Name: İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ve çift boya yaklaşımı kullanarak insan nötrofillerinde NET oluşumunu yüksek verimli ve otomatik olarak nicelendirmeyi. Bu yöntem, iltihaplanma hastalıklarında tedavi geliştirmeyi destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü Bilim ve Teknoloji Ofisi'ndeki Işık Görüntüleme Bölümüne teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü'nün (ZIA AR041199) İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Sağlıklı insan deneklerden alınan nötrofiller, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokol kapsamında bilgilendirilmiş onam verildikten sonra elde edildi. Protokol, NIH insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder.
1. Nötrofillerin boyanması ve test plağının hazırlanması
<ol><li>Her enstitünün kılavuzunu izleyerek uygun yazılı bilgilendirilmiş onam ile periferik kan alın ve istenen herhangi bir yöntemi kullanarak nötrofilleri izole edin. Örneğin, Ficoll-dekstran yöntemi10,11, nötrofillerin insan periferik kanından izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. NOT: Burada tartışılan yöntem insan nötrofillerini kullansa da, fare nötrofilleri de benzer bir protokol kullanılarak analiz edilebilir.</li>
	<li>Roswell Park Memorial Enstitüsü'nde nötrofiller (RPMI; Malzeme Tablosuna bakınız) 1640 ortamında 2.0 x 106 nötrofil / mL'de yeniden süspanse edin ve nötrofil süspansiyonunu 1.5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. NOT: Genellikle kültür ortamına fetal sığır serumu (FBS) eklemiyoruz çünkü FBS'deki albümin NET oluşumunu12 azaltabilir ve FBS'deki ısıya dayanıklı nükleaz NET'leri13 bozabilir.</li>
	<li>1.5 mL nötrofil süspansiyonu başına 1 μL'de membran geçirgen kırmızı DNA boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
	<li>Karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Nötrofilleri 1 mL RPMI'de yeniden süspanse edin, ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. 2x tekrarlayın (toplam 3x yıkayın).</li>
	<li>Nötrofilleri 1 mL RPMI'de yeniden süspanse edin ve bir hücre sayacı kullanarak sayın. Nötrofil süspansiyonunu 1.5 x 105 nötrofil / mL'ye seyreltin.</li>
	<li>1 mL nötrofil süspansiyonu başına 4 μL 1:100 önceden seyreltilmiş membran geçirimsiz yeşil DNA boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
	<li>Kuyucuk başına 100 μL nötrofil süspansiyonunu berrak doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakaya koyun (bkz. Her koşulu üç kopya halinde ayarlayın. NOT: Nötrofiller poli-L-lizin kaplamalı veya kaplamasız plakalara yerleştirilirse, bu yöntemle NET oluşumu ve miktar tayininde hiçbir fark olmadığını daha önce7 göstermiştik. Bu nedenle doku kültürü ile tedavi edilmiş plak kullanımı bu yöntem için yeterlidir.</li>
	<li>İnhibitörlü veya inhibitörsüz uyarıcı reaktifler içeren 100 μL RPMI veya ilgili kuyucuklara ilgilenilen başka herhangi bir reaktif ekleyin. Her zaman 500 nM forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) veya 2.5 μM kalsiyum iyonofor (A23187) eklenerek pozitif kontrol kuyuları kullanın, burada 30 μM AKT inhibitörü kullanılmıştır.</li>
	<li>Plakayı% 5 CO2 inkübatörde bulunan canlı hücre analiz sistemine (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin. NOT: Bu adımdan birkaç dakika sonra plakanın üstünde ve altında yoğuşma görünebilir. Bu, doğru görüntülemeyi engelleyebilir. Taramaya başlamadan önce yoğuşmayı iyice silin ve giderin. Plakayı makineye yerleştirin, yazılımı başlatın, tarama protokolünü girin ve ardından ilk taramadan hemen önce plakayı silin.</li>
</ol>2. NET oluşturan nötrofilleri görselleştirmek için tarama plakası
<ol><li>Yazılımı başlatın (yazılım ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın). Sol üst köşedeki + tuşuna basarak Add Vessel'i başlatın.</li>
	<li>Zamanında Tara'yı seçin. Yeni'yi seçin. NOT: Bu oluşturulduktan sonra, Öncekini Kopyala'yı seçerek ve bir sonraki ekranda saklanan protokolü seçerek aynı tarama protokolünü çalıştırın.</li>
	<li>Standart'ı seçin. Tarama ayarlarını şu şekilde ayarlayın: Hücre Hücre seçenekleri: Yok; Görüntü kanalları: Faz, Yeşil (Edinme Süresi: 200 ms), Kırmızı (Edinme Süresi: 400 ms); Amaç: 20x.</li>
	<li>Listeden kullanılan plakayı seçin. Plakanın canlı hücre görüntüleme sisteminin tepsisine yerleştirileceği damar konumunu seçin.</li>
	<li>Numunelerin bulunduğu kuyuları seçin ve kuyu başına kaç görüntü alacağınıza karar verin. Kuyucuk başına görüntü sayısına bağlı olarak, plaka için tahmini bir tarama süresi oluşturun. Genellikle, kuyu başına 4 görüntü yeterlidir; Ancak bu, taramaların koşullarına ve sıklığına bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Etüt için bir ad sağlamak üzere Plaka Haritası Oluştur'a tıklayarak her bir kuyucuktan gelen bilgileri (örneğin, hücre tipi ve bileşik) girin. NOT: Plaka haritası, yazılımdaki plaka haritası düzenleyicisi kullanılarak önceden hazırlanabilir ve kaydedilebilir. Kaydedilen plaka haritası verileri bu adımda içe aktarılabilir. İstenirse plaka harita bilgilerinin girilmesi atlanarak daha sonra gerçekleştirilebilir. Plaka yerleşimi bilgisi girilmeden de veri elde edilebilir. Bununla birlikte, sonraki analizi kolaylaştırmak için plaka bilgilerinin girilmesi önerilir.</li>
	<li>Sonraki ekranda, analiz türü olarak Temel Çözümleyici'yi seçin ve daha önce kullanılan analiz tanımlarını (tarama protokollerini değil) gösteren açılır listeden Analiz Protokolü'nü seçin. Hem yeşil hem de kırmızı için spektral karışım %0,0'da bırakılabilir. NOT: İstenirse bu adım atlanabilir.</li>
	<li>Taramayı zamanlayın. Buradaki deney için, 8 saat boyunca her 15-20 dakikada bir tarayın. Ekranın üst kısmındaki beyaz ve gri çubuğu sürükleyerek taramanın başlama zamanını ayarlayın. NOT: Çok sık taramaktan kaçının, aksi takdirde makine aşırı ısınma nedeniyle düzgün çalışmayabilir. Tarama süresi 24 saatte 12 saati geçmemelidir. Tarama çok sıksa bir uyarı görebilirsiniz.</li>
	<li>Bir sonraki ekranda tarama ayarını kontrol edin ve taramayı başlatmak için Programa Ekle'ye basın. Her şeyin yolunda gidip gitmediğini onaylamak için ilk görüntü seti taranana kadar bekleyin.<ol><li>Bazen hücreler düzgün bir şekilde odaklanmayabilir. Bu durumda, yoğuşma olup olmadığını kontrol edin (ve buna göre silin), plakanın tepsiye doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini veya plakanın konumunun doğru şekilde belirtilip belirtilmediğini vb. kontrol edin. Hücreler hala yüzüyorsa ve kuyunun dibine yerleşmemişse, taramadan önce yaklaşık 5 dakika bekleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. NET'leri ölçmek için analiz tanımının ayarlanması
<ol><li>Analiz edilecek çalışmayı (gemiyi) Görünüm sekmesinde açın. Ekranın solundaki Analizi Başlat'a basın. Yeni Analiz Tanımı Oluştur'u seçin.<ol><li>Daha önce bir analiz gerçekleştirilmişse, Varolan Analiz Tanımını Kopyala'yı seçerek küçük değişikliklerle aynı analiz tanımını kullanın. Bu durumda, adım 3.3'e gidin. Analizi herhangi bir değişiklik yapmadan kullanıyorsanız, Mevcut Analiz Tanımını Kullan'ı seçin; Bu önerilmez, çünkü floresan seviyesi farklı günlerdeki tahliller arasında değişebilir ve genellikle bazı küçük düzeltmeler gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Temel Çözümleyici'yi seçin. Tüm görüntü kanallarını kullanın: Faz, Yeşil, Kırmızı ve Örtüşme. NOT: NET'leri saymak için genellikle yeşil ve kırmızı nesne maskeleri kullansak da, enkaz önemli olduğunda üst üste binen nesne maskesi kullanışlıdır. Bu gibi durumlarda, çakışan nesne sayısı sayısı yeşil nesne sayısı yerine pay olarak kullanılacaktır (bkz. adım 3.9). Yeşil nesne sayısı yerine örtüşen nesne sayısı kullanılırsa, tüm kırmızı sinyallerin doğru şekilde sayılması gerekir. Daha sonraki zaman noktalarında çekilen görüntülerde düşük kırmızı sinyale sahip tüm kırmızı nesneleri saymak için kırmızı sinyal ayarını yapın, ancak kalıntıları saymayın.</li>
	<li>Eğitim için 6 - 8 temsili örnek görüntü seçin. Buradaki deney için aşağıdaki görüntüleri ekleyin: NET oluşturmayan nötrofillerde üretilebilecek ince yeşil sinyalleri telafi etmek için yeşil sinyal ayarını optimize etmek için 0 ila 20 dakika arasında çekilen görüntüler NET oluşturan nötrofilleri tanımlamak için yeşil sinyal ayarını optimize etmek için 3-6 saat arasında (kullanılan stimülasyona bağlı olarak değişir) alınan pozitif kontrollü maksimum NET'lerin görüntüleri Nükleer kırmızı sinyal 1 saat zaman noktası civarında en güçlü olduğundan (tüm hücreler kuyunun dibine yerleştiğinde) toplam hücre sayısını (kırmızı boya ile boyanmış) saymak için 1 saat zaman noktasında çekilen görüntüler ve hücre ölümü nedeniyle kademeli olarak azalır. Enkaz içeren görüntüler, sayılmalarını önlemek için.</li>
	<li>Analiz tanımını ayarlayın. Kırmızı nesneler ve yeşil nesneler, sırasıyla tüm nötrofillerin ve NET'leri oluşturanların çekirdeklerine karşılık gelir. Aşağıdaki örnekle başlayın ve Geçerli Önizleme veya Tümünü Önizle'ye basın ve sonuçları optimize etmek için her parametreyi değiştirin: Yeşil için: Segmentasyon- Arka plan çıkarma: Üst Şapka; Yarıçap: 100 μM; Eşik: 0,3 GCU; Kenar bölme: Açık; Kenar hassasiyeti: -20; Temizleme -Delik dolgusu: 100μm2; Boyutu 0 piksel olarak ayarlayın; Filtreler- Alan: min 20 μm2, max 500 μm2; Eksantriklik: maksimum 0.97; Ortalama Yoğunluk: min 1.00 Kırmızı için: Segmentasyon- Arka plan çıkarma: Üst Şapka; Yarıçap: 10 μM; Eşik: 1,0 GCU; Kenar bölme: AÇIK; Kenar hassasiyeti: -50; Temizleme Deliği dolgusu: 50 μm2; Boyutu 0 piksel olarak ayarlayın; Filtreler- Alan: min 20 μm2, max 400 μm2; Ortalama Yoğunluk: min 1.5.<ol><li>NET oluşturmaması gereken nötrofillerde aşırı yeşil sinyal belirirse (örneğin, 0 dakikada lobülasyonlu çekirdeklere sahip uyarılmamış nötrofiller), bunun nedeni yeşil kanalda tespit edilen kırmızı sinyalin taşması olabilir. Böyle bir durumda, adım 3.1'e dönün, ekranın solundaki Görüntü Katmanları'nı açın ve Spektral Karıştırmayı kullanarak yeşil kanaldaki kırmızı sinyalleri kaldırın.</li>
		<li>Diğer bir seçenek de, kırmızı sinyalin ne kadarının yeşil kanaldan çıkarılması gerektiğini netleştirmek için nükleer kırmızı boya ile tek boyama için bir kuyu ayarlamaktır. Öte yandan, genellikle kırmızı kanala yeşil sinyal sızması analizleri etkilemez. NOT: Kırmızı sinyale duyarlılığın düşük olması ve daha sonraki zaman noktalarında (örn. 6 saatlik zaman noktası) çekilen görüntülerde tüm kırmızı sinyallerin yakalanmaması önemli değildir. Her görüntüdeki maksimum kırmızı nesne sayısı, görüntüdeki toplam nötrofil sayısı olarak kabul edilir ve adım 3.9'da payda olarak kullanılacaktır. Genellikle, nükleer kırmızı sinyaller 1 saat zaman noktası civarında zirve yapar ve hücre ölümü nedeniyle yavaş yavaş azalır (Şekil 1B). Bu nedenle, maksimum kırmızı sinyale sahip görüntülerdeki kırmızı nesneleri doğru bir şekilde saymak için kırmızı sinyal ayarını yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>Analiz edilecek tarama sürelerini ve kuyuları seçin. Genellikle, tüm zaman noktaları ve kuyular analiz edilmelidir. Analiz tanımına bir etiket sağlayın.</li>
	<li>Özeti kontrol edin ve analizi başlatın. Analizin tamamlanması birkaç saat sürer (süre, zaman noktalarının ve kuyuların sayısına bağlıdır). Başlatıldıktan sonra, analiz tanımının adı Görünüm sekmesinde çalışmanın adının altında gösterilecek ve tamamlandığında tam tarih gösterilecektir.</li>
	<li>Tamamlandıktan sonra, analiz tanımının adına çift tıklayarak analiz edilen etüdü açın. Ekranın solundaki Katmanlar'ı açın ve her hücrenin doğru şekilde işaretlenip işaretlenmediğini kontrol edin. Doğru şekilde işaretlenmemişse, adım 3.1'e dönün ve sonraki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Verileri dışa aktarmak için ekranın solundaki Grafik Metrikleri'ne tıklayın. Yeşil Sayım, Kırmızı Sayım veya Çakışma Sayısı (Görüntü Başına) öğesini seçin ve ardından dışa aktarılacak zaman noktalarını ve kuyuları seçin. Gruplandırmayı seçmek için, tarama yapıldığında tüm kuyucuklar doğru bir şekilde belirtilmişse Plaka Haritası Çoğaltır'ı seçin.</li>
	<li>Verileri dışa aktarın. Uygun bir yazılım kullanarak aşağıdaki denklemle her koşul/zaman noktası için NET oluşturan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66051/66051eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOT: Paydanın maksimum kırmızı nesne sayısı olmasının nedeni, Kırmızı nesne sayısının yaklaşık 1 saatlik zaman noktasında zirve yapması ve hücre ölümü nedeniyle kademeli olarak azalmasıdır.</li>
</ol>

Çift Boyalı Canlı Hücre Analizi Kullanarak NET Oluşumunun Ölçülmesi

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Wigerblad, G., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+systemic+autoimmune+and+autoinflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases.</a> Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).</li>
<li>Wagner, D. D., Heger, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thromboinflammation%3A+From+atherosclerosis+to+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).</li>
<li>Njeim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+contributes+to+the+pathogenesis+of+diabetes+and+its+complications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications.</a> J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).</li>
<li>De Meo, M. L., Spicer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis.</a> Semin Immunol. 57, 101595(2021).</li>
<li>Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+as+drivers+of+immune+dysregulation+in+autoimmune+diseases+with+skin+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations.</a> J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).</li>
<li>Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+neutrophils+undergoing+NET+formation+and+distinguishing+mechanisms+of+neutrophil+cell+death+by+use+of+a+high-throughput+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method.</a> Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonlighting+chromatin%3A+when+DNA+escapes+nuclear+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control.</a> Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+quantification+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and quantification of NETosis.</a> Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).</li>
<li>Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+whole+blood+and+buffy+coats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats.</a> J Vis Exp. (175), 62837(2021).</li>
<li>Neubert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+serum+albumin+inhibit+in+vitro+formation+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Front Immunol. 10, 12(2019).</li>
<li>von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+calf+serum+contains+heat-stable+nucleases+that+degrade+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps.</a> Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

NET'leri ex vivo ölçmek için mevcut yöntemlerin, nötrofilleri, NET'leri ve potansiyel terapötik hedefleri tarafsız ve yüksek verimli bir şekilde inceleme yeteneğimizi sınırlayan çeşitli dezavantajları vardır10,14. Örneğin, NET'lerin miktar tayini için altın standart olarak kabul edilen immünofloresan boyamadan sonra NET oluşturan hücrelerin doğrudan sayımı düşük verimlidir ve operatörün öznel görüşüne bağlıdır. Membran geçirimsiz DNA boyasının floresansı...

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), çeşitli enflamatuar uyaranlara yanıt olarak nötrofillerden ekstrüde edilen ağ benzeri kromatin yapılardır. NET'ler, enfeksiyöz patojenleri yakalayan ve öldüren ve inflamatuar yanıtları tetikleyen DNA, histonlar ve çeşitli anti-mikrobiyal proteinler/peptitlerden oluşur1.
NET'ler patojenlere karşı konak savunması için faydalı olmakla birlikte, çeşitli otoimmün hastalıkların2, tromboz3, metabolik hastalıkların4 ve kanserlerin metastatik büyümesinin5 potansiyel bir itici gücü olarak dikkat çekmiştir. Bu nedenle, NET oluşumunun inhibisyonu bu hastalıklar için potansiyel bir terapötik seçenektir. Bununla birlikte, gelişim6'daki bazı umut verici NET hedefleme moleküllerine rağmen, bu mekanizmayı spesifik olarak etkileyen onaylanmış bir tedavi hala yoktur. Bu, en azından kısmen, NET oluşumu için nesnel, tarafsız, tekrarlanabilir ve yüksek verimli niceleme yöntemlerinin eksikliğine atfedilebilir.
Çift renkli canlı hücre görüntüleme platformu 7,8 kullanan yeni bir yöntem oluşturduk ve raporladık. Membran geçirgen nükleer boya ve membran geçirimsiz DNA boyası ile boyanmış nötrofillerin hızlandırılmış görüntüleri yazılım tarafından analiz edilir ve NET oluşturma öncesi ve sonrası nötrofillerin sayıları birden fazla zaman noktasında sayılır. PKCa aracılı Lamin B ve CDK4/6 aracılı Lamin A/C demontajı9'un düzenlenmesi ile NET oluşumu sırasında plazma zarının bütünlüğü kaybolduğundan, NET oluşturan nötrofiller membran geçirimsiz DNA boyası ile boyanırken, sağlıklı nötrofiller boyanmaz. Bu yöntem, NET oluşumunu ölçmek için daha önce bildirilen tekniklerin sorunlarının üstesinden gelir ve otomatik bir şekilde tarafsız, yüksek verimli, tekrarlanabilir ve doğru NET nicelemesi sağlar.

<table><tbody><tr><td>AKT inhibitörü</td><td>Calbiochem</td><td>124028</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf 96 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Canlı hücre analiz sistemi</td><td>Sartorius</td><td>N/A</td><td>Incucyte Software (v2019B)</td></tr><tr><td>Membran geçirimsiz DNA yeşil boya&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Nükleer kırmızı boya</td><td></td><td>Enzo ENZ-52406</td><td>Nötrofil peleti lekelendikten sonra mavimsi hale gelir.</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11835030</td><td>Fenol kırmızısı içeren RPMI kullanılabilir.</td></tr></tbody></table>

İnsan nötrofillerinde nötrofil hücre dışı tuzakların oluşumunu Ölçmek için gerçek zamanlı yüksek verim tekniği

Real-Time High Throughput Technique to Quantify Neutrophil Extracellular Traps Formation in Human Neutrophils

Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin çok önemli bir bölümünü oluşturan miyeloid soy hücreleridir. Son on yılda, nötrofillerin, antimikrobiyal savunmada çok önemli yapılar olan nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu da dahil olmak üzere çoklu mekanizmalar yoluyla immün düzensizliğin başlatılmasına ve sürdürülmesine katkıda bulunarak kanser, otoimmün hastalıklar ve çeşitli akut ve kronik inflamatuar durumların patogenezinde oynadığı ek kilit roller ortaya çıkmıştır. NET oluşumunu tarafsız, tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde ölçme tekniklerindeki sınırlamalar, nötrofillerin sağlık ve hastalıklardaki rolünü daha iyi anlama yeteneğimizi kısıtlamıştır. Hücre içi ve hücre dışı DNA'yı görüntülemek için iki farklı DNA boyası kullanan bir membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımı ile birleştirilmiş bir canlı hücre görüntüleme platformu kullanarak NET oluşumuna uğrayan nötrofillerin miktarını belirlemek için otomatik, gerçek zamanlı, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz. Bu metodoloji, nötrofil fizyolojisinin değerlendirilmesine ve NET oluşumunu hedefleyebilen moleküllerin test edilmesine yardımcı olabilir.

Bu yöntem, her zaman noktasında alınan faz kontrastlı, kırmızı floresan (membran geçirgen boya) ve yeşil floresan (membran geçirimsiz boya) görüntüler sağlar. NET oluşturma işlemi ile birlikte, faz kontrastı ve kırmızı floresan görüntülerde morfolojik değişiklikler gözlenir ve membran bir kez ihlal edildiğinde yeşil floresan gözlemlenebilir (Şekil 1). Bu tahlilde, NET oluşturan nötrofiller ağ benzeri bir yapı oluşturmak yerine genellikle yuvarlaktır. Bunun nedeni, makinenin çözünürlüğünün in...

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Neutrophils are myeloid-lineage cells that form a crucial part of the innate immune system. The past decade has revealed additional key roles that ...

Araştırmamız, bağışıklık sisteminde temel ilk müdahale ekipleri olan ve çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynayan nötrofillere odaklanmaktadır. Son yirmi yılda, nötrofillerin immün regülasyonu bozarak kanser, otoimmün hastalıklar ve diğer enflamatuar durumların gelişimine katkıda bulunduğu ortaya çıkmıştır. Bu, nötrofilik hücre dışı tuzaklar, ağlar, iltihaplanmaya yanıt veren ve bu hastalıklarda tedavi için hedeflenebilecek ağ benzeri yapılar oluşturmayı içerir.Bununla birlikte, ağları hedef alan bazı umut verici moleküllere rağmen, geliştirme aşamasında hala bu mekanizmayı spesifik olarak etkileyen onaylanmış bir tedavi yoktur. Bu, en azından kısmen, net oluşum için nesnel, tarafsız, tekrarlanabilir ve yüksek verimli bir niceleme yönteminin eksikliğine atfedilebilir. Protokolümüz, hassas net oluşum takibi için membran geçirgen ve geçirimsiz boyalar kullanarak nötrofil davranışını analiz etmek için çift renkli canlı hücre görüntüleme kullanır.Bu yöntem, membran bütünlüğüne dayalı olarak net oluşturan ve sağlıklı nötrofiller arasında ayrım yapar ve faz kontrast görüntülemede emilen morfolojik değişiklikler yoluyla hücre ölüm tiplerinin net bir şekilde ayırt edilmesini sağlar. Bu yöntem, net oluşumu ölçmek için daha önce bildirilen tekniklerin sorunlarının üstesinden gelir ve otomatik bir şekilde verimli, tekrarlanabilir ve doğru bir net miktar belirleme sağlar. Bu yöntem, yüksek verimli bir şekilde net oluşumuna karşı çoklu terapötik hedefleri tarama yeteneği vererek nötrofil hedefli ilaç geliştirmeye yardımcı olacaktır.

real-time-high-throughput-technique-to-quantify-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşturmak ve izole etmek için kullanılan bir in vitro teknik gösterilmektedir. Nötrofiller periferik kandan izole edilir ve NET üretmek için forbol miristat asetat (PMA) ile uyarılır. İnkübasyon sırasında, nötrofiller, granüler sitoplazmik proteinlerle karıştırılmış yoğunlaştırılmış kromatin içeren NET'leri serbest bırakmak için bir hücre ölümü (NETosis) sürecinden geçer.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzakları Oluşturmak için İn Vitro Teknik

Bu video, anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar içeren hasta serumu kullanılarak önceden etiketlenmiş nötrofillerde nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin indüksiyonunu ve görselleştirilmesini göstermektedir. Ayrıca, geçirimsiz bir DNA boyası ve floresan mikroskobu kullanmak, NET'lerin görüntülenmesini sağlar.

Önceden Etiketlenmiş Nötrofillerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İndüksiyonu ve Görselleştirilmesi

İnsan nötrofillerinden NET salınımını ölçmek için mükemmel araçlar sağlayan yüksek verimli testler sunulmaktadır.

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

Burada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETTs) ve işletim NETQUANT, immünororesans görüntüleri NTs quantification için tam otomatik bir yazılım seçeneği oluşturmak için bir protokol salıyoruz.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Bu iletişim kuralı bir son derece hassas ve yüksek üretilen iş nötrofil hücre dışı tuzak (NET) tahlil için ex vivo NET oluşumu miktar yarı otomatik ayirt üç boyutlu confocal mikroskobu tarafından açıklanır. Bu iletişim kuralı NET oluşumu ve bozulma farklı uyaranlara sonra değerlendirmek için kullanılan ve potansiyel NET hedefli tedaviler çalışma için kullanılabilir.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET'ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET'ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ve çift boya yaklaşımı kullanarak insan nötrofillerinde NET oluşumunu yüksek verimli ve otomatik olarak nicelendirmeyi. Bu yöntem, iltihaplanma hastalıklarında tedavi geliştirmeyi destekler.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Daha fazla video keşfet