Name: Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Keşfedin, T4 bakteriyofaj ve E. coli etkileşimlerini gnotobiyotik fare modeli kullanarak in vivo inceleyin. Bu yöntem, bağırsak mikrobiyomu dinamiğini ve bağışıklık sistemi yanıtlarını anlamak için standart bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu araştırmayı yaptıkları arazinin xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Ulusunun geleneksel, atalarından kalma ve işlenmemiş toprakları olduğunu kabul ediyorlar. Üzerinde bulunduğu arazi, binlerce yıldır kültürlerini, tarihlerini ve geleneklerini bu sitede bir nesilden diğerine aktaran Musqueam halkı için her zaman bir öğrenme yeri olmuştur. Diğerlerini, https://native-land.ca'da yaşadıkları ve çalıştıkları yerel topraklar hakkında daha fazla bilgi edinmeye teşvik ediyoruz. Yazarlar, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi (NSERC) Kanada Yüksek Lisans Bursları - Yüksek Lisans (NP), Michael Smith Sağlık Araştırmaları BC Stajyer Ödülü (RT-2023-3174, MH'ye), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif Hibeleri Programı (RGPIN-2019-04591'den CT'ye, RGPIN-2016-04282'den LCO'ya), Kanada İleri Araştırma Enstitüsü / İnsanlar ve Mikrobiyom (FL-001253 Appt 3362, CT'ye), Michael Smith Sağlık Araştırmaları Vakfı Burs Ödülü (18239, CT'ye), Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (PJT-159458'den LCO'ya) ve Kanada İnovasyon Vakfı (34673'ten LCO'ya ve 38277'den CT'ye). UBC GREx Biyolojik Dayanıklılık Girişimi tarafından desteklenen UBC Hastalık Modelleme Merkezi ve ubcFLOW'un teknik desteği için ve makalenin eleştirel tartışmaları ve değerlendirilmesi için Osborne ve Tropini laboratuvarlarının üyelerine minnettarız. Şekil 1A ve Şekil 2A , Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

T4 Faj Kullanarak Murin Modellerinde Bağırsak Faj-Bakteri Dinamiklerini Keşfetmek

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bakteriyofajlar veya fajlar, tür ve suş düzeyinde özgüllük1 ile bakterileri enfekte eden ve öldüren virüslerdir. Fajlar, popülasyon dinamiklerini düzenlemede ve bakteriyel uygunluğu yönlendirmede rol oynadıkları bağırsak mikrobiyotası gibi karmaşık bakteri topluluklarında önemli roller oynarlar2. Son on yıl boyunca, antimikrobiyal dirençli patojenlerin3 yükselişi ve alternatif bir tedavi stratejisi olarak faj tedavisinin potansiyeli nedeniyle faj araştırmalarına olan ilgi yeniden artmıştır. Son yıllarda, litik faj kokteylleri, insanlarda ciddi, antibiyotiğe dirençli bakteriyel septik enfeksiyonlarda bir miktar başarı ile intravenöz olarak kullanılmıştır 3,4. Oral faj tedavisi, bağırsak enfeksiyonlarını ve iltihabı tedavi etmek için antibiyotiklere potansiyel bir alternatif olarak da önerilmiştir. Ayrıca, fajlar, tekrarlayan Clostridioides difficile enfeksiyonu (rCDI)5,6, inflamatuar bağırsak bozuklukları (IBD)7,8 ve erken doğmuş domuzlarda nekrotizan enterokolit tedavisinde bakterileri uzaklaştırmak için filtrelenmiş dışkı mikrobiyota preparatları olan dışkı süzüntü nakillerinin(FFT) başarısında rol oynamıştır. Bu sonuçlar göz önüne alındığında, hem fajlar ve bağırsak mikrobiyotası hem de fajlar ve memeli konakçı arasındaki etkileşimleri dikkate almak önemlidir, çünkü önceden var olan bir topluluğa yeni fajların eklenmesi, yalnızca hedef bakteriler üzerinde değil, bir bütün olarak topluluk üzerinde dolaylı etkilere sahip olabilir 2,10.
Fajların hedef bakterilerle etkileşimlerinin in vitro olarak incelenmesinin, bağırsaktaki faj ve bakteri etkileşimlerinin mekanizmalarını ve etkilerini anlamak için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu ortamda, Caudovirales takımının Escherichia coli'ye özgü T4 fajlarının, bağırsak mukusunayapışmak için virion yüzeyindeki yüksek antijenik dış kapsid (Hoc) proteinleri içinde yer alan immünoglobulin (Ig) benzeri alanlara ihtiyaç duyduğu gösterilmiştir 11. Ek olarak, transwell deneyleri, T4 fajlarının epitel hücre kültürleri ile etkileşime girebildiğini ve makropinositoz12,13 ile hücre katmanları boyunca yer değiştirebildiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, fajların ökaryotik hücreleri enfekte edemeseler bile metazoan konakçılarıyla etkileşime girebilecekleri hipotezini desteklemektedir. Bu modeller, yararlı olmakla birlikte, fajlar, bakteriler ve metazoan konakçı arasındaki üçlü etkileşimin kapsamlı bir şekilde araştırılması için gerekli olan bir bağırsak ekosisteminde meydana gelen tüm karmaşık etkileşimlerden yoksundur.
Fare modelleri, karmaşık ortamlarda fajları araştırmak için önemli bir araçtır. Faj uygulamasının arzu edilen bir uygulaması, IBD dahil olmak üzere kronik enflamatuar hastalıklarla ilişkili antimikrobiyal dirençli enfeksiyonları veya patobiyonları tedavi etmek için alternatif bir stratejidir. Bununla birlikte, ortaya çıkan literatür, in vitro faj davranışının in vivo fonksiyonları tam olarak temsil etmediğini göstermektedir. Buttimer ve ark.14, bir faj kokteylinin, basitleştirilmiş bir insan mikrobiyota konsorsiyumunda hedeflenen bakterileri in vitro olarak tüketebildiğini, ancak aynı bakteri-faj konsorsiyumu ile kolonize edilen gnotobiyotik farelerde in vivo olarak çoğaltılamadığını gösterdi. Ayrıca, geleneksel bir fare mikrobiyomunda, T7 fajı, hedef bağırsak bakterilerinin seçici olarak tükenmesine yol açtı, ancak zaman içinde kademeli iyileşme gözlendi, bu da gelişmiş direncingöstergesi 15. Diğer çalışmalar, oral yoldan uygulanan fajların ve hedef bakteri suşlarının in vivo 2,16 bir arada bulunduğunu göstermiştir. Gerçekten de, faj/bakteri birlikteliğinin ötesinde, faj uygulaması genel mikrobiyota topluluğu bileşiminde ve işlevinde yaygın değişikliklere yol açmıştır 2,16. Bu, hastalık ortamlarında önemlidir, çünkü birkaç çalışma, Caudovirales'in nispi bolluğunun artması ile IBD 7,8,17 arasında bakteri bolluğundaki değişikliklerden bağımsız olarak ilişkiler bulmuştur7. Bunun hastalık patogenezinin bir itici gücü mü yoksa bir sonucu mu olduğu bilinmemektedir.
Faj araştırmasının tarihsel odak noktası, bir faj ile hedef bakteri arasındaki ilişki etrafında olmuştur. Bununla birlikte, faj ile metazoan konağın mukozası, epiteli ve bağışıklık sistemi arasındaki potansiyel etkileşimleri dikkate almak da önemlidir. Bu etkileşimlerin tümü, bağırsak faj enfeksiyonuna verilen genel yanıtta önemli bir rol oynar. Bunu göstermek için, mikrobiyota8'in müdahalesi olmadan bağışıklık sistemi üzerindeki etkilerini aydınlatmak için mikropsuz (GF) fareler kullanılarak fajlar incelenmiştir. Bu sistemde, faj nükleik asitleri, fagositik immün hücrelerin (makrofajlar ve dendritik hücreler) endozomları içinde bulunan Toll benzeri reseptörler (TLR'ler) tarafından tespit edildi. Bu, aşağı akış sinyalini aktive etti ve T hücresine bağlı interferon (IFN)-γ8 veya tip I IFN'ler18 üretimini uyardı. Ayrıca, Fluckiger ve ark.19, faj kodlu (kehanet) antijenlerin tanınmasında bellek CD8+ T hücrelerini kullandılar, bu da tümör antijenleri ile T hücresi çapraz reaktivitesi ile sonuçlandı ve bu da tümör yükünün azalmasına neden oldu. Son olarak, fajlara özgü antikor üretimi, fajların hayvan modellerine içme suyu 8,20 yoluyla sürekli olarak verildiğiveya birkaç ay boyunca tekrarlanan oral gavaj yoluyla20 faj proteinlerinin humoral bağışıklık tepkilerini destekleme kapasitesini gösterdiği fare çalışmalarında belgelenmiştir. Bu faj aşılama modları, bağışıklık sisteminin optimal ve sürekli olarak hazırlanmasına izin verse de, fajlar ve bağırsak ortamı arasında doğal olarak meydana gelen etkileşimleri veya oral yoldan uygulanan faj tedavisinin kinetiğini temsil etmeyebilirler. Şimdiye kadar, sınırlı sayıda çalışma, monokolonize fare modellerinde fajın tek bir bakteri türüyle etkileşimlerini incelemiştir21. Bununla birlikte, monokolonize fareler, bireysel türlerin gastrointestinal (GI) sistem ve bağışıklık gelişimi 22,23,24 üzerindeki mikroplara özgü etkilerinin deşifre edilmesinde kritik olduğunu kanıtlamıştır ve fajlar, hedef bakterileri ve metazoan konakçı arasındaki üçlü etkileşimleri anlamada yararlı olabilirler.
Heyecan verici bir şekilde, bağırsak fajı ve bağırsak kommensal bakterileri arasındaki etkileşimlerin yanı sıra metazoan konakçı ile içinde bulunan fajlar arasında meydana gelen etkileşimler hakkında öğrenilecek çok şey var. Bu protokol, bir gnotobiyotik fare modeli kullanarak izole edilmiş T4 fajını ve bakteriyel muadili E. coli'yi (K-12, BW25113) incelemek için bir dizi prosedür sağlar. Bu standartlaştırılmış prosedürler ayrıca, büyüme parametrelerini ilgilenilen çiftlere uyarlayarak diğer faj/bakteri çiftlerini optimize etmek için bir temel sağlar. Burada açıklanan yöntemler şunları özetlemektedir: (1) Farelerin oral gavajı için T4 faj ve araç lizatlarının hazırlanması; (2) T4 fajının E. coli monokolonize gnotobiyotik farelere oral yoldan verilmesi; (3) Fare dışkısında ve dokularında T4 faj seviyelerinin zaman içinde izlenmesi.
Burada sunulan temsili sonuçlar için, saflaştırılmış T4 faj lizatları, Rohwer Laboratuvarı tarafından tutulan faj bankası stoklarından çoğaltıldı. T4 fajını yaymak için Phage-on-Tap yöntemi, bu protokolde atıfta bulunulduğu gibi25'e uyarlanmıştır. Yöntem, üç gün içinde yüksek titre, endotoksin düşük faj stokları verir. Bu yaklaşım kullanılarak, rutin olarak 10 mL ≥10 10 plak oluşturan birim (pfu)/mL < 0.5 endotoksin birimi (EU)/mL T4 faj toplandı. Farelere oral veya intravenöz uygulama için önerilen endotoksin seviyeleri sırasıyla ≤ 20 EU/mL ve ≤ 5 EU/kg/s'dir (veya 20 g'lık bir fare için 1 saat boyunca uygulanan 0.1 EU), bu da bunu in vivo aşılama için uygun bir faj hazırlama yöntemi haline getirir. Tüm faj stokları 4 °C'de salin magnezyum (SM) faj tamponunda saklandı (tarif adım 1.1.5.1'de verilmiştir). E. coli , LB ortamında yetiştirildi. Çeşitli faj-bakteri çiftleri için, çeşitli kültür ortamları ve büyüme koşulları bu protokolden uyarlanabilir. Fajlar ayrıca atık su, deniz suyu, toprak ve bağırsak içeriği gibi çevreden de elde edilebilir ve ilgilenilen her bir faj-konakçı çifti için uygun büyüme ve yayılma koşulları kullanılarak hazırlanmadan önce Sambrook ve Russell26'ya göre izole edilebilir ve saflaştırılabilir25. Alternatif olarak, fajlar ticari kaynaklardan (bkz . Malzeme Tablosu) veya faj bankalarından elde edilebilir.

<table><tbody><tr><td>1-oktanol (%99)</td><td>Thermofisher</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml PES Steriflip Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre Üniteleri</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGP00525</tr><tr><td>Agaroz (Düşük EEO/Çok Amaçlı/Moleküler Biyoloji Sınıfı)</td> <td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; 100kDa Ultra-15 santrifüj filtre cihazı, Ultracel-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer&reg; Tüpler, SST</td><td>BD Medical</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>Biyodışlama hava geçirmez kafesler (ISO kafesleri)&nbsp;</td><td>Techiplast</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dokunma ve ticaret; 96 Kuyulu Hızlı Reaksiyon Modüllü</td><td>Termal Döngüleyici BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür Dihidrat (Beyaz Kristallerden Toza)</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>1.5ML Tüp 100/pk İçin Kapak Kilitleri</td><td>Andwin Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>16812612</tr><tr><td>Kloroform (Koruyucu Olarak Etanol / Sertifikalı ACS)</td> <td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Bakır kaplı çelik boncuklar (4,5 mm)</td><td>Crosman Corporation</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Doku Kiti (50)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Yeşil PCR Master Karışımı (2X)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) disodyum tuzu çözeltisi, moleküler biyoloji için, H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&trade'de 0,5 M; Agar, Toz / Gevrek, Fisher BioReagents ve ticaret; &nbsp;</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BiyoReaktifleri ve ticareti; Mikrobiyoloji Ortamı: LB Et Suyu (Toz) - Lennox&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Merdiveni</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Green FastMix&reg; qPCR karışımı, 1250 rxns</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>izokafes kapakları için HEPA filtreler, ISO HATTI IŞINLAMALI IÇIN OTOKLAVLANABILIR H14 FILTRELER</td><td>Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 İnkübe Çalkalayıcı</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiyoloji Ortamı: LB Et Suyu (Toz) - Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Kilitleme Çıtçıtlı Kapaklı Mikrosantrifüj Tüpleri, 2ml</td><td>Fisher</td><td>14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm sızdırmazlık filmi</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Faj stokları</td><td>Carolina Biological Supply&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PicoLab&reg; Fare Diyeti 20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ve ticaret; Kromojenik Endotoksin Quant Kiti</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A39552S</tr><tr><td>RNase A (17.500 U)</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen DNaz Seti</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat (İnce Beyaz Toz)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (Kristal / Sertifikalı ACS)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör (prob modeli CL-18; güç kaynağı modeli FB50)</td> <td>Fisher kokulu&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Steril esnek film izolatörü&nbsp;</td><td>Sınıf Biyolojik Olarak Temiz&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SYBR & ticaret; Güvenli DNA Jel Leke</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici ve nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 faj astarı, ileri (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>T4 faj astarı, ileri (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1M Çözelti, pH 8.0, Moleküler Biyoloji Sınıfı, Ultra Saf</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ22638AE</tr><tr><td>Su, (DNASE, RNASE içermez)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

murin bağırsağında t4 bakteriyofaj ve e. coli etkileşimi: İn vivo konak-bakteriyofaj dinamiğini İncelemek İçin prototipik bir model

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bakteriyofajlar (fajlar), bakterileri tür ve suş düzeyinde özgüllükle enfekte eden virüslerdir ve bilinen tüm ekosistemlerde en bol bulunan biyolojik varlıklardır. Bağırsak mikrobiyotasında bulunanlar gibi bakteri topluluklarında fajlar, mikrobiyota popülasyon dinamiklerini düzenlemede ve bakteri evrimini yönlendirmede rol oynar. Son on yılda, kısmen, antimikrobiyal dirençli bakterilerin artan tehdidine karşı koymak için umut verici bir araç sunan litik fajların konakçıya özgü öldürme yetenekleri nedeniyle, faj araştırmalarına olan ilgi yeniden artmıştır. Ayrıca, fajların bağırsak mukusuna yapıştığını gösteren son çalışmalar, altta yatan epitele bakteri istilasını önlemede koruyucu bir role sahip olabileceklerini düşündürmektedir. Daha da önemlisi, bakteriyel mikrobiyomlar gibi, bozulmuş fageomlar, inflamatuar bağırsak hastalığı gibi hastalıklarda kötüleşen sonuçlarla ilişkilendirilmiştir. Önceki çalışmalar, fajların dışkı süzüntüsü nakli yoluyla hayvanların ve insanların mikrobiyomunu modüle edebildiğini ve konakçının sağlığına fayda sağladığını göstermiştir. Bu son araştırma dalgasıyla birlikte, bağırsak mikrobiyomu bağlamında fajları incelemek için protokoller oluşturma ve standartlaştırma gerekliliği ortaya çıkıyor. Bu protokol, izole edilmiş T4 fajlarını ve bakteriyel konakçıları Escherichia coli'yi murin gastrointestinal sistemi bağlamında incelemek için bir dizi prosedür sağlar. Burada açıklanan yöntemler, bir faj lizatından nasıl başlanacağını, farelere nasıl uygulanacağını ve bakteri konakçısı ve faj seviyeleri üzerindeki etkilerin nasıl değerlendirileceğini özetlemektedir. Bu protokol değiştirilebilir ve diğer faj-bakteri çiftlerine uygulanabilir ve konak-faj dinamiklerini in vivo olarak incelemek için bir başlangıç noktası sağlar.

Fare bağırsağında T4 faj/E. coli dyad arasındaki etkileşimleri araştırmak için T4 fajı ve araç lizatları hazırlandı, temizlendi ve saflaştırıldı (Şekil 1A). T4 faj lizatları plak testi ile titre edildi ve SM tamponunda 2 x 107 pfu/mL'ye (2 x 106 pfu/fare) seyreltildi. Araç lizatları ayrıca canlı faj varlığını doğrulamak için titre edildi ve T4 faj lizatı ile aynı hacimde SM tamponu içinde seyreltildi. Endotoksin seviyeleri, bir kromojenik endotoksin kantifikasyon kiti kullanılarak seyreltilmiş lizatlarda ölçüldü. T4 fajı, ısıyla inaktive edilmiş faj ve araç lizatları, içme suyu için kabul edilebilir seviyelerin altında endotoksin seviyelerine sahipti (&lt;20 EU/mL)25 (Şekil 1B). Araç lizatı, T4 faj lizatı ile benzer miktarda endotoksin içerdiğinden, uygun bir kontrol olarak kabul edildi. Isıyla inaktive edilmiş faj lizatı (ısıl işlemden önce 2 x 107 pfu / mL) hem araçtan hem de T4 faj lizatından daha az endotoksin içeriyordu. Kit talimatlarına göre, 1-oktanol ile muamele edilmiş numuneler, 0.5 EU/mL'lik bir nihai konsantrasyon vermek için araç lizatına (çivili araç) bir endotoksin standardı eklenerek test inhibisyonu açısından test edildi. Sivri uçlu araç endotoksin seviyeleri eksi araç endotoksin seviyeleri, üretici tavsiyelerine göre 0.5 EU/mL ±% olarak ölçülmüştür (Şekil 1B). Bu, 1-oktanolün başarılı bir şekilde çıkarıldığını ve testin sonuçlarına müdahale edebilecek lizatların neden olduğu herhangi bir test inhibisyonu olmadığını gösterdi.
E. coli K-12 (BW25113) monokolonize C57BL / 6 fareleri, gnotobiyotik koşullar altında steril bir esnek film vinil izolatörü içinde yetiştirildi (Şekil 2A). F0 nesil fareler, çevrelerine ve birlikte barınmalarına eklenmesi yoluyla E. coli ile kolonize edildi. Deneyler için sadece doğumdan dikey iletim ve birlikte barınma yoluyla E. coli ile kolonize edilen döller (F1 ve F2 nesli) kullanıldı. Bu strateji, bakteri aşılamasına yanıt olarak meydana gelen bağışıklık sistemi, mukus üretimi ve GI yolu gelişimindeki değişikliklerikontrol etti 22,37, bu nedenle sadece faj girişi nedeniyle meydana gelen değişikliklerin ölçülmesine izin verdi. Olgunlaştıktan sonra, deney fareleri, her birinin 6-8 haftalıkken oral gavaj yoluyla 2 x 106 pfu T4 faj veya eşit hacimde araç lizatı aldığı steril izokafeslere transfer edildi. T4 faj ve E. coli bolluğu, sırasıyla% 0.5 (yumuşak) agar veya% 1.5 agar üzerinde dışkı peletlerinin toplanması ve nokta kaplama testleri ile dört hafta boyunca izlendi. Bu deney boyunca, T4 faj ve E. coli, her iki popülasyon da tükenmeden bir arada var olabildiler (Şekil 2B, C). T4 fajın 2 x 102 ve 2 x 104 pfu / farenin daha düşük dozlarında oral yoldan verilmesi, T4 fajının 2 x 106 pfu'ya kıyasla bağırsakları kolonize etme yeteneğini azaltmamıştır (Şekil 2D). Benzer şekilde, T4 aşılamasının E. coli seviyeleri üzerinde doza bağlı bir etkisi gözlenmemiştir (Şekil 2E).
Daha da önemlisi, numuneler arasındaki kaplamadaki tutarlılığın plak sayısı için çok önemli olduğu bulunmuştur. Örneğin, yumuşak agarın içine bakteri eklenirken, bakteri yoğunluğunun tahlilin sonucunu büyük ölçüde etkilediği belirlendi. 1 saat, 1.5 saat veya 2 saat boyunca alt kültürlenen E. coli ilavesi, 2.8 saat veya daha uzun süre alt kültürlenen E. coli ilavesinden daha düşük plak sayılarına neden oldu. Ayrıca, E. coli 2.8 saat ila 16 saat (gece boyunca) alt kültürlendiğinde plak miktarı ~ 1 x 109 pfu / mL'de stabilize edildi, bu da 1 saatlik bir alt kültürden hesaplanan değere kıyasla yaklaşık 5 kat artıştı (~ 2 x 108 pfu / ml) (Şekil 3A). Alt kültürlemeden ziyade, hedef bakteriler gece kültürlerinden yumuşak agarlara aşılanabilir. Burada, yumuşak agar'a aşılanan 16 saatlik (gece boyunca) E. coli kültürünün hacmi plak sayımlarını etkiledi (Şekil 3B). Bu sonuçlar, agar içindeki E. coli yoğunluğunun plak tahlil sayımlarını etkileyebileceğini göstermektedir. Her iki yaklaşımda da, faj miktar tayini sonuçları aynı değerde (109 pfu/ml) plato yaptı, bu da plak sayımı doğruluğunu sağlamak için hedef bakterilerin yumuşak agarda yeterince yüksek yoğunlukta olması gerektiğini düşündürdü.
Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar, deneysel manipülasyonlar gerçekleştirmeden önce in vitro ve in vivo pilot deneyler yoluyla faj-bakteri kinetiği hakkında bir anlayış geliştirmenin önemini vurgulamaktadır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg"> Şekil 1: Faj lizatlarının hazırlanması. (A) Yüksek titreli bir faj stoğundan bir faj lizatı başlatmak için iş akışı. Lizatlar çoğaltıldı, temizlendi, konsantre edildi ve endotoksinler uzaklaştırıldı. Kirletici 1-oktanol, hız vakumu ile uzaklaştırıldı. (B) Endotoksinler, bir kromojenik endotoksin miktar tayin kiti kullanılarak faj ve araç lizatlarında ölçüldü. Kesikli mavi çizgiler, ürün inhibisyon kontrolünde ürün inhibisyonunu çürütmek için üst ve alt sınırları gösterir (0,5 EU/mL ± %). Her nokta, iki teknik kopyadan birini temsil eder. Çubuk yüksekliği, kopyalar arasındaki ortalamayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg"> Şekil 2: Monokolonize farelerin üretimi ve dışkı peletlerinde faj ve bakteri seviyelerinin izlenmesi. (A) Tek bir bakteri türüne sahip mikropsuz fareleri kolonize etmek ve F1 ve F2 monokolonize farelerin üretimi için iş akışı. (B-E) E. coli ile monokolonize olarak doğan ve 6-8 haftalıkken T4 faj ile aşılanan C57BL/6 farelerinin dışkı peletlerinde tespit edilen T4 faj ve E. coli seviyeleri. 0. günde (kolonizasyon öncesi) ve kolonizasyondan sonra belirtilen günlerde, T4 faj seviyeleri, tek agar tabakası yöntemi kullanılarak spot kaplama ve plak testleri ile ölçüldü. E. coli düzeyleri %1.5 LB agar üzerine spot kaplama ile ölçüldü. (B, C) 2 x 106 pfu T4 faj veya araç lizatı (hacim ve endotoksin seviyeleri için normalleştirilmiş) ile aşılamayı takiben geri kazanılmış dışkı peletlerinde (B) T4 faj ve (C) E. coli seviyelerinin kinetiği. (D, E) (D) T4 faj ve (E) E. 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu veya 2 x 106 pfu T4 faj ile aşılamayı takiben geri kazanılmış fekal peletlerde coli seviyeleri. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) ortalama ve standart hatasını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg"> Şekil 3: Plak tahlillerinde sorun giderme doğruluğu. (A) Yumuşak agar hazırlığı için E. coli gece kültürleri veya alt kültürleri kullanan T4 faj lizat titresi (% 0.5 agar, LB). Alt kültürler, gece boyunca E. coli kültürünün taze LB'ye 1:50 oranında seyreltilmesi kullanılarak yapıldı. 5 mL yumuşak agar preparatları, 100 μL E. coli ve 20 μL T4 faj ile aşılandı. Bu testler için yumuşak agarlara CaCl2 ve MgS04 eklenmemiştir, ancak istenirse eklenebilir. E. coli alt kültür süreleri 2.8 saatin altında, daha düşük görünür bir faj titresi ile sonuçlandı. (B) Yumuşak agar preparatında farklı E. coli yoğunlukları kullanan T4 faj lizat titresi. Bir gecede kültürden (A'da olduğu gibi alt kültürlenmemiş) yumuşak agarın içine farklı hacimlerde E. coli eklemek, farklı belirgin faj titreleri ile sonuçlandı. Hata çubukları, hesaplanan faj titresi belirsizliğini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajlar (fajlar), bağırsak mikrobiyomunun ayrılmaz bir bileşenidir. Bu simbiyotik sakinler bakteriyel zindeliği ve popülasyon dinamiklerini yönlendirse de, bağırsak homeostazını ve hastalığını nasıl etkiledikleri hakkında çok az şey anlaşılmıştır. Bu protokol, diğer faj-bakteri çiftlerine uyarlanabilen bir fare modeli içinde izole edilmiş T4 fajlarını inceler.

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Araştırmamız, bakteriyofajlar, bakteriler ve memeli bağışıklık sistemi arasındaki üçlü etkileşimleri bağırsak, gnotobiyotik fare bağırsağı bağlamında anlamayı amaçlamaktadır. Bağırsak mikrobiyomunun önemini daha iyi anlamak için sağlık ve hastalık koşulları altında bu etkileşimler hakkında fikir edinmeyi umuyoruz. Son gelişmeler, bakteriyofajların memeli bağışıklık sistemi tarafından tespit edilebileceğini bulmuştur.İnsan bağırsak fagomunun inflamatuar bağırsak bozukluğu gibi hastalık durumlarında düzensiz olabileceği ve fajlar tarafından immün stimülasyonun hastalık fenotiplerini şiddetlendirebileceği öne sürülmüştür. Amacımız, diğerlerine gnotobiyotik fare modellerinde aşılama ve sayım için bir T4 faj lizatı üretmek için standart bir protokol sağlamaktır. Bu protokoller, diğer bakteriyofaj bakteri çiftleri ile kullanım için oluşturulabilir ve değiştirilebilir.

t4-bacteriophage-e-coli-interaction-murine-intestine-prototypical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü...

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024).This video demonstrates the in vivo interaction between T4 bacteriophage and E. coli in the murine intestine, and the fecal spot plating method to quantify their coexistence by measuring bacterial colonies and phage plaques.

Assessing the Coexistence of T4 Bacteriophage and E. coli in Murine Fecal Samples

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

Bu protokol, bakteriyofaj kokteyllerinin antibakteriyel etkinliğini taramak için yüksek aktarım hızı ayarlarını kullanmak için sağlam bir yöntem açıklar.

Gıda Kaynaklı Patojenlerin Biyokontrolü için Bakteriyofaj Etkinliği Yüksek Verimli Ayarlarla Değerlendirildi

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için...

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Burkholderia cinsin üyeleri klinik önemi patojenlerdir. Bu, mekanik bozulma ve daha sonraki analiz için proteomik 2-D jel elektroforezi kullanılarak, toplam bakteri protein çıkarımı için bir yöntem tarif eder.

Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em&gt; Burkholderia</em&gt; Türler

Burada bir prosedür, Escherichia coli K1 kültürleri ile neonatal sıçanda sistemik enfeksiyon kurulması için tarif edilmiştir. Bu non-invazif prosedür da koroid pleksusa de mide-bağırsak yolunun kolonizasyonu, sistemik dolaşıma patojenin translokasyonu ve merkezi sinir sisteminin istilası izin verir.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli Escherichia coli Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Bu çalışma, sıçan bazofilik lösemi hücrelerinin at FcεRIα geni ile transfeksiyonuna dayanan genetik olarak tasarlanmış bir test sisteminin geliştirilmesini ve uygulamalarını açıklamaktadır. Transfekte edilmiş hücreler, alerjik yanıtın mediatörlerinin salınımının IgE ve antijen tarafından aktive edilebildiği fonksiyonel bir reseptörü eksprese eder.

Bir Geliştirilmesi In vitro bir model sistem Equus Caballus ile IgE

Keşfedin, T4 bakteriyofaj ve E. coli etkileşimlerini gnotobiyotik fare modeli kullanarak in vivo inceleyin. Bu yöntem, bağırsak mikrobiyomu dinamiğini ve bağışıklık sistemi yanıtlarını anlamak için standart bir protokol sunar.

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model (Video) | JoVE Journal

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Daha fazla video keşfet