Name: Harwell ve Beamline VMXideki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Öğrenin, VMXi ışın hattı kullanarak oda sıcaklığında protein kristalizasyonu ve yerinde X-ışını veri toplama yöntemini. Bu protokol, kriyosogutma olmadan yüksek verimli yapısal analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

VMXi ışın hattının tasarımına, yapımına ve işletilmesine katkıda bulunan birçok Elmas Işık Kaynağı bilim insanına ve destek ekibi üyesine teşekkür ederiz. Daha sonra kristalizasyon ve veri toplama boru hatlarının geliştirilmesine katkıda bulunan beamline kullanıcılarına minnettarız. Harwell'deki Kristalizasyon Tesisi, Diamond Light Source Ltd, Rosalind Franklin Enstitüsü ve Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir.

Otomatik Protein Kristalizasyonu ve Gerçek Zamanlı Veri Toplama

<ol><li>Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((20+years+of+crystal+hits%3A+Progress+and+promise+in+ultrahigh-throughput+crystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, 1(2021).</li>
<li>Helliwell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+structural+chemistry+of+the+living+organism+at+its+temperature+and+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">What is the structural chemistry of the living organism at its temperature and pressure.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (Pt 2), 87-93 (2020).</li>
<li>Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+biomolecular+structures+near+room+temperature+using+x-ray+crystallography%3A+Concepts%2C+methods+and+future+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining biomolecular structures near room temperature using x-ray crystallography: Concepts, methods and future optimization.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 1), 78-94 (2023).</li>
<li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+cryocooling+distorts+conformational+heterogeneity+in+a+model+michaelis+complex+of+dhfr%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal cryocooling distorts conformational heterogeneity in a model michaelis complex of dhfr.</a> Structure. 22 (6), 899-910 (2014).</li>
<li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ligand+binding+of+endothiapepsin+by+%27temperature-resolved%27+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing ligand binding of endothiapepsin by 'temperature-resolved' macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 8), 964-974 (2022).</li>
<li>Sanchez-Weatherby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vmxi%3A+A+fully+automated%2C+fully+remote%2C+high-flux+in+situ+macromolecular+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Vmxi: A fully automated, fully remote, high-flux in situ macromolecular crystallography beamline.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26 (Pt 1), 291-301 (2019).</li>
<li>Jacquamet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+vapor+diffusion+crystallization+drops+with+an+x-ray+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of vapor diffusion crystallization drops with an x-ray beam.</a> Structure. 12 (7), 1219-1225 (2004).</li>
<li>Mikolajek, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-to-structure+pipeline+for+ambient-temperature+in+situ+crystallography+at+vmxi%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Protein-to-structure pipeline for ambient-temperature in situ crystallography at vmxi.</a> IUCrJ. 10, 420-429 (2023).</li>
<li>Douangamath, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+efficient+fragment+screening+at+xchem+facility+at+diamond+light+source%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualised+Experiments%22%5BJournal%5D)">Achieving efficient fragment screening at xchem facility at diamond light source.</a> Journal of Visualised Experiments. (171), (2021).</li>
<li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ispyb%3A+An+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li>
<li>Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchweb%3A+A+modern+interface+for+ispyb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Synchweb: A modern interface for ispyb.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).</li>
<li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito%C2%AE%3A+An+accurate+nanoliter+dispensing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%3A+Journal+of+the+Association+for+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Mosquito®: An accurate nanoliter dispensing technology.</a> JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>Gildea, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xia2.Multiplex%3A+A+multi-crystal+data-analysis+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).</li>
<li>Winter, G., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Automated data collection for macromolecular crystallography.</a> Methods. 55 (1), 81-93 (2011).</li>
<li>Jumper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+accurate+protein+structure+prediction+with+alphafold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly accurate protein structure prediction with alphafold.</a> Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dials+as+a+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Dials as a toolkit.</a> Protein Science. 31 (1), 232-250 (2022).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Bir protein örneğinin CF'ye gelmesinden, daha sonraki uygulamalar için kullanıcı tarafından nihai verilerin indirilmesine kadar olan tüm prosedürü açıkladık. Kritik adımlar, yüksek kaliteli bir protein numunesinin ve uygun kristal eleklerin üretilmesidir, ya ticari seyrek matris elekleri ya da belirlenmiş koşullara dayalı optimizasyon ekranları kullanılarak. Bu işlem CF'de gerçekleşebilir veya kullanıcılar kristalizasyon prosedürlerini ev laboratuvarlarında gerçekleştirebilir ve uygun kristalizasyon plakalarını ışın hattına getirebilir. Uygun veri toplama parametrelerinin belirlenmesi, özellikle radyasyon hasarının söz konusu olduğu durumlarda, belirli numuneler için önemli olabilir. Çoğu durumda, otomatik veri işleme, bilimsel soruyu yanıtlamak için tamamen yeterlidir, ancak kullanıcılar, örneğin uzay grubunun belirsiz olduğu veya radyasyon hasarı etkilerini en aza indirmek için toplanan verilerin yalnızca ilk kısmının kullanıldığı ışın hattı araçlarını kullanarak yeniden işleme yeteneğini korur.
İlk kristalizasyon denemelerinden uygun kristaller üretilmezse, kristal tohumlama kullanımı gibi protein konsantrasyonu, saflık veya kristalizasyon ekranlarındaki değişiklikler araştırılabilir. Kristaller ışın hattında yararlı bir çözünürlüğe kırılmazsa, optimizasyon çabalarına rehberlik etmek için kristallerin doğal kırınım sınırını ve birim hücresini değerlendirmek için zayıflatılmamış bir ışınla ızgara taramaları kullanılabilir. Plakalar içinde veri toplama için çok küçük olan kristaller (örneğin, <10 μm) bunun yerine seri kristalografi veya nano odak deneyleri için uygun olabilir (örneğin, Diamond beamline VMXm'de). VMXi verilerini kullanarak yapıları çözmek, özellikle etkili arama modelleri sağlamak için Alphafold16'nın ortaya çıkmasından bu yana, moleküler değiştirme ile genellikle basittir. Bu başarılı olmazsa, geleneksel tek dalga boylu anormal kırınım, çok dalga boylu anormal kırınım veya uzun dalga boylu faz deneylerini mümkün kılmak için kristaller plakalardan toplanabilir ve kriyo soğutulabilir.
Bu yöntemin avantajları arasında, kristalleri büyüdükleri ortamlardan rahatsız etmeye gerek kalmadan doğrudan kristalizasyon plakalarından hızlı, yüksek kaliteli veri kümeleri ve geri bildirim elde etme yeteneği yer alır. Yapısal biyolojide 'oda sıcaklığı Rönesansı' olarak adlandırılan, daha fazla fizyolojik alaka ve protein dinamiğinin araştırılmasını sağlamak için kriyojenik olmayan koşullar altında elde edilen yapılara prim verir2. Genellikle, optimize edilmiş bir kriyo soğutmalı kristalden biraz daha düşük bir çözünürlük elde edilir, ancak yalnızca uygun kriyo koşulları oluşturulduğunda ve kristaller mekanik işleme ve kristalleşme damlasınınaçılmasına karşı sağlamsa 3. Bu boru hattının çok uygun olduğu gelecekteki bir uygulama, ilaç keşfinde oda sıcaklığında protein-ligand komplekslerinin veya fragman kampanyalarının büyük ölçekli bir taramasıdır. Ligandlar veya fragmanlar, oda sıcaklığında veri toplanmadan önce pipet veya akustik damla püskürtme ile birlikte kristalleştirilebilir veya eklenebilir. Diğer bir uygulama, yüzlerce veya binlerce kristalden gelen verileri yüksek verimli bir şekilde hızlı bir şekilde ölçmek ve daha sonra farklı biyolojik varlıkları temsil edebilecek izomorf kümeleri çıkarmak veya farklı bir şekilde işlenmiş veya farklı ligandlara veya sinyallere maruz kalmış kristal popülasyonları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar oluşturmak için DIALS17 multipleks14 yazılımını kullanmaktır.

X-ışını kristalografisi, protein yapısını ve işlevini anlamak için önemli bir araç olmaya devam ediyor ve proteinlerin veya komplekslerinin, örneğin substratlar veya ilaç adayları ile yüksek çözünürlüklü yapılarını sağlıyor. Bununla birlikte, birçok durumda, arzu edilen özelliklere sahip kristallerin elde edilmesi - yüksek derecede kırılan, ıslatmaya uygun kristal formu ve ikizlik gibi kristal patolojileri olmayan - önemli bir darboğaz olmaya devam etmektedir1. Protein kristalleri üretmek için uygun kimyasal koşullar genel olarak tahmin edilemediğinden, binlerce potansiyel kimyasal karışımı araştıran kristalizasyon taraması standarttır ve genellikle kaydedilen kristalleşme damlası görüntülerinin izlenmesi için ekranların ve kristal otellerin ayarlanmasında otomasyon/robotik tarafından desteklenir.
Kristaller ortaya çıktığında, tipik olarak bir naylon veya Kapton halkası kullanılarak kristalizasyon ortamından hasat edilmeli ve daha sonra sıvı nitrojene daldırılarak dondurulmadan önce bir kriyoproteksiyon maddesi (arama ek bir değişkendir) içeren bir damlacığa aktarılmalıdır. Kristalizasyon ve X-ışını verilerinin toplanması arasındaki bu ek adımlar, diğer faktörlerin yanı sıra, kapalı ortamı bozulduğunda kristalleşme damlasının dehidrasyonunu, işlendiğinde kristal üzerindeki mekanik gerilmeleri ve kriyoproteksiyon ajanlarının kristal kafese verdiği hasarı (tipik olarak mozaik yayılımının artmasına neden olur) içerebilir2. Ek olarak, kristal hasadı zaman ve emek yoğundur ve özellikle hasat işlemi sırasında damlalar üzerinde cilt oluştuğunda, numuneler arasında homojensizliğe yol açabilir. VMXi ışın hattı, plakaya yapışan kristallerden kullanılabilir verilere erişim sağlar, aksi takdirde veri toplama için atılır.
X-ışını kristal yapılarının büyük çoğunluğu, yukarıdaki yaklaşım kullanılarak 100K'da belirlenir, bu da basit kristal taşınmasını ve işlenmesini sağlar ve X-ışını ışınında kristal ömrünü büyüklük sırasına göre artırır. Bununla birlikte, kriyojenik olmayan koşullar altında, yani protein fonksiyonu 2,3,4 ile ilgili fizyolojik koşullara çok daha yakın yapıların belirlenmesine artan bir ilgi vardır. Bu, proteinlerin dinamik yapısının çok daha iyi değerlendirilmesini sağlar, amino asit konformasyonlarının veya döngülerinin işlevsel olarak ilgisiz durumlardadondurulmasını önler 5 ve ligand bağlanmasının hücre ve organizma içindeki proteinin doğal ortamındakilere çok daha yakın koşullar altında araştırılmasını sağlar6.
Birleşik Krallık'taki Elmas Işık Kaynağı senkrotronundaki Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi yerinde (VMXi) ışın hattında uygulanan alternatif bir yaklaşım, kırınım verilerini doğrudan kristallerden büyüdükleri ortamdaki (yani kristalizasyon plakası içinde), ortam koşulları altında ve bozulmadanölçmektir 7,8. Bu, kristalizasyon ekranlarından ve optimizasyonlardan çok hızlı geri bildirim sağlayarak kullanıcıyı gereksinimleri için en uygun kristal formuna yönlendirir. Ayrıca, yüksek kaliteli oda sıcaklığındaki yapıların otomatik bir şekilde üretilmesini sağlar9.
Bu protokol, bir kullanıcının kristalleşmeye hazır oldukça saf bir protein örneğine sahip olduğunu varsayar. Protein kristalleri üretmek için Harwell'deki Kristalizasyon Tesisine erişen kullanıcı deneyimini açıklıyoruz ve ardından veri toplama için ışın hattı VMXi'yi kullanıyoruz (Şekil 1).
Harwell'deki Kristalizasyon Tesisi
Harwell'deki (CF) Kristalizasyon Tesisi, Elmas Işık Kaynağının bitişiğindeki Harwell'deki (RCaH) Araştırma Kompleksinde yer almaktadır. Tesis, kullanıcılara kristalizasyon taraması, kristal optimizasyonu, kristal görüntüleme ve karakterizasyon için robotik kullanan makromoleküler kristalizasyon için yüksek verimli otomatik bir laboratuvar sunmaktadır. Yüksek düzeyde otomatikleştirilmiş VMXi ışın hattı ile yakın entegrasyon sayesinde, oda sıcaklığı yapılarını belirleme hızı büyük ölçüde hızlandı ve tümü kriyojenik olmayan koşullar altında yeni protein yapılarının, protein-ligand ve DNA-ligand komplekslerinin yanı sıra otomatik parça taramasının (Şekil 1) karakterizasyonunu mümkün kıldı.
CF boru hattı, çözünür ve membran proteinlerinin kristalizasyonu için nanolitre kristalizasyon robotları9 , ticari kristalizasyon ekranları ve karmaşık özel optimizasyon ekranları hazırlamak için sıvı işleme robotları ve kristalizasyon plakalarının görüntülenmesi için dört görüntüleme cihazını (biri 4 °C'de ve üçü 20 °C'de (bkz .). Bir görüntüleyici, lipid kübik fazlı (LCP) cam plakaları görüntüleyebilir ve bir görüntüleyici, çoklu floresan optiklerle donatılmıştır (her ikisi de 20 °C'de).
Tesis şu anda Membran Protein Laboratuvarı (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem parça tarama tesisi 10, MX ışın hatları, XFEL-hub ve Rosalind Franklin Enstitüsü (RFI). Bu iyi kurulmuş ve optimize edilmiş boru hattı, kristalizasyon deneylerinin geniş bir yapısal biyoloji projesi yelpazesinde gerçekleştirilmesini sağlamıştır. Bu makale, VMXi'de veri toplamaya yönelik kristaller için boru hattını açıklamaktadır, ancak kristaller ayrıca hasat edilebilir ve kriyo soğutulabilir veya XChem boru hattına yönlendirilebilir.
Kullanıcı erişimi Diamond MX teklif sistemi (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) aracılığıyla tahsis edilir ve endüstriyel kullanıcılar Diamond Industry Liaison grubu aracılığıyla desteklenir. Tüm kullanıcılar, elle taşınabilen numune(ler)i veya plakaları ile sahaya gelebilirler. Deneyimlerimiz, damlaların dağıtıldıkları yerden uzaklaşabileceğini veya damlaların kristalleşme rezervuarından zarar görebileceğini gösterdiğinden, plakaların kurye ile gönderilmesi önerilmez. Alternatif olarak, düzenleme gereği, kullanıcılar protein örneklerini CF'ye gönderebilir ve burada personel üyeleri kendi adlarına kristalizasyon deneyleri yapabilir. Deneyler, CF durumunda Rock Maker Web'de oturum açarak veya VMXi durumunda ISPyB aracılığıyla kullanıcı tarafından uzaktan izlenebilir. CF'ye erişim, Diamond'da toplanan X-ışını kırınım sonuçlarına dayalı olarak yinelemeli bir şekilde gerçekleştirilebilir.
Elmas Işık Kaynağında Işın Hattı VMXi
Beamline VMXi (bundan böyle "ışın hattı" olarak anılacaktır), uygun kristalizasyon plakaları içindeki kristallerden gelen verileri ölçmeye odaklanan, tamamen oda sıcaklığında, yüksek düzeyde otomatikleştirilmiş X-ışını kristalografisine adanmış benzersiz ve yakın zamanda geliştirilmiş bir cihazdır. Işın hattı, ~2 × 10 13 foton/sn (16 KeV'de) yüksek akı ile bir mikro odak (10 x 10 μm), pembe ışın (<5 ×10-2 ΔE/E bant geçişi) sunar7. Bu yüksek akı ışını, hızlı bir dedektörle birleştiğinde, numunelerin çok yüksek verimini ve 10 μm'nin üzerindeki numunelerden veri toplanmasını sağlar.
Kristalizasyon plakaları, bir numune depolama sisteminde saklanarak ışın hattına girer ve ISPyB11 arayüzü SynchWeb12 kullanılarak plakalar kaydedilirken kullanıcı tarafından sağlanan programa göre görüntülenir. Tipik olarak, kullanıcıların görüntüleme için bir Fibonacci zaman noktası dizisi seçmeleri önerilir (0, 12, 24, 36, 60... Sisteme girilen plakadan itibaren 7,320 saat). Bir plaka görüntülendikten sonra kullanıcı e-posta ile bilgilendirilir. Hem görünür ışık hem de UV ışığı görüntüleme, talep üzerine kullanıcılar tarafından kullanılabilir. Örnek depolama sistemi tarafından alınan görüntüler bir makine öğrenimi algoritması ile analiz edilir; Bu, kristallere benzeyen nesnelerin ilgi noktalarını otomatik olarak bulur ve tanımlar ve kullanıcının veri toplama için bir kuyruğa eklemesi için hazır olan ilgi noktalarını kaydeder. Kullanıcılar ayrıca ilgi çekici noktaları kaydetmek için görünür ışık görüntülerine manuel olarak tıklayabilir veya raster tarama ile analiz edilecek bir bölgeyi tıklayıp sürükleyebilir. Bu noktalar, otomatik olarak bulunan noktaların yanı sıra kullanıcıların kuyruğa eklemesi için kullanılabilir.
Tüm numuneler veri toplama için uygun parametrelere sahip olduğunda, plaka bir kuyruğa girer. Plaka kuyruğun tepesine ulaştığında, otomatik olarak ışın hattına dağıtılır. Kristalizasyon plakaları, kristal otellerden ışın hattına robotik bir kol tarafından otomatik olarak yüklenir ve görüntü eşleştirmeyi takiben, kullanıcı tanımlı talimatlara göre seçilen her kristalden 60°'ye kadar dönüşe sahip kristalografik veri setleri ölçülür. Bir plaka içindeki tüm damlalar, ışın hattı üzerindeki bu deneyler için kullanılabilir. Veriler, otomatik bir şekilde izomorf, optimal olarak birleştirilmiş veri kümeleri üretmek için birden fazla kristalden birleştirilir 7,9. Kuyruğa alınan tüm veri kümeleri toplandıktan sonra, kullanıcıya, diğer Diamond MX ışın hatlarında olduğu gibi ISPyB11'deki veri kümelerini görüntülemek için takip etmesi gereken bir bağlantı içeren bir e-posta gönderilir. Kullanıcılar ayrıca beamline web sayfasına (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html) yönlendirilir.

<table><tbody><tr><td>Formulator</td><td>Formulatrix</td><td>istek üzerine</td><td>Sıvı işleme robotu</td></tr><tr><td>Formulatrix görüntüleyici</td><td>Formulatrix</td><td>istek üzerine</td><td>Kristalizasyon plakası görüntüleyici</td></tr><tr><td>Greiner CrystalQuick X&nbsp;</td><td>Greiner</td><td>Z617644</td><td>Kristalizasyon plakası</td></tr><tr><td>Gryphon&nbsp;</td><td>Sanat Robbins Aletleri</td><td>620-1000-10&nbsp;</td><td>Kristalizasyon robotu</td></tr><tr><td>MiTeGen Insitu-1</td><td>Mitegen</td><td>InSitu-01CL-40</td><td>Kristalizasyon plakası</td></tr><tr><td>Sivrisinek LCP&nbsp;</td><td>(SPT Labtech)</td> <td>istek üzerine</td><td>Kristalizasyon robotu</td></tr><tr><td>Kaya Görüntüleyici & Maker</td><td>Formualtrix</td><td>istek üzerine</td><td> Imager için Yazılım [1] </td></tr><tr><td>https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ Scorpion</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>640-1000-10&nbsp;</td><td> Sıvı taşıma robotu https://www.artrobbins.com/scorpion </td></tr></tbody></table>

harwell ve beamline vmxi'deki kristalizasyon tesisi kullanılarak kristalizasyon ve yerinde oda sıcaklığı veri toplama, elmas işık kaynağı

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

Harwell'deki Kristalizasyon Tesisi kullanılarak robotik protein kristalizasyonu ve Elmas Işık Kaynağı ışın hattı VMXi'deki kristalizasyon plakalarından yerinde oda sıcaklığında veri toplama protokolleri açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek kaliteli oda sıcaklığındaki kristal yapıların birden fazla kristalden basit bir şekilde belirlenmesini sağlar ve kristalizasyon denemelerinin sonuçları hakkında çok hızlı geri bildirim sağlamanın yanı sıra seri kristalografiyi mümkün kılar. Protein yapısını, ligand bağlanmasını ve dinamiklerini anlamada oda sıcaklığı yapılarının değeri, yapısal biyoloji topluluğunda giderek daha fazla kabul görmektedir. Bu boru hattına, çeşitli erişim modlarıyla dünyanın her yerinden kullanıcılar erişebilir. Kurulan kristalizasyon deneyleri, bir makine öğrenimi aracı kullanılarak otomatik olarak tanımlanan kristallerle uzaktan görüntülenebilir ve görüntülenebilir. Veriler, bir plakadaki kullanıcı tarafından seçilen kristallerden 60°'ye kadar dönüş veri kümelerine sahip kuyruk tabanlı bir sistemde ölçülür. Belirli bir kuyu veya numune grubundaki tüm kristallerden gelen veriler, bir web tarayıcısı arayüzü aracılığıyla doğrudan erişilen çıktılarla xia2.multiplex kullanılarak otomatik olarak birleştirilir.

Kristalizasyon tesisi ve VMXi ışın hattı, çok çeşitli proje türleri ve kullanım durumları için kullanılmıştır. Aşağıda, kullanıcıların neleri takip etmek isteyebileceklerini göstermek için az sayıda örnek verilmiştir.
Örnek olay incelemesi 1: Standart veri toplama
Işın hattı, bir kristalizasyon plakası içindeki az sayıda kristalden oda sıcaklığındaki kristal yapıların hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar. Minimum kristal sayısı, uzay grubuna ve kristal yönelimlerine bağlıdır, ancak genellikle 1-4'tür, ancak onlarca kristalden gelen verilerin birleştirilmesiyle gelişmiş veri kalitesi elde edilebilir. Yakın tarihli bir örnek, ışın hattı standartlarından biri olan thaumatin'dir. Şekil 8A'da gösterilen çoklu kristaller, protokol bölüm 2.3'te açıklandığı gibi manuel olarak veri toplama için işaretlendi. Bu kristaller, protokol bölüm 2.4'te açıklandığı gibi kuyruğa eklendi ve açılır listeden deneysel parametreler seçildi. Deneysel parametreler uygulandıktan sonra, plaka veri toplama için sıraya alındı. Veri kümeleri, protokol bölüm 3'te açıklandığı gibi xia2.multiplex ardışık düzeni kullanılarak toplandı, otomatik olarak ölçeklendirildi ve birleştirildi. SynchWeb'den örnek bir çıktı Şekil 8A'da ortada gösterilmiştir. Beş birleştirilmiş veri kümesi, 1.66 şçözünürlüklü bir veri kümesine yol açtı. Bir kuyuda yaklaşık beş kristalin standart veri toplanması için, veri kümeleri 2,5 dakika içinde toplanmıştır.
Vaka çalışması 2: Ligand Bağlama – Mac1 proteini kullanılarak fragman deneyi
Oda sıcaklığında protein-ligand komplekslerinin yapılarının üretilmesi, ışın hattı kullanılarak doğrudan gerçekleştirilebilir. Ligandlar, kristalizasyon plakaları üzerindeki damlalara (manuel olarak veya akustik damla enjeksiyonu ile) eklenebilir ve uygun bir inkübasyon süresinden sonra ölçülen veriler. Burada açıklanan örnekte, bir kristalizasyon plakasında nsp3 (Mac-1) proteininin SARS-CoV-2 ilk makro alanının kristallerini içeren kuyucuklara bir dizi parça dağıtıldı. Aynı parçayı içeren kuyulardan ikisi, protokol adımı 2.5'te açıklandığı gibi bir grup olarak atandı. Protokol adımları 2.3 ve 2.4'te açıklandığı gibi veri toplama için çoklu kristaller (42) işaretlendi ve veri kümeleri standart parametreler (60° döndürme, 0.1° adım, 0.00178 s maruz kalma, %5 iletim, kristal başına 16 KeV) kullanılarak toplandı (Şekil 8B). İki kuyudan gelen veri kümeleri, xia2.dials boru hattı kullanılarak otomatik olarak işlendi ve daha sonra, bu veri setlerinin 22'sini otomatik olarak birleştirmek için xia2.multiplex boru hattı başlatıldı. DIMPLE daha sonra bu boru hatlarının çıktısı üzerinde çalıştırıldı ve bağlı parçanın kanıtlarını açıkça gösteren haritalar verdi. Parça modeli, boş yoğunluğa yerleştirildi ve daha da rafine edildi (Şekil 8B , sağ). Oda sıcaklığındaki ligand-bağlı yapılar, yapıya dayalı ilaç tasarım sürecine paha biçilmez bilgi ve geri bildirim sağlamak için bu adım dizisi kullanılarak kolayca belirlenebilir. Bir dizi kuyuda 42 kristalin bu veri toplanması için, veri kümeleri 10 dakika içinde toplandı.
Vaka çalışması 3: Düşük simetrili uzay grubu ve tercih edilen oryantasyonlara sahip yapı çözümü Plaka benzeri morfolojiye sahip çoklu kristallerden oluşan bir yığın, c-tipi gaz bağlayıcı sitokrom ile kristalizasyon deneylerinden üretildi (Şekil 8C). X-ışını ışınında sadece tek bir kristalin bulunduğu yığının kenarı etrafında birkaç konum seçerek, bir monoklinik (C2) uzay grubuna rağmen, dört kristalden takozları birleştirerek 1.75 şçözünürlüğe kadar kaliteli bir veri seti elde etmek mümkün oldu. Bu, kristalleşme koşullarını daha da optimize etmeye gerek kalmadan projenin hızlı bir şekilde ilerlemesine izin verdi. Bu sonuç daha önce9. Bir kuyudaki dört kristalin bu veri toplanması için veri kümeleri 2 dakika içinde toplandı.
Vaka çalışması 4: Seri kristalografi kullanarak bir plakadaki mikro kristallerden bilgi ve oda sıcaklığı yapısı elde etme
Genellikle mikrokristaller bir damla halinde göründüğünde veya kullanıcılar senkrotron veya XFEL kaynaklarında seri kristalografi deneylerinin öncüsü olarak toplu olarak mikro-kristalizasyon protokollerini optimize etmeye çalıştıklarında, minimum malzeme kullanarak farklı denemelerin kırınım özellikleri ve birim hücre boyutları hakkında hızlı geri bildirim almak çok yararlıdır. Bu kullanım durumunda, parti halinde büyüyen lizozimin mikro kristalleri bir kristalizasyon plakasına (damla başına 200 nL hacim) pipetlendi ve 10 μm adım boyutuna sahip bir ızgara taraması kullanılarak sekiz damladan toplanan veriler (Şekil 9). Elde edilen 25.906 hareketsiz görüntü, seri kristalografi yazılımı kullanılarak işlendi ve 9.891 kırınım modelinin indekslendiği ve yayınlanan oda sıcaklığı yapısına göre iyi bir şekilde rafine edilmiş 2.0 şçözünürlüğe kadar bir veri seti üretildiği bir veri seti ile sonuçlandı (Rçalışması =% 19.6, Rserbest =% 23.6 PDB 8A9D kullanılarak) (Tablo 1). Bu, birim hücre dağılımının ayrıntılı analizine ve zaman çözümlü çalışmalar da dahil olmak üzere karmaşık seri kristalografi deneylerini besleyebilecek bir mikrokristal oda sıcaklığı yapısının belirlenmesine izin verdi. Gerekli toplam mikrokristal süspansiyon hacmi 1.6 μL idi. Izgara taramaları kullanılarak sekiz kuyudaki mikrokristallerin bu veri toplanması için, veri kümeleri 40 dakika içinde toplandı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig1.jpg"> Şekil 1: Kristalizasyon taraması, kristalizasyon tesisinde optimizasyon, VMXi'de numune toplama olmadan oda sıcaklığında otomatik veri toplama ve işleme, XChem parça taraması ve diğer MX ışın hatlarında veri toplamayı entegre eden proteinden yapıya boru hattının şeması. Kullanıcılar, bir numune sağlayarak veya VMXi ışın hattına plakalar getirerek boru hattını başlatabilir. Kısaltma: Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig2.jpg"> Şekil 2: Kristalizasyon plakalarını ayarlamak için Mosquito SPT Labtech arayüzü. (A) (1) MiTeGen In Situ-1 Kurulum görünümü. (2) 96 kuyucuklu plaka tipine giderek ve (3) MiTeGen plaka 2 damla plakasını seçerek MiTeGen 2 damla standart plakasını seçin. VMXi için gerekli olan drop 1 ve drop 2 tanım parametrelerini değiştirmek için (4) edit simgesine tıklayınız. Bu, (5) X ve Y ofsetlerinin gösterildiği gibi değiştirilmesi gereken yeni bir pencere (B) açar. (B) alt kuyu 2 ve (C) alt kuyu 3'ü seçin ve değerleri buna göre değiştirin. (D) CrystalQuickX Kurulum görünümü. 96 kuyucuklu plaka tipine gidip MiTeGen plaka 2 damla plakasını seçerek CrystalQuickX 2 damla standart plakasını seçin. VMXi için gerekli olan drop 1 ve drop 2 tanım parametrelerini değiştirmek için, yukarıdakiyle aynı şekilde düzenle simgesine tıklayın. Bu, (E,F) X ve Y ofsetlerinin gösterildiği gibi değiştirilmesi gereken yeni bir pencere açar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig3.jpg"> Şekil 3: Bir VMXi gönderisinin nasıl oluşturulacağını, bir plakanın nasıl kaydedileceğini ve iletişim bilgilerinin nasıl kontrol edileceğini gösteren SynchWeb arayüzü. SynchWeb arayüzüne bilgi yüklemenin çeşitli aşamalarının ekran görüntüleri, (A) açılır menüden, (B,C) yeni bir gönderi kaydetmekten, (D) yeni bir konteyner kaydetmekten, (E) plaka bilgilerini girmekten, (F) iletişim bilgilerini kontrol etmekten ve (G) bir teklif içindeki kayıtlı konteynerlerin bir listesinden gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig4.jpg"> Şekil 4: SynchWeb kullanarak veri toplama için örneklerin seçilmesi ve hazırlanması. SynchWeb arayüzünü kullanarak veri toplama için numune hazırlamanın çeşitli aşamalarını gösteren bir dizi ekran görüntüsü görüntülenir. (A) İlgi çekici noktalar ve bölgeler, damla genel görünümünden seçilir. Bu panelin alt kısmında, bir damlanın kronolojik bir dizi fotoğrafı var. (B) 'Kristal' kategorisi için sonuçları vurgulayan bir plaka için CHiMP çıktısına bir örnek. (C) Seçilen noktalar ve bölgeler listesinden kuyruğa örnekler eklemek ve (D) ışın hattı tarafından oluşturulan deney ayarlarının açılır listesinden kuyruğa alınan örneklere veri toplama için parametreler uygulamak. Deneysel parametreleri olmayan (kırmızı renkte) numuneler ile doğru uygulanmış parametrelere sahip olanlar (üst ve alt) arasındaki farka dikkat edin. Bu panelin alt kısmında, ışın hattında toplanacak plakayı sıraya koyan Queue Container butonu bulunur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig5.jpg"> Şekil 5: SynchWeb'de örnek grup oluşturma. Örnek gruplar oluşturmanın çeşitli aşamalarını gösteren bir dizi ekran görüntüsü. (A) Numuneleri içeren plaka(lar) ilgili sevkiyattan seçilir ve (B) plaka içindeki damlalar seçilir. Bunlar tek tek damlalar olabilir veya satır ve/veya sütuna göre seçilebilir. (C) Daha önce oluşturulmuş örnek grupların bir listesi. (D) Son üç multipleks işleme işinin çıktıları listelenir ve işleme boru hattından gelen istatistikleri göstermek için seçilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig6.jpg"> Şekil 6: Veri işleme ve veri azaltma. (A) ISPyB11'de işlenmiş bir veri kümesinin ekran görüntüsü. Yeniden işleme özelliklerine erişme düğmesi vurgulanır. Örnek kimliği ve deneysel parametreler sol üstte, kırınım resim görüntüleyicisi ise ortada gösterilir. Bu resme tıklamak, farklı resimleri incelemek için etkileşimli bir pencere açacaktır. Kristal görüntü görüntüleyici sağda gösterilir ve bu görüntüye tıklandığında ışın hattı ve Formulatrix depolama görüntülerini karşılaştırmak için etkileşimli bir pencere açılır. Görüntü başına analiz grafiği en sağda gösterilir ve bu resme tıklandığında bu çıktının büyütülmüş bir sürümü açılır. Otomatik İşleme sekmesine tıklamak, otomatik işlemeyi görünür hale getirecek ve farklı işlem hatlarının sonuçları arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştıracaktır. Farklı işleme işlem hatları arasında geçiş yapmak ve seçilen işlem hattının ayrıntılı çıkışını görüntülemek için sekmelere tıklayın. Veri indirme için Günlükler ve Dosyalar düğmesi vurgulanır. Aşağı Akış İşleme sekmesine tıklandığında genişler ve uygun olduğunda veri sonrası azaltma işlem hatları aracılığıyla çalıştırılan tüm veri kümeleri için sonuçlar sağlanır. (B) Ekran görüntüsü Örnek Grup Yönetimi ekran. Kullanıcı tanımlı grup adı en üsttedir ve dahil edilen kuyuların görsel açıklaması aşağıda görülebilir. Yeşil bir kuyu, o damladan ölçülen tüm kristallerin gruba dahil edileceğini gösterir. Bu grup üzerinde gerçekleştirilen farklı multipleks işlerin bir özeti görülebilir ve altında multipleksin ayrıntılı çıktısı bulunur. Dahil edilen deneyleri incelemek için Veri Kümeleri düğmesi vurgulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig7.jpg"> Şekil 7: Veri yeniden işleme pencereleri. (A) Bireysel ve (B) çok kristalli veri kümeleri. Veri bölgelerinin seçildiği iki ayrı veri kümesi görüntülenir. Tek tek işle onay kutusu işaretliyken, seçilen kırınım görüntüleri Entegre Et düğmesine basılarak tek tek işlenecektir. Çoklu kristal düğmesine tıklamak, tek tek veri kümelerinin bir görüntüsünü açacaktır. Birden çok veri kümesinden kırınım görüntülerini yeniden işlemek için, görüntülerin bölgeleri görüntülendiği gibi seçilir ve vurgulandığı gibi Entegre Et düğmesine tıklanarak yeniden işleme başlatılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig8.jpg"> Şekil 8: VMXi boru hattından elde edilen temsili sonuçlar. (A) Bir kristalleşme damlası (sol panel), veri işleme sonuçları (orta panel) ve elektron yoğunluğu (sağ panel) içinde protein taumatin için işaretlenmiş kristaller. (B) Parçanın SARS-CoV-2 Makro alanına bağlanmasını belirlemek için birden fazla kristal üzerinde toplama. Veri setleri, standart deneysel ayarlar kullanılarak EU-OPENSCREEN parça ekranından bir parça varlığında birden fazla kristal üzerinde toplandı. Bu veri koleksiyonlarının örnekleri SynchWeb'den alınan bu alıntıda gösterilmektedir. Parça, karşılık gelen yoğunluğa yerleştirildi ve en sağda gösterildiği gibi daha da rafine edildi. (C) Veri toplama için kullanılan zorlu bir kristalleşme vuruşundan bir yığın halinde işaretlenmiş monoklinik kristaller. Yeşil çarpı işaretleri ve kırmızı sayılar, verilerin 10 μm ışın ve 60° dönüş kullanılarak nerede ölçüldüğünü gösterir. Ortaya çıkan takozlardan dördü, 1.75 şçözünürlükte bir veri kümesi oluşturmak için birleştirildi. Heme grubunun etrafındaki elektron yoğunluğu sağda görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig9.jpg"> Şekil 9: Kristalizasyon plakasındaki seri kristalografi. (A) İlgilenilen bölgeyi temsil eden beyaz bir kutu ile kristalleşme damlasının optik görüntüsü. (B) Izgara tarama noktalarının tanımı. (C) Kırınımı gösteren ısı haritası. (D) 9.000'den fazla hareketsiz kırınım modelinden elde edilen bir seri kristalografi veri setinden kaynaklanan elektron yoğunluğu haritası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Çözünürlük (Å)</td>
			<td>Tamlık (%)</td>
			<td>Multiplicity</td>
			<td>I/σ(I)</td>
			<td>Rbölme </td>
			<td>CC1/2 </td>
			<td>Eşsiz Gözlemler</td>
		</tr><tr><td>Genel</td>
			<td>100</td>
			<td>95.5</td>
			<td>20.8</td>
			<td>0.063</td>
			<td>0.998</td>
			<td>8422</td>
		</tr><tr><td>En Düşük (55,55 - 5,43)</td>
			<td>100</td>
			<td>147.1</td>
			<td>81.7</td>
			<td>0.028</td>
			<td>0.999</td>
			<td>488</td>
		</tr><tr><td>Yüksek (2.03 -2.00)</td>
			<td>100</td>
			<td>75.3</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.092</td>
			<td>0.410</td>
			<td>411</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: VMXi RT seri veri kümesi için veri istatistikleri. Kısaltmalar: I = ölçekli gözlemlerin ortalama yoğunluğu; Rbölme = ölçülen yoğunlukların tutarsızlığının bir ölçüsü; CC 1/2 = veri kümesinin iki rastgele yarısı arasındaki korelasyon katsayısı.

Harwell'deki Araştırma Kompleksi'ndeki kristalizasyon tesisini kullanarak proteinlerin kristalleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz ve ardından Diamond'ın Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ (VMXi) ışın hattındaki plakalar içindeki kristallerden yerinde X-ışını kristalografik veri topluyoruz. Numune gereksinimlerini, kristalizasyon protokollerini ve veri toplama yönergelerini açıklıyoruz.

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from ...

Proteinlerin üç boyutlu yapılarını anlamak, ilaç tasarımının, biyoteknolojinin ve birçok farklı hastalık hakkındaki anlayışımızın temelini oluşturur. VMXI, protein yapılarını kriyo soğutma olmadan, doğal sıcaklıklarına çok daha yakın bir şekilde belirler. VMXI ayrıca, hala kristalizasyon plakalarındayken protein kristallerinden gelen kırınım verilerini ölçer ve mekanik kullanımdan kaynaklanan herhangi bir hasarı önler.Gelecekte, insanların şu anda sıklıkla elde ettiği tek bir yapıdan ziyade birçok farklı yapısal durumu tanımlamak için büyük kristal popülasyonlarını keşfetmek için VMXI'nin inanılmaz veriminden gerçekten yararlanmak istiyoruz. Ayrıca ilaç geliştirmeye ve kristalizasyon plakaları içinde parça taraması ve optimizasyonu gerçekleştirmeye doğru ilerlemek istiyoruz. Muazzam umut vaat eden yeni bir yaklaşım.

crystallization-situ-room-temperature-data-collection-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada, otomatik tarama ve veri toplama seçenekleri kullanılabilir bazı sinkrotron beamlines nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bilim adamları göndermek cryocooled örnekleri sinkrotron için ve kırınım özellikleri ekranlı, veri kümeleri toplanan ve işlenmiş ve, mümkün olan yerlerde, bir yapı çözüm yürütülen — tüm insan müdahalesi olmadan.

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

Diamond beamline I24'te seri senkrotron kristalografisi için sabit hedef numune hazırlama, veri toplama ve veri işleme için kapsamlı bir kılavuz sunuyoruz.

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Bu protokol, kriyo yapısına sahip aydınlatma mikroskopisi kullanılarak biyolojik kriyo ile korunmuş örneklerin nasıl görüntülenerek görüntülenlerin ortaya koyduğunu göstermektedir. U2OS hücrelerinin sitoskeletonlarını görüntüleyerek metodolojiyi gösteriyoruz.

Kriyojenik Olarak Korunmuş Hücrelerden Kriyo-Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobik Veri Toplama

Verilerin sinyal-gürültü oranı, mikrokristallerden X-ışını kırınım ölçümlerinin yapılmasında en önemli hususlardan biridir. VMXm kiriş çizgisi, bu tür deneyler için düşük gürültülü bir ortam ve mikrobülans sağlar. Burada, VMXm ve diğer mikro odak makromoleküler kristalografi kiriş hatları için mikrokristallerin montajı ve soğutulmasından dolayı örnek hazırlama yöntemlerini açıklıyoruz.

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

Burada, uzun dalga boyu makromoleküler X-ışını kristalografi deneyleri için Diamond Light Source'daki I23 kiriş hattında kriyojenik numune hazırlama ve kristallerin vakum endstationına aktarılması için bir protokol sunuyoruz.

Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü

Burada, EMBL Grenoble'daki HTX Laboratuvarı'nda KristalDirekt teknolojisine dayalı proteinden yapıya, hızlı ligand-protein kompleksi analizi ve büyük ölçekli parça taraması için otomatik makromoleküler kristalografi boru hatlarının nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

Bu katkı, kristal üzerinde kristal cihazlarda protein kristalizasyonunun nasıl kurulacağını ve çip üzerinde kristalizasyon platformunu kullanarak oda sıcaklığında otomatik seri veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Bu el yazması, mutasyonlar termo için ekran insan serotonin taşıyıcı arındırmak, yüksek afiniteli antikorların üretilmesi ve antidepresan ilaç S -citalopramın bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksi kristalize açıklamaktadır. Bu protokol için diğer zor membran ileticileri, reseptör ve kanal çalışması için adapte edilebilir.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Öğrenin, VMXi ışın hattı kullanarak oda sıcaklığında protein kristalizasyonu ve yerinde X-ışını veri toplama yöntemini. Bu protokol, kriyosogutma olmadan yüksek verimli yapısal analiz sağlar.

Harwell ve Beamline VMXideki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı (Video) | JoVE Journal

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

Daha fazla video keşfet