Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

Bu teknik, değerli hasta örneklerini farelere intraoral olarak güvenli bir şekilde enjekte edip naklederek ve ardından kemik iliğinin aspire edilmesiyle kemik iliğindeki normal hematopoez ve hastalığın biyolojisini daha iyi anlamamıza yardımcı olmayı amaçlamaktadır. İntravenöz enjeksiyonla yapılan deneyler için küçük miktarlarda değerli numunelerin doğrudan farelerin kemik iliğine nakledilmesinin daha verimli olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Bununla birlikte, gerçek bir teknik video yoktur, bu nedenle genellikle yüksek engelli bir teknik olarak kabul edilirdi.

Protokolümüz, herhangi bir değerli numunenin az sayıda hücre ile fareye kolay ve güvenli bir şekilde aşılanmasını sağlar. Bu teknolojiye yüksek bir talep var ve bu videonun yardımıyla herkes hızlı bir şekilde öğrenebilir. Herkesin bu teknolojiye hakim olmasını ve bilimin ilerlemesine önemli ölçüde katkıda bulunmasını umuyoruz.

Başlamak için, 20 mikrolitre FACS tamponu veya çözülme ortamı kullanarak 3 milyona kadar numune hücresi içeren hücre süspansiyonları hazırlayın. Enjeksiyondan önce bunları buz üzerinde tutun. Enjekte edilecek uyluk kemiğini içeren bacağı, bir povidon iyot veya klorheksidin ovma ve% 70 etanol ile ıslatılmış gazlı bez süngerleri kullanarak üç set alternatif ovma ile dezenfekte edin.

Femuru başparmak ve işaret parmaklarıyla sıkıştırarak bacağı sabitleyin. Tibiayı femurdan bükük tutmak için tibiayı halka veya beşinci parmağınızla itin. Başarılı enjeksiyon için uygun konumlandırmayı sağlayın.

Femurun üstündeki patellar tendonu gagalamak için boş bir steril 27G iğnenin kenarını kullanın. En iyi yerleştirme noktasını sağlamak için, 27G iğnesini patellar tendonun hemen altına bağlı bir şırınga ile yerleştirin. Femurun iki kondili arasına güvenli bir şekilde yerleştirerek, iğneyi femurun şaftına paralel olarak hizalamak için dışa ve yukarı doğru döndürün.

İğneyi femur iliği boşluğuna doğru ilerletirken daireler halinde döndürün. Dirençte gözle görülür bir azalma olana kadar iğneyi sokun. Yanal hareketle doğru iğne konumunu onaylayın.

İğneyi kemik iliği boşluğu içinde hareket ettirirken iğne pistonunu geri çekerek negatif basınç oluşturun. İğnenin kemik iliği boşluğunda olduğundan emin olmak için şırıngada kan veya ilik olup olmadığını kontrol edin. İğnenin doğru yerleştirilmesini sağladıktan sonra yavaşça çıkarın ve şırınga içeren hücreyi aynı kökten geçirin.

Yeni bir iğneye geçerken ilk enjeksiyonun kökünü ve açısını hatırlamak önemlidir. Hücreler uyluk kemiğine başarılı bir şekilde enjekte edildikten sonra, şırınga üzerindeki basıncı koruyarak iğneyi ve şırıngayı dikkatlice çıkarın. Ardından fareyi burun konisinden çıkarın ve yatak takımının aspirasyonunu önlemek için temiz bir kağıt havlu üzerine koyun.

Kurtarma için, fareyi bir ısıtma yastığı veya başka bir kontrollü yüzey üzerinde tutun. Fare rafına geri yerleştirmeden önce anesteziden kurtulduğunuzdan emin olun. Önümüzdeki 24 saat içinde fareleri sıkıntı veya enfeksiyon belirtileri açısından gözlemleyin.

Kemik iliğini aspire etmeden önce prosedüre hazırlanarak başlayın, CSM'yi iki ila üç kez doldurup dışarı atarak 0,5 mililitrelik 27G'lik bir şırıngayı CSM ile ıslatın. Daha sonra anestezi uygulanmış fareden kemik iliğini nazikçe aspire edin ve 20 ila 50 mikrolitre kemik iliği elde edin. Daha sonra iğneyi uyluk kemiğinden tamamen çıkarın ve aspire edilen numuneyi 500 mikrolitre CSM'de askıya alın.

Fareyi burun konisinden çıkarın ve iyileşme sırasında yatak takımının aspirasyonunu önlemek için temiz bir kağıt havlu üzerine koyun. Fare rafının arkasına yerleştirmeden önce anesteziden iyileşmeyi doğrulamak için tüm fareleri izleyin. Dört santigrat derecede 300G'de beş dakikalık bir dönüş ile kemik iliğinden pelet hücreleri.

Süpernatanı aspire edin ve her tüpe ACK lizis tamponu ekleyin. Hücreleri yeniden süspanse etmek için girdap haline getirin ve 5 ila 10 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Hücre süspansiyonunu naylon ağdan yeni bir tüpe süzün.

Orijinal tüpü FACS tamponu ile durulayın ve naylon ağdan geçirin, pelet hücreleri dört santigrat derecede 300G'de beş dakika döndürerek tekrar geçirin. Peletlenmiş hücrelerden süpernatanı aspire edin ve istenen antikorları içeren boyama solüsyonunu ekleyin. Tüpleri 20 dakika boyunca buz üzerinde tutun.

Hücreleri yıkayın ve deney düzeneğine göre analiz etmeye devam edin. Transplantasyon teknikleri, bir biyolüminesans görüntüsü kullanılarak minimal fare istilası ile kolayca değerlendirilebilir. Burada, insan kaynaklı bir K562 hücre hattının Acalook ile transplantasyonu, enjekte edilen uyluk kemiğinin yan tarafında bir ksenogreft fare modelinde gözlendi.

CD34 pozitif HSPC'lerin transplantasyonu, transplantasyondan sekiz hafta sonra insan hücresi engraftmanının% 10 ila 20'sinden fazlası ile sonuçlandı. Benzer şekilde, kordon kanından elde edilen HSC'lerin nakli, nakilden sekiz hafta sonra %10'a kadar insan aşılaması ile sonuçlandı. Erişkin kemik iliğinden türetilmiş HSPC'ler, lösemi kök hücreleri, CRISPR Cas9 ile düzenlenmiş kordon kanı kaynaklı HSPC'ler ve hasta kaynaklı AML iPSC'lerin daha başarılı nakli bu prosedür kullanılarak gerçekleştirildi.