik belirtiler sunar.

İndüksiyon ve Kronik Relaps Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Klinik Puanlama

Bu video, beyne göç eden otoreaktif T hücrelerini aktive etmek için miyelin türevi peptitleri bir adjuvan ile enjekte ederek deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indükleme yöntemini göstermektedir. Boğmaca toksini, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için uygulanır ve bu T hücrelerinin ve diğer bağışıklık hücrelerinin beyne girmesine izin verir. Bu bağışıklık hücreleri demiyelinizasyona neden olarak sinir iletiminin bozulmasına ve EAE gelişimine yol açar.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Oluşumu

Bu videoda, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) kullanılarak multipl sklerozun bir fare modeli oluşturulmuştur. Fareye, otoreaktif T hücrelerini aktive eden bir bağışıklık tepkisini tetikleyen bir nöronal peptit ve bir adjuvan içeren bir emülsiyon enjekte edilir. Bunu, otoreaktif T hücrelerinin beyne sızmasına izin vererek kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için bir boğmaca toksini (PTX) enjeksiyonu takip eder. Bu infiltrasyon, multipl sklerozun demiyelinizan durumunu taklit ederek...

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit İndüksiyonu

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), çoklu skleroz kurulmuş bir hayvan modelidir. C57BL / 6 fareleri, merkezi sinir sistemi otoreaktif bağışıklık hücreleri tarafından neden olduğu artan gevşek felce neden, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) peptit 35-55 (MOG 35-55) ile immünize edilir. Hastalığın başlama ve izleme için protokoller tartışılacaktır.

Miyelin Oligodendrosit Glikoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 Farelerde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (EAE) Bağlı

Bu makale, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modelinin indüksiyon ve skorlama yöntemlerini, çeşitli hastalık evrelerinde sırasıyla akış sitometrisi ve kantitatif PCR kullanılarak lenf düğümleri, dalak, kan ve omurilikteki immün hücre dağılımı ve mRNA sitokin seviyelerinin değerlendirilmesi ile birlikte açıklamaktadır.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Öğrenin, deneysel otoimmün ensefalomiyelit fare modelinde omurilik ve beyin inflamasyonu, demiyelinizasyon ile akson hasarının histolojik skorlanması yöntemini. Bu protokol, multipl skleroz patolojisini hassas şekilde değerlendirir.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitte Merkezi Sinir Sistemi İnflamasyonu, Demiyelinizasyon ve Akson Hasarının Skorlanması

Daha fazla video keşfet