Name: Ultra Kısa Kendi Kendine Birleşen Peptit Matrisinde SW1222 Hücre Hattından Kolorektal Kanser Organoidlerinin İmalatı ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Keşfedin ultra kısa kendi kendine birleşen peptit matrislerinde SW1222 kolorektal kanser organoidlerinin üretimini ve karakterizasyonunu. Bu yöntem, organoid morfolojisi ve biyofonksiyonelleştirme etkilerini inceleyerek rejeneratif tıbba katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kral Abdullah Bilim ve Teknoloji Üniversitesi tarafından finansal olarak desteklendi. Yazarlar, KAUST'un İnovasyon ve Ekonomik Kalkınma tarafından verilen KAUST'un Tohum Fonu Hibesini ve KAUST'un İnovasyon Fonu'nu kabul eder. Yazarlar, biyolojik karakterizasyon ve mikroskopi analizlerini desteklemek için KAUST'un Biyobilim ve Görüntüleme Çekirdek Laboratuvarlarına teşekkür eder.

1. Tampon ve çözelti hazırlama
NOT: Belirtilen tüm konsantrasyonlar nihai konsantrasyonlardır.
<ol><li>Tam Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'unu (IMDM) hazırlamak için sırasıyla% 10 ve% 1'lik bir nihai konsantrasyonda fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Geçirgenlik tamponunu hazırlamak için MgCl2 (3 mM), sükroz (300 mM) ve Triton X-100'ü (% 0.5) fosfat tampon salin (PBS) içinde karıştırın. Bu solüsyonu 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Bir bloke edici tampon hazırlamak için sığır serum albümini (BSA,% 1), glisin (0.3 M) ve Tween-20'yi (% 0.1) PBS'de birleştirin. Bu solüsyonu 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Steril koşullar altında 10x ila 2x PBS'yi ultra saf suyla seyreltin. Bu çözeltiyi 6 aydan fazla oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>3 mg peptit tozunu ultraviyole ışık altında 30 dakika sterilize edin. Bir girdap karıştırıcı kullanarak çözmek için 500 μL ultra saf su ekleyin. NOT: Nihai konsantrasyon hedef konsantrasyonun iki katı olmalıdır, yani 6x konsantrasyon 1x konsantrasyon 3 mg / mL olacağından 3 mg / mL.</li>
</ol>2. Peptitte SW1222'den kolorektal kanser organoid üretimi
<ol><li>Bir alikotu gece boyunca 4 °C'de çözdürün ve bodrum matrisi kontrolünü hazırlamak için gerekene kadar buzda tutun.</li>
	<li>24 oyuklu bir plakada her bir oyuğun ortasına 10 μL'lik bir damla 2x peptit çözeltisi yerleştirin. Plakanın oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin. Alternatif olarak, 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 8-10 damlacık biriktirin. NOT: Konfokal ve elektron mikroskobunda kullanılması amaçlanan numuneler, steril bir lamel üzerine ekilirse manipüle etmek için daha erişilebilirdir.</li>
	<li>10 μL 2x PBS ekleyin. PBS çözeltisini ucu kullanarak hafifçe karıştırın. Jellerin en az 20 dakika stabilize olmasına izin verin ve damlacıkların neredeyse sağlam kalmasını sağlayın. NOT: PBS ilavesinin ve nazik karıştırmanın amacı, damlacığın bütünlüğünü korumak ve hidrojelin bir tabaka halinde yayılmasını önlemektir.</li>
	<li>SW1222 hücrelerini% 0.125 tripsin-EDTA çözeltisi (5 mL) kullanarak ayırın. Hücreleri tripsin ile 37 ° C'de şişeden ayrılana kadar 5-10 dakika inkübe edin. Hücre topaklanmasını önlemek için şişeye dokunmaktan kaçının.</li>
	<li>Tripsini etkisiz hale getirmek için 5 mL tam ortam ekleyin. 30 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin. Alternatif olarak, agregaları parçalamak için 25 G iğneli bir şırınga kullanın.</li>
	<li>0.4 × 106 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve 10 μL'lik bir mikropipet kullanarak her peptit damlacığına 2 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.</li>
	<li>Damlacıkları 37 ° C'de,% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra her bir oyuğa 0.5 mL takviye edilmiş ortam ekleyin.</li>
	<li>Beklerken, ana stoğu (partiye bağlı olarak 8-12 mg/mL) takviye edilen ortamı kullanarak 3 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek bazal membran matris kontrolünü hazırlayın. Bu çözeltiye hücreler ekleyin (25 μL başına 800 hücre). NOT: Bazal membran manipülasyonu her zaman buz üzerinde yapılmalıdır. Hidrojele dokunmadan önce uçlar buz gibi soğuk PBS'de durulanmalıdır. Aksi takdirde, uçların içinde polimerizasyon meydana gelecektir.</li>
	<li>Her kuyucukta 20 μL bazal membran çözeltisi damlacıkları levha. 37 °C'de 20 dakika inkübe ederek damlacıkların jelleşmesine izin verin. Malzeme jelleştikten sonra 0,5 mL tam ortam ekleyin.</li>
	<li>Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. Hücrelerin 4. gün gibi erken bir tarihte lümen oluşumu sinyallerini organize ettiğini ve gösterdiğini gözlemleyin.</li>
	<li>Organoid büyümesini değerlendirmek için 1. gün, 4. gün ve 7. günde parlak alandaki hücreleri görüntüleyin.</li>
</ol>3. Canlılık ve çoğalma
<ol><li>Canlılık testi için üç siyah kuyu plakası ve proliferasyon testi için üç siyah kuyu plakası hazırlayın. Oyuk başına 25 μL 2x peptit çözeltisi ekleyin ve aynı hacimde 2x PBS kullanarak jelleştirin. Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi tohumlayın.</li>
	<li>Proliferasyon plakasında boşluk olarak kullanılacak her peptit hidrojel formülasyonu için üç kuyucuk hazırlayın. Bunların üzerine hücre tohumlamayın.</li>
	<li>Ortamı canlılık kuyusu plakasından çıkarın ve 1x PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Calcein-ve etidyum homodimerini, memeli hücreleri için canlılık / sitotoksisite Kitinden (Malzeme Tablosuna bakınız) aynı ışık korumalı konik tüpe 8 μM'ye seyreltin. Bu çözeltinin 2 mL'sini ışık korumalı bir konik tüpte 2 mL PBS'ye hazırlamak için, 4 μL Calcein-stok çözeltisi ve 8 μL Etidyum homodimer-1 stok çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Adım 3.4'te hazırlanan kalsiyum/etidyum homodimer çözeltisini 96 oyuklu plakaya ekleyin. Kuyucuk başına 100 μL ekleyin. Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>1x PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın. Floresan mikroskobu altında 4x objektif kullanırken en az üç alan (orta, üst, alt, alt) veya 10x ve 20x objektif kullanırken en az beş alan (orta, sol üst, sağ üst, sol alt, sağ alt) görüntüleyin.</li>
	<li>90 μL'lik bir nihai hacim sağlamak için ortamı proliferasyon kuyusu plakasından çıkarın.</li>
	<li>%10'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 10 μL Alamar Blue çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Işıktan koruyun ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 2-4 saat inkübe edin</li>
	<li>Floresan (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) veya absorbansı (570 nm) ölçmek için bir kuyu plakası okuyucu kullanın. Boşluklar için elde edilen değerlerin ortalamasını alın ve bunları hücre içeren her bir kuyucuktan elde edilen değerlerden çıkarın.</li>
	<li>Her koşulun sinyalinin ortalamasını alarak ve ilgili boşluklarının ortalamasını çıkararak proliferasyon değerlerini hesaplayın. Zamana karşı bağıl absorbans/floresan sinyalinin indekslenmiş bir kutu grafiği oluşturarak grafikler oluşturun.</li>
</ol>4. Hücrelerin matrise yapışma deneyi
<ol><li>İki bağımsız 96 oyuklu plakada 100 μL peptit hidrojel hazırlayın.</li>
	<li>Her oyuğa 20.000 hücre tohumlayın ve 100 μL ortam ekleyin. Plakaları 37 ° C'de,% 5 CO2'de 90 dakika inkübe edin.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, sadece bir plaka alın ve 20-30 saniye boyunca bir P200 mikropipet kullanarak ortamı dikkatlice yeniden süspanse edin. Ucu jelden uzak tutarak hidrojeli bozmamaya dikkat edin. Alternatif olarak, hidrojel mekanik özellikleri buna izin veriyorsa (G' > 8.000 Pa), hareketli bir girdap kullanarak kuyu plakasının dört tarafına hafifçe vurun. NOT: Ortamın yeniden askıya alınması (veya girdapla kuyucuk plakasına vurulması), hem bağlanmamış hücreleri hem de matrisin yüzeyine zayıf yapışma olan hücreleri çıkaracaktır. Hücresel bağlanma 90 dakika içinde gerçekleşecektir, ancak bu bağlanmanın gücü spesifik peptit hidrojellerine ve bunların yapışkan ve bağlayıcı özelliklerine bağlı olarak değişecektir. Kolorektal organoid büyümesinin, sertlik değerleri 2.000 Pa'nın altında olan matrislerde tercih edildiği bilinmektedir. Bu nedenle, bu protokolde sunulan hidrojeller yumuşak ve kırılgan olduğundan, hafif mekanik stres kullanmaya özen gösteriyoruz.</li>
	<li>Her iki kuyucuk plakasından 100 μL ortamı çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>1 μg / mL DAPI çözeltisi hazırlayın. Tüm kuyucuklara 100 μL DAPI çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Bir floresan mikroskobu altında temsili bir dizi alanı görüntüleyin. Piksel/mesafe oranını sabit tutmak için tüm görüntülerin aynı amaç kullanılarak elde edildiğinden emin olun. NOT: 10x hedef için dokuz alanı veya 20x hedef için 15 alanı görüntüleyin.</li>
	<li>Floresan görüntülerini görüntü analiz yazılımına (örn. ImageJ) yükleyin ve tüm görüntülerdeki parçacıkları analiz edin.<ol><li>Image (Görüntü) menüsünden Type (Tür) seçeneğini belirleyin ve 8 bit'e tıklayın.</li>
		<li>Görüntü menüsünden Ayarla'yı seçin ve Parlaklık/Kontrast'a tıklayın. Otomatik düğmesine tıklayın | Uygula'yı tıklayın.</li>
		<li>Image (Görüntü) menüsünden Adjust (Ayarla) seçeneğini seçin ve Threshold (Eşik) üzerine tıklayın. Otomatik düğmesine tıklayın ve pencereyi kapatın.</li>
		<li>Analiz menüsünden, Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın. Özetleme seçeneğini işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın.</li>
		<li>Özet penceresinde, Dosya menüsünün üzerine gelin ve özet değerleri kaydetmek için Kaydet'e tıklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Tüm görüntülerin sonuçlarını standart istatistik yazılımına aktarın.</li>
	<li>Stresten önce ve sonra hücrelerin kapladığı alanın yüzdesini hesaplayın. Her koşula karşı alan yüzdesinin dizinlenmiş bir kutu grafiğini oluşturun.</li>
</ol>5. Peptit hidrojeldeki organoidlerin immün boyaması
<ol><li>Adım 2.1-2.10'da açıklandığı gibi 4 gün boyunca 20 μL peptit hidrojel damlacıkları içinde 800 hücre tohumlayın.</li>
	<li>4. günde, ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu 1x PBS kullanarak 2x yıkayın.</li>
	<li>400 μL% 4 formaldehit çözeltisi ekleyin. Kuyu plakasını oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Formaldehit çözeltisini bir P1000 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>1 mL geçirgenlik tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Geçirgenlik tamponunu bir P1000 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>0,5 mL bloke edici tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Engelleme tamponunu bir P1000 ile çıkarın ve 1x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Bloke edici tampondaki birincil antikoru üreticinin talimatlarına göre seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu). İki kuyucuğa 200 μL ekleyin.</li>
	<li>Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Boyama solüsyonunu bir P200 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikoru, üreticinin talimatlarına göre bloke edici tamponda seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu). İkincil antikor çözeltisine 1:40 oranında falloidin konjugatını ekleyin.</li>
	<li>Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında en fazla 3 saat inkübe edin. Boyama solüsyonunu bir P200 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>Bloke edici tamponda 1 μg / mL'lik bir DAPI çözeltisi hazırlayın. Her kuyucuğa 300 μL DAPI çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Boyama solüsyonunu bir P200 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>Işıktan koruyun ve 4 °C'de 7 güne kadar saklayın.</li>
</ol>6. Matriksteki organoidlerin görüntülenmesi ve görüntü analizi
<ol><li>Lekeli numuneleri 10x'te bir epifloresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Sadece phalloidin ve DAPI kanallarını kullanın.</li>
	<li>Cellopose yazılımını açın ve bir görüntü yüklemek için ctrl + L tuşlarına basın. Yazılım, seçilen görüntünün konumundaki tüm dosyalara erişebileceğinden, tüm floresan görüntüleri herhangi bir alt klasör olmadan tam konuma kaydettiğinizden emin olun.</li>
	<li>Segmentasyon paneline kolonilerin ortalama çapını yazın ve ENTER'ı tıklatın.</li>
	<li>Kolon organoidleri için özel bir model seçin ve Modeli Çalıştır düğmesine tıklayın. NOT: Burada, Cellpose2.0 29,30'da sıfırdan iki model kullanmanızı öneririz.</li>
	<li>Maskeleri .npy dosyası olarak kaydetmek için ctrl + s tuşlarına basın.</li>
	<li>Klasörün görüntüleri arasında hareket etmek için klavye oklarını kullanın ve klasördeki tüm görüntülerde iki nokta üst üste organoidleri modelini çalıştırın.</li>
	<li>Klasörün bir kopyasını alın ve kolon organoid lümeni için bir model kullanarak 6.2-6.6 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>ImageJ'yi açın ve Eklenti | Makrolar | Koşmak... Cellpose Github sitesinde bulunan imagej_roi_converter.py dosyasını çalıştırmak için ve bir pencerenin görünmesini bekleyin.</li>
	<li>İki nokta üst üste organoid klasöründen ilk dosyayı seçin ve Aç'a tıklayın.</li>
	<li>İlk dosyaya karşılık gelen seg.npy dosyasını seçin ve Aç'a tıklayın. NOT: ImageJ, maskeleri ilgi alanlarına dönüştürecek ve bunları karşılık gelen floresan görüntülerle örtüştürecektir.</li>
	<li>ROI Yöneticisi penceresinde Tümünü Seç'e tıklayın ve Ölç'e tıklayın.</li>
	<li>Dosya | Farklı kaydet... tıklayın ve sonuçları kaydedin. NOT: Bu, alandaki her koloninin tüm şekil özelliklerini içeren bir .csv dosyasıyla sonuçlanacaktır.</li>
	<li>Kolon organoid lümen klasöründeki aynı görüntü için 6.8-6.12 arasındaki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>OriginPro'yu yükleyin ve İçe Aktarma Sihirbazı'nı açmak için ctrl + 3 tuşlarına basın. Üç nokta düğmesine tıklayın ve aynı görüntü için organoid ve lümen şekil özelliklerine karşılık gelen her iki .csv dosyasını da seçin.</li>
	<li>Her lümen ölçümünün ilgili koloni ile eşleştirildiğinden emin olmak için lümen şekli özelliklerinden elde edilen sonuçları kopyalayıp koloni sonuçlarının yanındaki bir sütuna yapıştırın.</li>
	<li>Yeni bir sütunda, içerdiği koloninin göreli lümen alanını elde etmek için lümen ve koloni alanlarını bölün.</li>
	<li>Her koloninin daireselliğine ve lümen alanına karşılık gelen sütunu seçin. Arsa Üzerine Tıklayın | Temel 2D | Dağılım.</li>
	<li>Çizim penceresine sağ tıklayın ve Çizim ayrıntıları'nı seçin. Centroid(PRO) sekmesine tıklayın ve Alt Küme için Merkez Noktasını Göster, Veri Noktalarına Bağlan ve Elipsi Göster seçeneklerini işaretleyin.</li>
</ol>

Biyofonksiyonel Kendiliğinden Birleşen Peptitlerin Hücre Adezyonu ve Morfolojisi için Değerlendirilmesi

<ol><li>Susapto, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide+bioinks+support+automated+printing+of+large-scale+constructs+assuring+long-term+survival+of+printed+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs.</a> Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+well-defined%2C+self-assembling+3D+substrate+for+long-term+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+proteins+and+peptides+as+scaffolds+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+bioink%3A+self-assembling+nanofibrous+scaffolds+for+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures.</a> Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).</li>
<li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+extracellular+matrix+hydrogels+as+alternatives+to+Matrigel+for+culturing+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).</li>
<li>Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+current+status+of+three-dimensional+organoids+as+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models.</a> Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Hauser, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+tri-+to+hexapeptides+self-assemble+in+water+to+amyloid+beta-type+fiber+aggregates+by+unexpected+alpha-helical+intermediate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).</li>
<li>Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+self-assembling+peptides+as+building+blocks+for+modern+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices.</a> Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).</li>
<li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+tetrameric+peptides+allow+in+situ+3D+bioprinting+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).</li>
<li>Bilalis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptide-based+photoreactive+instant+glue+for+environmental+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Moretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectively+positioned+catechol+moiety+supports+ultrashort+self-assembling+peptide+hydrogel+adhesion+for+coral+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration.</a> Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).</li>
<li>Alhattab, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+three-dimensional+bone+marrow+niche-like+acute+myeloid+Leukemia+disease+model+by+an+automated+and+controlled+process+using+a+robotic+multicellular+bioprinting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Research%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system.</a> Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+peptide-based+nanostructures%3A+smart+nanomaterials+toward+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery.</a> Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+by+a+functionalized+silk+fibroin+hydrogel+for+bone+defect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).</li>
<li>Hogrebe, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+control+of+matrix+adhesiveness+and+stiffness+within+a+3D+self-assembling+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel.</a> Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).</li>
<li>Wu, F. J., Lin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+self-assembly%2C+and+cell+responses+of+aromatic+IKVAV+peptide+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles.</a> Molecules. 27 (13), 4115(2022).</li>
<li>Cringoli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioadhesive+supramolecular+hydrogel+from+unprotected%2C+short+d%2Cl-peptides+with+Phe-Phe+and+Leu-Asp-Val+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs.</a> Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).</li>
<li>Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+functionalized+self-assembled+peptide+hydrogels+in+in+vitro+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis.</a> Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).</li>
<li>Pérez-Pedroza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+lumen-forming+colorectal+cancer+organoids+using+a+newly+designed+laminin-derived+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).</li>
<li>Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+differentiation+and+lumen+formation+in+colorectal+cancer+cell+lines+and+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors.</a> Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).</li>
<li>Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+colorectal+cancer-derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Pachitariu, M., Stringer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose+2.0%3A+how+to+train+your+own+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose 2.0: how to train your own model.</a> Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+a+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
<li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li>
<li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate adhesion assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+frontal+and+rear+cell-substrate+adhesions+in+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).</li>
<li>Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+scaffold-free+3D+organoid+model+to+study+neoplastic+progression+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).</li>
<li>Puschhof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid+cocultures+with+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid cocultures with microbes.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).</li>
<li>Matthews, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrganoID%3A+A+versatile+deep+learning+platform+for+tracking+and+analysis+of+single-organoid+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics.</a> PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+%C3%97+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).</li>
<li>Bergdorf, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+cancer+spheroids+and+fine-needle+aspiration-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).</li>
<li>Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+hydrogels+to+engineer+3D+cell+microenvironments+for+cell+constructs+formation+and+precise+oncology+remodeling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer.</a> Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).</li>
<li>Yadav, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide-based+hydrogel+for+the+healing+of+critical+bone+defects+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).</li>
<li>Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+from+self-assembling+tetrapeptides+support+3D+spreading%2C+osteogenic+differentiation%2C+and+angiogenesis+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells.</a> Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).</li>
</ol>

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

SAP'lerin biyomedikal araştırmalardaki büyük potansiyeli, biyoişlevselleştirme yoluyla dövülebilirlikleri ve uyarlanabilirlikleri ile vurgulanmaktadır. Bu kadar geniş bir permütasyon dizisiyle, özellikle organoid araştırmalarında, belirli uygulamalar için en umut verici konfigürasyonların verimli bir şekilde test edilmesi ve belirlenmesinde zorluk ortaya çıkmaktadır. Hızlı, uygun maliyetli bir çözüm çok önemlidir. İnsan kolorektal adenokarsinomundan türetilen SW1222 hücre hattı, bu tür yoğun bir değerlendirme için çok önemli bir aday olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, peptit bazlı bir matriste yetiştirilen organoidlerin değerlendirilmesi ve karakterizasyonu için bir yöntem sunduk. Bu protokol, canlılık ve proliferasyon değerlendirmeleri, adezyon deneyleri, şekil analizi ve immünositokimya kullanarak organoidlerin izlenmesi ve analizine odaklanan bütünleştirici, uygun maliyetli bir strateji vaat etmektedir. Hücre kültürü deneylerimizde değişen peptit konsantrasyonlarının seçimi, belirli deneysel hedeflerle uyumlu olan ve peptit matrisleri bağlamında organoid kültürü anlamamızı ilerletmeye önemli ölçüde katkıda bulunan, dikkatlice düşünülmüş bir mantıkla desteklenmektedir. Araştırma yolculuğumuz zaman içinde gelişti ve farklı formülasyonları keşfetmek için farklı bir yaklaşım gerektirdi. İlk olarak, 1.5 mg / mL ila 4.5 mg / mL arasında bir dizi peptit konsantrasyonunun kullanılması, potansiyel sonuçların bir spektrumunu araştırma arzusuyla motive edildi. Daha düşük konsantrasyonlar kullanarak, organoid büyümesini ve gelişimini etkili bir şekilde desteklemek için gereken minimum peptit konsantrasyonunu değerlendirmeyi amaçladık. Bu bilgiler, uygun maliyetli, minimum kaynak kullanan uygulamaların fizibilitesini anlamak için hayati önem taşır. Tersine, peptit konsantrasyonunun üst sınırlarını ve organoid davranış üzerindeki potansiyel etkisini incelemek için daha yüksek konsantrasyonlar seçildi, doygunluk etkileri ve aşırı peptit konsantrasyonlarının potansiyel dezavantajları ile ilgili soruları ele aldı.
İkincisi, belirli deneysel hedefler seçimlerimize rehberlik etti. Örneğin, hücre yapışmasını araştırırken, stres altında hidrojelin kırılmasını azaltmak için peptit konsantrasyonları kullanıldı. Tersine, uzun süreli canlılık ve doku olgunlaşmasına odaklanan çalışmalarda, hala bir jel sağlarken mümkün olan en düşük reolojik değerleri elde etmek için daha düşük konsantrasyonlar kullanıldı. Ayrıca, benzer formülasyonlar kullanıldığında organoid kültür üzerinde zaman içinde elde edilen çeşitli profilleri göstermek için proliferasyon değerleri seçilmiştir. Bu farklı yaklaşımın önemi, geniş bir koşul ve sonuç yelpazesini kapsayan kapsamlı bir veri seti sağlama kapasitesinde yatmaktadır. Farklı peptit konsantrasyonlarının organoid kültür üzerindeki etkilerini inceleyerek, matris özellikleri ve organoid davranış arasındaki nüanslı etkileşimi daha iyi anlayabiliriz.
İlk değerlendirme, SW1222 hücrelerinin ilerlemesinin, parlak alan görüntüleme kullanılarak 24 oyuklu bir plakada bir hafta boyunca izlenmesini içerir. Morfolojinin ve hücre yoğunluğunun genel analizi, hücre hattına uygulanan organoid hatları9 için rutin bir tekniktir. Bu protokolün non-invaziv doğası, hücre kültürünün kesintisiz olarak gözlemlenmesine izin vererek, her bir koloni için morfolojik değişiklikler ve hücre yoğunluğu hakkında önemli verileri yakalamamızı sağlar. Bu ilk analiz, ultra kısa kendi kendine birleşen peptit matrisinin uygunluğu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu gözlemler, peptit matrisinin kolorektal kanser organoidlerinin gelişimini ve büyümesini desteklemek için etkili bir iskele olarak uygunluğunu gösteren daha derinlemesine analizler için temel oluşturur. Ayrıca, her kolonideki büyüme ve değişikliklerin izlenmesinden ilginç gözlemler ortaya çıkabilir. Örneğin, Şekil 4'te, Matrigel'de büyüyen kolonilerin birbirleriyle çarpışabileceğini gözlemleyebiliriz, ancak bir sınırın tutarlı bir şekilde korunduğu görülmektedir. Bununla birlikte, Peptitlerde kültürlenen hücreler, peptiti, 7. güne kadar hücre konumları tam olarak öncekiyle aynı olmayacak şekilde yeniden düzenler. Bu, bu protokolün organoidlerin büyümesini etiketleyecek ve takip edecek otomatik bir sisteme aktarılması durumunda dikkate alınması gereken bir şeydir.
Daha sonraki inceleme, kalsein ve etidyum homodimerine dayalı bir canlılık testi kullanılarak hücre canlılığının ve proliferasyonunun değerlendirilmesini içerir. Canlılık testi, ölü hücrelere kıyasla canlı hücrelerin popülasyonu hakkında niteliksel bilgi sağlayacaktır. Proliferasyon testi, hücre bölünmesini değerlendirmek için hücrelerin metabolik durumu hakkında nicel bilgi sağlayacaktır31. Bunlar, hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan standart tahlillerdir ve hücrelerin proliferatif durumuna genel bir bakış sağlar. SAP matrislerinin biyouyumlu olduğu kapsamlı bir şekilde gösterilmiş olsa da, organoidlerin, içine gömüldükleri matris de dahil olmak üzere optimal olmayan kültür koşulları nedeniyle azalmış canlılık sergiledikleri bilinmektedir. Ayrıca, peptit matrislerinin mekanik özellikleri hücre canlılığını etkileyebilir. Matris çok sert veya sertse, hücreleri mekanik strese maruz bırakabilir ve bu da potansiyel olarak hücre hasarına yol açabilir. Tersine, matris çok yumuşak veya kararsızsa, hücre yapışması ve hayatta kalması için yeterli destek sağlayamayabilir. Ek olarak, peptitlerde bulunan biyoaktif motifler veya fonksiyonel gruplar, spesifik hücre reseptörleri veya sinyal yolları ile etkileşime girebilir ve bu da potansiyel olarak hücre ölümüne neden olabilir. Bu nedenle, hücre canlılığını ve çoğalmasını sürekli olarak izlemek çok önemlidir.
Daha önceki çalışmalarda25, Peptit 1 ve Peptit 2, Matrigel ile karşılaştırıldığında benzer hücre ölümü seviyeleri göstermiştir (Şekil 5). Bununla birlikte, ana peptitteki hücrelerin proliferasyon profillerinde değişen konsantrasyonlarda dalgalanmalar gözlenmiştir. Özellikle, 4. günden 7. güne kadar olan çoğalma oranı artmak yerine sabit kaldı, bu da hücrelerin daha az aktif bir aşamaya girebileceğini düşündürdü. Ayrıca, 4. gün ile 7. gün arasında gözlemlenen hücre canlılığındaki değişiklikler de nispeten tutarlı kaldı ve bu da büyüme ve üremede potansiyel bir platoya işaret etti.
Değerlendirme ve karakterizasyona devam etmek için, hücre ayrılma etkilerini değerlendirmek için mekanik strese dayanan 3D kültüre uyarlanmış bir yapışma testi kullandık32. Mekanik stresi indükleme yöntemi, hidrojelin mekanik özelliklerine göre seçilmelidir. Yöntemin etkinliği, doğası gereği seçilen model sistemine bağlıdır ve elde edilen içgörüler, biyolojik bağlamı ne kadar iyi temsil ettiğine bağlıdır. Yapışma ve organoid özelliklerdeki değişkenlik, hidrojel bileşimi ve nanoliflerin yapışkan özellikleri gibi faktörlerden etkilenebilen çok sayıda fiziksel ve kimyasal etkileşimden kaynaklanabilir. Bu faktörler, bulgularımızın genellenebilirliğini etkileme potansiyeline sahiptir33. Bununla birlikte, okuyucu bu protokolü daha sert veya oldukça sünek hidrojeller için uyarlayacaksa, daha sağlam bir stresleme yöntemi kullanmayı düşünün.
Bu tekniği, biyofonksiyonel motif tarafından SAP'ye sağlanan genel yapışkanlığı değerlendirmek için kullandık (Şekil 6). İki fenomen gözlemledik. İlk olarak, peptitler değişen başlangıç yapışkan özellikleri sergiledi. Spesifik olarak, yüksek konsantrasyonda biyofonksiyonelleştirilmiş peptit içeren IKVAV motifi ve hidrojellerin, hücreleri yüzey alanlarının %40'ından fazlasına yapıştırdığı bulundu. İkincisi, indüklenmiş stresin uygulanmasından sonra, bazı peptitler önemli bir yapışık hücre kaybı yaşadı. Özellikle, tutma kapasitesi, biyo-işlevselleştirilmemiş peptitin yüksek konsantrasyonlarını içeren peptitlerde nispeten yüksekti. Böylece, IKVAV ligandı ve SAP, hücrelerin matrise farklı tipte yapışması sunar. Bu yöntem, desenlerin bulunmasına ve malzeme için yapışma mekanizmasının aydınlatılmasına izin verir. Malzemelerin ve biyolojik numunelerin yapışma özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlayan, bir prob ucu ile bir numune yüzeyi arasındaki yapışma kuvvetlerini nano ölçekte araştırmak için kullanılabilen atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak yapışkanlık ölçümü gibi başka teknikler de kullanılabilir.
Çeşitli peptit materyallerinin organoid oluşumunu indükleme kapasitesi, koloni daireselliği ve bu tür peptit hidrojellerde yetiştirilen organoidlerin nispi lümen alanı vasıtasıyla değerlendirildi. Dairesellik, bir nesnenin yuvarlaklığını veya şeklini ifade eder. Organoidler bağlamında, yapının morfolojisini ve simetrisini değerlendirmek için dairesellik kullanılabilir. Birkaç çalışma, organoidlerin dairesel morfolojilerinden bahsetmiştir. Örneğin, meme kanseri organoidleri, kordon benzeri bazolateral periferiklere sahip katı dairesel morfolojilere sahip olma eğilimindedir34. Bu, döngüselliğin organoidlerin şeklini değerlendirmek için bir parametre olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Lümen boyutu, bir organoid içindeki merkezi boşluğu veya boşluğu ifade eder. Organoidin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını yansıttığı için önemli bir özelliktir. Farklılaşma işlemi sırasında, organoidler lümen boyutunda bir azalmaya ve epitel tabakasının35 kalınlığında bir artışa uğrar. Bu, lümen boyutunun organoidin gelişim aşamasının bir göstergesi olarak kullanılabileceğini gösterir. Dairesellik ve lümen boyutunun değerlendirilmesi, organoidlerin yapısal ve işlevsel özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. İyi tanımlanmış lümenlere sahip dairesel organoidler, doğal doku mimarisini daha iyi temsil eder ve organ fonksiyonunu daha iyi taklit edebilir36.
Bu özellikler, daha önce boyanmış numunelerden hücre iskeletinin ve çekirdeklerin floresan görüntüleri elde edilerek değerlendirilebilir. Görüntüler Cellpose kullanılarak bölümlere ayrıldı ve elde edilen maskelerin şekil ölçümleri ImageJ kullanılarak elde edildi. Hücre iskeleti ile boyanmış numunelerin 4 günlük kültürden sonra yapılan şekil analizi, organoid özellikleri daha da ortaya çıkardı. Şekil analizine ve görüntü analizi ile organoidin özelliklerinin belirlenmesine dayalı olarak organoidlerin çevrelerine tepkilerini belirlemek için öncelikle parlak alan görüntülemeye odaklanan benzer yöntemler kullanılmıştır 36,37,38. Son olarak, çeşitli polarite belirteçleri ile hücre polaritesini değerlendirmek için immünositokimya kullandık. Özellikle, bir peptit hidrojelin kullanılması, matrisin çıkarılmasını ve organoidlerin alınmasını gerektirmediğinden, numunenin işlenmesini azaltacaktır39.
Bu yöntemin önemi, peptit hidrojellerin organoid kültür için matrislere çevrilmesine izin veren yöntemler geliştirmek için diğer hayvan türevli matrislere kıyasla biyofonksiyonel SAP hidrojellerinin çok yönlülüğüne dayanır. Ultra kısa kendiliğinden birleşen peptit matrisini Matrigel veya kollajen gibi geleneksel matrislerle karşılaştırmak çok sayıda avantaj ortaya koymaktadır. İlk olarak, peptit matrisi, peptit dizisi hassas bir şekilde kontrol edilebildiği ve sentezlenebildiği için üstün tekrarlanabilirlik sunar, bu da farklı partiler arasında tutarlı özellikler ve performans sağlar40. Ek olarak, mekanik özellikler ve bozulmaya karşı direnç açısından yüksek stabilite sergiler, uzun süreler boyunca yapısal bütünlüğü korur ve organoid büyümesi için stabil bir mikro ortam sağlar41. Ayrıca, ultra kısa peptit matrisi, mikro ortamın hassas kontrolünü ve ince ayarını sağlar. Peptit dizisi, hücre farklılaşması için istenen ipuçlarını sunarak spesifik biyoaktif motifleri veya fonksiyonel grupları içerecek şekilde modifiye edilebilir42.
Özetle, yöntemin önemi, organoid kültürü teşvik etmek için peptit bazlı hidrojellerin rasyonel tasarımını bilgilendirme potansiyelinde yatmaktadır. Hücre davranışlarını sistematik olarak değerlendiren bu protokol, organoid büyümesini optimize etmek için umut verici peptit bileşimlerinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu tür içgörüler, organoid tabanlı çalışmaların ve rejeneratif tıp yaklaşımlarının ilerlemesine katkıda bulunarak daha geniş araştırma alanlarına yayılmaya hazırdır.

Son yıllarda, kendi kendine birleşen peptitler (SAP'ler), doku mühendisliği uygulamaları için umut verici biyomalzemeler olarak ortaya çıkmıştır. SAP'ler, nanoliflerin kendiliğinden oluşumu, biyouyumluluk, biyolojik olarak parçalanabilirlik ve immünojenisite olmama gibi benzersiz özelliklere sahiptir ve bu da onları iskele geliştirme için çekici adaylar haline getirir1. SAP'ler daha önce çeşitli hücre tipleri ile birlikte kullanılmıştır ve özellikle, bildirilen ultra kısa SAP'ler, 30'dan fazla geçişi kapsayan ve minimum kromozomal anormallik insidansı ile uzun süreler boyunca pluripotentliklerini korurken kök hücrelerin kapsüllenmesini kolaylaştırmıştır 2,3,4. Bu nedenle, SAP'lerin organoid kültürde kullanımları için uyarlanması rasyonel bir sonraki adımı oluşturmuştur.
Organoidler, tek pluripotent hücrelerden ortaya çıkan karmaşık üç boyutlu yapılardır. Bu yapılar, daha sonra embriyonik ve doku büyümesinin gelişimsel süreçlerini in vitro5 çoğaltmak için kendi kendini organize eden çeşitli hücre tiplerine yol açar. Bu yenilikçi çerçeve, in vivo organların karakteristik genetik, fenotipik ve davranışsal özelliklerini verimli bir şekilde koruyarak in vitro araştırmalar için zorlu bir araç haline gelmiştir6. Bununla birlikte, organoid bazlı bulguların tezgahtan başucuna geçişindeki temel bir engel, tekrarlanabilirlik ihtiyacıdır7. Sonuçlardaki bu varyasyon, öncelikle, otantik doku mimarisinin olmaması ve organoid modellerde karşılaşılan doğal karmaşıklık ile birleşen, insan pluripotent kök hücrelerini özel hücre soylarına tam olarak ayırt etmenin zorluğuna atfedilir. Kök hücre ve organoid bazlı çalışmaların8 popülaritesindeki artış göz önüne alındığında, dinamik mekanik özelliklere ve integrin benzeri yapışma bölgelerine veya kontrollü bozunabilirliğe sahip iskelelere sahip biyomalzemelere yönelik artan bir talep olmuştur 7,9. Bu özellikler, biyoişlevselleştirilmiş SAP'lerin stratejik kullanımı yoluyla etkili bir şekilde ayarlanabilir.
SAP'ler, iyi tanımlanmış yapılar halinde kendiliğinden organize olma yeteneğine sahip kısa amino asit dizileridir10. Bu peptitler genellikle, hidrojen bağı, elektrostatik etkileşimler ve hidrofobik etkiler11,12 dahil olmak üzere kovalent olmayan etkileşimler yoluyla kendi kendine montajlarını sağlayan alternatif hidrofobik ve hidrofilik kalıntılar içerir. Bu peptitlerin kendi kendine toplanma süreci, öncelikle sistemin serbest enerjisini en aza indirme ihtiyacından kaynaklanmaktadır. Sulu bir ortamdayken, hidrofobik kalıntılar suya maruz kalmalarını en aza indirmek için bir araya toplanma eğilimindeyken, hidrofilik kalıntılar çevredeki su molekülleri ile etkileşime girer. Bu fenomen çeşitli nanoyapıların oluşumuna yol açar. Bu durumda, ultra kısa kendi kendine birleşen peptitler, peptit dizisine ve çevresel koşullara bağlı özelliklere sahip nanolifler oluşturur 2,12,13,14,15,16. Bu peptitler, tek tek peptit ipliklerinin birbirine paralel veya antiparalel hizalandığı ve hidrojen bağları ile stabilize edildiği β dönüşlü bir konformasyonu benimser (Şekil 1). Pozitif iyonların varlığı, nanolif oluşumuna yol açan kendi kendine birleşme işlemlerini hızlandırır.
Peptit nanofiberlerin, önemli miktarda suyu hapsetmek için doğuştan gelen bir yeteneğe sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu özellik, daha sonra hücresel çoğalma ve büyümeye elverişli biyouyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilen üç boyutlu bir alan olarak ortaya çıkan bir hidrojelin oluşumunu kolaylaştırır. Bu kendi kendine birleşen peptit nanofiberler, doğal hücre dışı matris (ECM) ortamına özgü topografik özellikleri karmaşık bir şekilde taklit eder1. Bu benzerlik, hücrelere fizyolojik yaşam alanlarını taklit eden bir ortam sağlar ve optimal hücresel aktiviteleri daha da teşvik eder17. Ayrıca, bu peptitlerin doğasında bulunan çok yönlülük, önemli ölçüde ayarlanabilirliğe izin verir4. Bu tür bir uyarlanabilirlik, matrisin sertlik, jelleşme kinetiği ve gözeneklilik gibi özelliklerinde değişiklikler yapılmasını sağlar. Bu adaptasyonlar, peptit dizisinde yapılan modifikasyonlar yoluyla elde edilir. Sonuç olarak, kendiliğinden birleşen peptitler (SAP'ler), çağdaş biyomateryal biliminde çok önemli bileşenler olarak ortaya çıkmış ve doku rejenerasyonu ve hücresel kültür için yaygın olarak iskele olarak kullanılmıştır13,17.
Kendi kendine birleşen peptitlerin kritik avantajlarından biri, moleküler düzeyde kolayca sentezlenebilme ve modifiye edilebilme yetenekleridir. Bu avantaj, spesifik fonksiyonel grupların veya biyoaktif motiflerin peptit dizisine dahil edilmesine izin vererek, özel özelliklere ve işlevlere sahip peptitlerin tasarımını mümkün kılar 18,19,20 (Şekil 1B). Örneğin, biyo-işlevselleştirilmiş SAP'ler, ECM'yi taklit etmek ve RGD peptidi19,21 kullanılarak farklılaşmayı teşvik etmek için tasarlanabilir. Peptit Ben-IKVAV'ın ayrıca ligand'a özgü motiety22 nedeniyle nöronal spesifik belirteçlerin ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdığı bildirilmiştir. Bu peptitler ayrıca, hücre sağkalımını artırmak için integrin bağlayıcı peptitler gibi biyoaktif molekülleri gösterecek şekilde tasarlanabilir23. Son olarak, yapılarına IKVAV ve YIGSR motiflerini dahil ederek anjiyogenezi teşvik etmek için diğer biyofonksiyonelleştirilmiş SAP'ler geliştirilmiştir24.
Daha önceki bir yayında bildirilen biyoişlevselleştirilmiş SAP'ler, kendi kendine montajın, biyoişlevselleştirilmiş SAP'nin türetildiği saf peptit dahil edilerek daha da modifiye edilebileceğini göstermektedir25. Bu SAP karışımları, biyokimyasal aktivitelerine ve fizikokimyasal özelliklerine göre değişen çok çeşitli SAP formülasyonları da sağlayabilir. Örneğin, amfifilik peptit IIFK, IKVAV motifinin dahil edilmesiyle örneklenen, çeşitli motiflerle biyoişlevselleştirmeye dayanabilen ultra kısa bir SAP'dir (Şekil 1B). Her iki peptit de hem tek başına hem de kombine olarak nanolifler oluşturabilir. Her formülasyon, farklı fiziksel özelliklere sahip hidrojellerle sonuçlanır (Şekil 2)
Bununla birlikte, SAP'lerin biyoişlevselleştirilmesinden elde edilen çok çeşitli potansiyel permütasyonlar ve alternatifler nedeniyle, organoid testi için hızlı ve uygun maliyetli bir seçenek sunmaya ihtiyaç vardır. Bu tür yoğun ve uygun maliyetli organoid değerlendirmesi için bir aday, insan kolorektal adenokarsinomundantüretilen SW1222 hücre hattıdır 26,27. SW1222 hücreleri, organoidlere benzeyen 3 boyutlu yapılar halinde toplanmalarını sağlayan özelliklere sahiptir, bu da onları doku gelişimi ve rejeneratif tıp uygulamalarını incelemek için ideal bir model haline getirir. SW1222 hücrelerinin, LGR5 geni27'nin içsel aşırı ekspresyonu nedeniyle organoid üretme yeteneğine sahip olduğu tespit edilmiştir. Bireysel LGR5 + kök hücrelerinden organoidlerin yaratılması, SW1222 hücrelerinin bir kolorektal kanser organoidinin morfolojik özelliklerini elde etme eğiliminin yanı sıra daha önce ikna edici bir şekilde sergilenmiştir28.
Bu yöntem makalesinde, SW1222 hücreleri kullanılarak çeşitli biyofonksiyonel peptitlerin hücre yapışması ve lümen oluşumu üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz (Şekil 3). Adım adım prosedürler ve görüntüleme analiz yöntemleri sağlayarak, organoidlerin biyofabrikasyonu ve organoid kültürü için basit SAP matrislerinin değerlendirilmesi hakkında değerli bilgiler sunmayı umuyoruz.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka, doku kültürü ile tedavi edilmiş</td><td>Corning</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>%16 Formaldehit (a/h), Metanol içermeyen</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka, doku kültürü ile tedavi edilmiş</td><td>Corning</td><td>09-761-146</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu siyah plaka, doku kültürü ile tedavi edilmiş</td><td>Corning</td><td>07-200-565</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue Hücre Canlılık Reaktifi</td><td>İnvitrojen</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ezrin antikoru, tavşan monoklonal</td><td>Abcam</td><td>ab40839</td><td>İkincil kullanılmış: tavşan önleyici Dylight 633</td></tr><tr><td>Anti-pan Cadherin antikoru, tavşan poliklonal</td><td>Abcam</td><td>ab16505</td><td>İkincil kullanılmış: anti-tavşan Alexa 488</td></tr><tr><td>Anti-ZO1 sıkı bağlantı antikoru, keçi poliklonal</td><td>Abcam</td><td>ab190085</td><td>İkincil kullanılan: keçi önleyici Alexa 488</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cellpose 2.0</td><td>NA</td><td>NA</td><td>,</td></tr><tr>Airyscan <td>ZEISS LSM</td><td>880</td><td></td>DAPI Invitrogen<td>ile https://github.com/MouseLand/cellpose Konfokal Lazer Tarama Mikroskobundan</td></tr> Elde Edilmiştir <tr><td></td><td></td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Keçi IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>İnvitrojen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Cytiva</td><td>GE17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, DyLight 633</td><td>Invitrogen</td><td>35562</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Fetal Sığır Serumu (HI FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.54f</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite Kiti, memeli hücreleri için</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür, hekzahidrat (MgCl2 6 H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Organoid Kültür için Matrigel, fenol kırmızısı içermeyen</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>El yazmasında Matrigel veya bazal membran matrisi olarak anılacaktır.</td></tr><tr><td>Mikroskop, parlak alan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu, EVOS</td><td>Thermo Scientific</td><td>EVOS M7000</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2023 (64 bit) 10.0.0.154</td><td>OriginLab Corp</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peptit P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)</td><td>Laboratuvar yapımı</td><td>NA</td>, <td>peptit ile özel olarak üretilebilir Bachem gibi üreticiler.</td></tr><tr><td>Peptit P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)</td> <td>Laboratuvar yapımı</td><td>NA</td>, <td>Bachem gibi peptit üreticileri tarafından özel olarak üretilebilir.</td></tr><tr><td>Peptit P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2)</td> <td>Laboratuvar yapımı</td><td>NA</td>, <td>Bachem gibi peptit üreticileri tarafından özel olarak üretilebilir.</td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak Kapak Kayması, 10 mm çap</td><td>VWR</td><td>631-0170</td><td></td></tr><tr><td>Taramalı Elektron Mikroskobu</td><td>Thermo Fisher - FEI</td><td>TENEO VS</td><td></td></tr><tr><td>Steril 30 & mu; m süzgeç</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SW1222 hücre hattı</td><td>ECACC</td><td>12022910</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA %0,25</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure su</td><td>Canlandırıcı</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

ultra kısa kendi kendine birleşen peptit matrisinde sw1222 hücre hattından kolorektal kanser organoidlerinin İmalatı ve karakterizasyonu

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

Ultra kısa kendi kendine birleşen peptitler (SAP'ler) kendiliğinden hücre dışı matrise benzeyen nanofiberler oluşturabilir. Bu lifler, biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen ve immünojenik olmayan hidrojellerin oluşumuna izin verir. SAP'lerin, protein türevi motiflerle biyoişlevsel hale getirildiğinde, kolorektal organoid oluşumunu destekleyen hücre dışı matris özelliklerini taklit edebileceğini daha önce kanıtlamıştık. Bu biyofonksiyonel peptit hidrojeller, hücre-matris etkileşimlerinin hücre yapışmasını artırmasına izin veren ipuçlarını içerirken, orijinal ana peptitin mekanik özelliklerini, ayarlanabilirliğini ve yazdırılabilirliğini korur. Bu makale, kolorektal kanser organoidleri oluşturabilen bir adenokarsinom kanser hücre hattı kullanarak çeşitli biyofonksiyonel peptit hidrojellerin hücre yapışması ve lümen oluşumu üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve karakterize etmek için gereken protokolleri sunmaktadır. Bu protokoller, immün boyama ve floresan görüntü analizi kullanılarak hücre yapışması ve luminal oluşumu üzerindeki biyofonksiyonel peptit hidrojel etkilerinin değerlendirilmesine yardımcı olacaktır. Bu çalışmada kullanılan hücre dizisi, daha önce hayvan türevli matrislerde organoidler üretmek için kullanılmıştır.

İlk olarak, 24 oyuklu bir plakada büyütülen hücreleri 7 gün boyunca parlak alan görüntüleme kullanarak değerlendirdik. Şekil 4'te görüldüğü gibi, hafta boyunca organoidlere bir araya gelen küçük hücre kümelerini belirledik. Kontrollü bir tarama yöntemi, hücrelerin ve organoidlerin farklı günler arasındaki hareketliliğini takip edebilir. Genel olarak, tüm hafta boyunca hücrelerin morfolojisinin evrimine baktık. SW1222'den türetilmiş organoidler yuvarlak bir morfolojiye ve hafif bir görünüme sahip olmalıdır. Daha koyu bir görünüm, 7. gün Peptit P'de kültürlenen bazı kolonilerde görüldüğü gibi, istenmeyen daha yüksek bir hücre yoğunluğunu gösterir (Şekil 4).
Şekil 5 , sırasıyla ölü ve canlı hücrelerin miktarına ve metabolik aktiviteye işaret eden hücre canlılığı (Şekil 5A) ve proliferasyon testlerinin (Şekil 5B) sonuçlarını göstermektedir. Burada, kalsein ve etidyum homodimer bazlı bir canlılık testi kullandık ve bu hücrelerin Matrigel'de kültürlendiğinde 7. güne kadar küçük bir ölü hücre popülasyonu gösterdiğini fark ettik. Bu fenomen aynı zamanda tüm peptit bazlı hidrojellerde de mevcuttu, ancak 2D kültürde değildi. Proliferasyon sonuçları, 1. gün ile 7. gün arasında metabolik aktivitede toplam bir artış gösterdi. Ayrıca, çeşitli koşullar için 4. gün ile 7. gün arasında aktivitede hafif düşüşler bulduk. Bu gözlem, canlılık testinde görülen ölü hücre popülasyonundaki artışla ilişkilidir (Şekil 5A).
Hücreler arasındaki etkileşimin ve peptit hidrojellerin biyofonksiyonelleştirilmesinin bir ön değerlendirmesi için, hücre ayrılmasını indüklemek için mekanik strese dayalı bir yapışma testi gerçekleştirdik. Şekil 6'da görülebileceği gibi, biyofonksiyonel peptit P2'nin farklı konsantrasyonlarının kullanılması, ayrılma işleminden önce ve sonra tutulan hücre sayısını önemli ölçüde etkilemiştir. Burada, pozitif kontrol olarak sadece peptit P2'nin biyofonksiyonel motifini içeren bir peptit kullandık. Ayrıca biyofonksiyonel olmayan peptit P'yi negatif kontrol olarak kullandık. Grafikte görülebileceği gibi, peptit P'ye ekilen hücreler, nispeten düşük bir başlangıç yapışmasının yanı sıra düşük bir tutma değerine sahipti. Ayrıca, biyofonksiyonel peptit P2'nin oranındaki değişiklik, stresten sonra tutulan hücre miktarı ile ilişkilendirildi. Bu nedenle, bu tahlili kullanarak, P2 peptidinin, biyofonksiyonel motif tarafından yönlendirilebilen veya yönlendirilmeyen, ancak karışımda bulunan biyofonksiyonel peptit miktarı ile ilişkili olan hücre yapışmasını etkilediği sonucuna varabiliriz.
Daha sonra, fabrikasyon organoidlerdeki matrislerin etkisini araştırdık. Koloninin daireselliğini ve lümenin nispi boyutunu, 4 gün boyunca kültürlenen hücre iskeleti lekeli örneklerin şekil analizini yaparak koloninin boyutuna göre değerlendirdik. Veri noktaları, x ve y eksenleri boyunca belirli bir dağılıma sahipti ve her koşul, dairesellik ve göreceli lümen alanı için belirli bir değere sahip bir merkeze sahipti. Şekil 7 , 2D olarak kültürlenen hücrelerin koloni daireselliğinde çok yüksek bir varyasyona sahip olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, Matrigel'de kültürlenen hücreler, lümenin nispi boyutu için daha geniş bir dağılıma sahipti.
İlginç bir şekilde, peptit içeren tüm hidrojeller için sentroid değerler çok benzer bir konuma sahipti. Ancak, veri noktaları arasındaki mesafe farklı dağılım profilleri gösterdi. Örneğin, P3 peptidi, üç peptit hidrojel arasında daha küçük bir dağılıma sahipken, biyofonksiyonel olmayan peptit P'den gelen veri noktalarının daha büyük bir dağılıma sahip olduğu görülmüştür. Bu veriler, hem P1 hem de P3 içeren hidrojellerin organoid kültür için optimize edilme potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir.
Son olarak, apikal belirteçler ZO-1 ve ezrin için boyanmış bir örnek üzerinde immünositokimya kullanarak spesifik belirteçlerin ekspresyonunu değerlendirdik. Bu belirteçler, her bir organoid içindeki hücrelerin polarizasyonunun değerlendirilmesine izin verdi. Ayrıca hücre-hücre bağlantılarını görselleştirmek için pan kaderin belirteçlerini ve lümeni görselleştirmek için hücre iskeletine özgü bir belirteç (falloidin) değerlendirdik. Şekil 8A , biyofonksiyonel olmayan peptit P, biyofonksiyonelleştirilmiş peptit P1 ve Matrigel'de 4. ve 7. günde bulunan organoidleri göstermektedir. ZO-1 ve ezrin belirteçleri, organoidin apikal ve bazolateral membranları içinde lokalize edilmelidir; Uygun hücre polarizasyonu, her iki molekülün ekspresyonunu 4. güne kadar lümen alanının yakınında, aksi takdirde görünmez olarak gözlemlememize izin verecektir. Gerçekten de, Şekil 8'de görüldüğü gibi, ZO-1 ve ezrin belirteçleri, Matrigel'de kültürlenen organoidlerin apikal zarlarında bulunuyordu. İlginç bir şekilde, ezrin belirteçleri, biyofonksiyonel olmayan peptit P'de zar zor görülebiliyordu. Bundan, hücrelerin verimsiz polarizasyonunun, bu moleküllerin peptit P'de düşük bir ekspresyonu ile sonuçlandığı sonucuna varıyoruz.
Ayrıca, çekirdeklerin dağılımı peptit hidrojellerinde düzensiz olma eğilimindeyken, Matrigel'e gömülü organoidler tek, asimetrik bir çekirdek tabakası oluşturdu. Bu tanım, kolorektal bir organoid için ideal morfolojiyle eşleşir; bununla birlikte, peptit hidrojellerinde çekirdeğin oryantasyonu tamamen asimetrik olmasa da, çok katmanlı çekirdeğe sahip daha yoğun koloniler esas olarak biyofonksiyonel olmayan peptit P'de bulundu. Buna karşılık, hücre-hücre bağlantıları apikal ve bazolateral membranlara dik olarak lokalize edilmelidir (Şekil 8B). Bu işaretleyici, koloni içinde bulunan tüm hücrelerin kenarlarını gözlemlememizi sağladı. Matrigel'de büyütüldüğünde, hücreler 7. güne kadar neredeyse mükemmel bir radyal pan-kaderin (hücre-hücre bağlantıları) dağılımına sahipti. Buna karşılık, peptit P'dekiler gibi polarize olmayan koloniler, düzensiz bir hücre düzenlemesi ve bazal ve apikal zarın yakınında hücre-hücre bağlantılarının ekspresyonu sundu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig01.jpg"> Şekil 1: Nanolifleri oluşturan ultra kısa kendiliğinden birleşen peptitler. (A) Alifatik ultra kısa peptitler için kendi kendine birleştirme işleminin tasviri. (B) IKVAV ligandı ile biyofonksiyonelleştirilmiş ultra kısa SAP IIFK'nın kimyasal yapısı. Bu rakam Loo ve ark.4'ten değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig02.jpg"> Şekil 2: Peptitlerin yapısı ve özellikleri. (A) Ana peptit IIFK'nın ve biyofonksiyonel peptit P2'nin kimyasal yapıları gösterilmiştir. (B) Ters çevrilmiş flakon testi sonuçları, kritik jelleşme konsantrasyonunu ve jelleşme süresi farklılıklarını ortaya çıkarır. P2, ana peptit IIFK'den daha yüksek bir CGC'ye sahip yarı saydam bir jel oluşturur. Özellikle, IIFK: P2 (1: 1) karışımı, tek başına her iki peptitten daha yüksek bir CGC ve daha uzun jelleşme süresi sergiler. (C) Taramalı elektron mikrografları, IIFK, P2 ve IIFK:P2 (1:1) karışımının yapısal özellikleri hakkında görsel bilgiler sağlar. (D) Atomik kuvvet mikroskobu yükseklik topografya görüntüleri, jelleşmiş peptitleri 8 mM'lik bir konsantrasyonda göstererek, yüzey özelliklerinin ayrıntılı bir görünümünü sunar. (E) Dairesel dikroizm spektroskopisi, IIFK:P2 karışımının çeşitli konsantrasyonlardaki konformasyonel değişikliklerini ortaya çıkararak ikincil yapı değişikliklerine ışık tutar. (F) Reolojik analizler, jelleşmiş peptitlerin farklı konsantrasyonlardaki sertliğini ölçer ve mekanik özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Bu rakam Perez-Pedroza ve ark.25'ten alınmıştır. Ölçek çubukları = 1 μm (C), 200 nm (D). Kısaltma: CGC = kritik jelleşme konsantrasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig03.jpg"> Şekil 3: Peptit hidrojellerde canlılık, yapışma, organoid oluşturma kapasitesi ve immünoboyama ile organoid üretimi ve karakterizasyonu için peptit hazırlama ve hücre tohumlamayı gösteren diyagram. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig04.jpg"> Şekil 4: Matrigel kontrolü ile karşılaştırıldığında P ve P1 olarak etiketlenmiş peptit hidrojeller içinde yetiştirilen SW1222 hücrelerinden yakalanan parlak alan mikroskobu görüntüleri. İlginç bir şekilde, peptit hidrojellerinde kültürlenen organoidler, yedinci güne kadar ağırlıklı olarak küresel bir morfoloji gösterir. Buna karşılık, Matrigel içinde yer alanlar, SAP'deki organoid kültürünün karanlık gövdesine (siyah ok uçları) kıyasla, parlak gövdeleri tarafından söylenebilecek daha düşük bir hücre yoğunluğu sergiliyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, bitişik koloniler arasında belirgin bir kümelenme sergilerler. Ayrıca, Matrigel ortamındaki hücrelerin göç kapasitesinin nispeten azaldığı ortaya çıkmaktadır. Ölçek çubukları = 650 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig05.jpg"> Şekil 5: Çeşitli konsantrasyonlarda biyofonksiyonelleştirilmiş SAP'de SW1222 hücrelerinin canlılık ve proliferasyon deneyleri. (A) Biyofonksiyonel peptit P1 ve P2'de kültürlenen hücrelerin Matrigel ve 2D ile karşılaştırıldığında canlılık değerlendirmesi. (B) Biyofonksiyonel olmayan peptit P1 ve biyofonksiyonel peptit P2'de hücre kültürünün Matrigel ve 2D kontrollere kıyasla proliferasyon değerlendirmesi. Burada, canlı/ölü tahlili için Matrigel'de büyüyen hücrelerinkine benzer bir davranış görüyoruz. Ölü hücrelerde (sarı ok uçları) hafif bir artış, başta Matrigel olmak üzere çeşitli koşullarda bulunur. Proliferasyon için, eğilimler peptidin türüne ve konsantrasyonuna bağlı olarak değişir, ancak genel olarak olumlu bir eğilim vardır. Ölçek çubukları = 250 μm. Bu rakam Perez-Pedroza ve ark.25'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig06.jpg"> Şekil 6: Peptitin ayrılan hücre sayısı üzerindeki etkileri. (A) Mekanik stresten önce ve sonra DAPI ile boyanmış hücrelerin floresan görüntüleri. Burada peptit P, modifiye peptit P2 ve IKVAV motifini kullanıyoruz. (B) Hücre yapışmasındaki değişiklik, ImageJ'de kapsanan alan ölçülerek belirlendi. Karşılaştırmalı analiz, biyofonksiyonelleştirilmiş peptit P2'nin, biyofonksiyonel olmayan peptit P'ye kıyasla daha yüksek bir tutma kapasitesine sahip olduğunu ortaya koydu. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakam Perez-Pedroza ve ark.25'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig07.jpg"> Şekil 7: Lümenin göreceli alanının daireselliğe karşı centroid hesaplaması ile organoid oluşturma kapasitesinin değerlendirilmesi. Verilerin merkezi ve dağılımı tedaviler arasında farklılık gösterdi. Beklendiği gibi, en kötü performans gösteren durum, geniş bir dairesellik değerleri aralığında genişleyen ve lümenin en düşük göreceli alanına sahip olan 2D ölçümlerdi. Matrigel sadece en yüksek daireselliğe değil, aynı zamanda en büyük lümene de sahipti. Peptit koşulları her iki değerde de biraz değişmiştir, ancak P3 koşulu verilerin en ihmal edilebilir varyasyonunu elinde tutmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig08.jpg"> Şekil 8: Çeşitli belirteçler için organoidlerin 4. ve 7. günlerde konfokal mikroskopi görüntüleri. (A) ZO-1 (yeşil), ezrin (kırmızı) ve DAPI (mavi) belirteçleri, organoidler içindeki hücrelerin apikal dağılımını bulmak için kullanılır. Matrigel kontrolünde görüldüğü gibi, bu moleküller tipik olarak apikal ve bazolateral membranlarda lokalizedir. Biyofonksiyonel olmayan peptit P, bu moleküllerin ekspresyonunu sadece 7. günde gösterir. (B) Pan-kaderin (yeşil) antikorlarla boyanmış hücre-hücre bağlantı belirteçleri, organoidlerin bazolateral ve apikal zarlarına dik olmalıdır. Hücre çekirdeği (mavi) ve hücre iskeleti (kırmızı) karşı boyama olarak kullanılır. Biyofonksiyonel olmayan peptit P, diğer iki tedavinin (P3 ve Matrigel) aksine, bazolateral membranda hücre-hücre bağlantı ekspresyonunu indükledi. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, immün boyama ile hücre adezyonu, organoid morfolojisi ve gen ekspresyonu için biyofonksiyonel kendi kendine birleşen peptitleri değerlendirmeyi amaçlar. Yoğun testler için organoidleri elde etmenin uygun maliyetli bir yolunu sağlamak için bir kolorektal kanser hücre hattı kullanacağız.

Ultra Kısa Kendi Kendine Birleşen Peptit Matrisinde SW1222 Hücre Hattından Kolorektal Kanser Organoidlerinin İmalatı ve Karakterizasyonu

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...

Araştırmamız, Kolorektal Kanser Organoid Kültürleri için matrisler olarak ultra kısa kendiliğinden birleşen peptitleri değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Organoid morfolojisi, canlılık, proliferasyon ve biyoişlevselleştirmenin yapışması ve etkisi ile ilgili soruları ele alıyoruz. Amaç, etkili organoid büyümesi için peptit matris bileşimlerini optimize etmek ve rejeneratif tıbba katkıda bulunmaktır.Alanımızdaki en son teknolojiler, hassas organik üretim için 3D biyobaskıyı, dinamik kültür ortamları için mikroakışkan platformları ve atomik kuvvet mikroskobu ve çoklu foton mikroskobu gibi gelişmiş görüntüleme araçlarını içerir. CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi, genetik modifikasyonu iyileştirirken, tek hücreli RNA dizilemesi derinlemesine moleküler içgörüler sağlar. Mevcut deneysel zorluklar arasında organoid tekrarlanabilirliğin arttırılması, daha büyük yapılar için vaskülarizasyonun rafine edilmesi ve karmaşık doku mimarisinin taklit edilmesi yer almaktadır.Uzun süreli kültürde bu sınırlamaların üstesinden gelmek ve bağışıklık bileşenlerini modellere dahil etmek aktif alanlardır. Standartlaştırılmış protokollere ulaşmak ve bu alanda devam eden zorluklara karşı çıkan etik kaygıları ele almak. Alanımızdaki önemli bulgular arasında, organoid kültürler için ultra kısa kendiliğinden birleşen peptitlerin uygunluğunun gösterilmesi yer almaktadır.Bu peptitlerin çok yönlülüğünü, tekrarlanabilirliğini ve stabilitesini gösterdik ve mikro ortamların ince ayarı için bir platform sağladık. Bu, organoid bazlı çalışmaların, rejeneratif tıbbın ve biyofonksiyonelleştirilmiş hidrojel araştırmalarının ilerlemesine katkıda bulunur. Protokolümüz, ultra kısa kendi kendine birleşen peptit matrislerinde organoidleri değerlendirmek için sistematik bir yaklaşım sağlayan araştırma boşluğunu doldurur.Bu matrisler içindeki hücre davranışını değerlendirmede, optimal organoid büyümesi için peptit bazlı hidrojellerin süreli tasarımına yardımcı olarak ve rejeneratif tıp çalışmalarını ilerletmek için standartlaştırılmış yöntemlere olan ihtiyacı ele alır.

fabrication-characterization-colorectal-cancer-organoids-from-sw1222

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, murin modelinden türetilmiş kolorektal kanser hücrelerinden yapay hücre dışı matris kaplı plakalar üzerinde çoğaltılarak 3D organoidler oluşturmak için ayrıntılı protokol açıklanmaktadır. Bu CRC organoidleri, insan tümör hücrelerinin birincil büyümesini ve metastazı incelemek için bir model olarak kullanılabilir.

CRC Organoid Kültürü: Kolorektal Kanser Hücrelerinden 3 Boyutlu Organoidler Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, floresan görüntülemeyi mümkün kılmak için GFP lentiviral partikülleri tarafından dönüştürülen CRC organoidleri üretme tekniği açıklanmaktadır. Bu GFP etiketli organoidler, hayvan modellerine yerleştirildiğinde, tümör invazyonu ve metastazı incelemeye yardımcı olur.

CRC Organoid Hücre Etiketleme: GFP Lentivirus ile Dönüştürülmüş Kolorektal Kanser Organoid Hücreleri Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, kolorektal kanser hastadan türetilmiş ksenogreftlerin veya PDX'lerin spontan metastaz fare modelini oluşturmak için kullanılan protokol açıklanmaktadır. Bu ksenogreft modelleri, insan karsinomlarının özelliklerini kısmen taklit eder ve invazyon ve metastaz dahil olmak üzere insan malignitelerinin kritik yönlerini anlar.

Spontan Metastaz Fare Modelleri: Ortototopik Olarak Enjekte Edilen Kolorektal Kanser Hücrelerinin Metastatik Potansiyelini İncelemek İçin Bir Platform

Video, 3D organotipik ko-kültür modelinin mikron düzeyinde hassasiyetle lazer diseksiyonunu açıklamaktadır. 3D organotipik modellerde, fibroblastlar gibi stromal bileşenler, kanser epitel hücreleri ile 3 boyutlu olarak birlikte kültürlenir. 3D model, invazyon ve kanser-stroma etkileşimlerinin yakın fizyolojik koşullarda incelenmesini sağlayan deneysel bir araç olarak hizmet eder.

Lazer Mikrodiseksiyon: İstilacı Kolorektal Kanser hücrelerini 3D Organotipik Kültür Modelinden İzole Etme Tekniği

Primer fare kolon tümörü organoid kurmak için basit bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem kolon tümör hücreleri hayatta kalmak ve epitel normal bir kolon yok ise, sınırlı büyüme faktörleri içeren ortamlarda organoids içine büyümeye bu özelliği kullanır.

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Sentetik, doku mühendisliği kolorektal kanser modelleri, lazer microdissected stroma hücreleri ve moleküler profil invaziv ön ve kanserle ilişkili stromal hücre tümör hücreleri arasındaki ara yüzeyde ayırt edici karakterize biyoloji ve incelemek için bir yeni ve manuel olarak kullanılabilen bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblastlar

Biz son derece hassas yayılmasından insan kolorektal kanseri tespiti (CRC) hücre dokuları kolonileşmesi izin vermek için burada PDX kaynaklı CRC organoid hücrelere yeşil flüoresan protein (GFP) lentiviral parçacıkların verimli iletim için bir protokol göster stereo-floresan mikroskobik gözlem ile alıcı fareler içine onların enjeksiyon önce.

Bir hasta kaynaklı kolon tümöründen kültürlü GFP Lentivirus transduced Organoids tarafından oluşturulan Micrometastases yüksek-duyarlı tespiti

Bu protokol, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu açıklar. Model, ilerlemiş kolorektal kanser metastatik hastalığını özetler ve klinik olarak anlamlı bir akciğer ve karaciğer metastazı senaryosunda yeni terapötik ilaçların değerlendirilmesine izin verir.

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Protokol, etkileşimlerini ve terapötik potansiyellerini incelemek için tümör infiltre eden lenfositler (TIL'ler) ile birlikte kültürlenmiş, hasta kaynaklı bir kolorektal kanser (CRC) organoid modeli oluşturmak için bir yöntemi açıklar. Bu model, tümör mikroçevresindeki immün yanıtları araştırmak ve kişiselleştirilmiş KRK tedavisi için TIL bazlı tedavinin etkinliğini tahmin etmek için klinik öncesi bir platform sağlar.

Hasta Kaynaklı Kolorektal Tümör Organoidleri ve Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerden (TIL'ler) Oluşan Bir Ko-Kültür Sisteminin Kurulması

Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Keşfedin ultra kısa kendi kendine birleşen peptit matrislerinde SW1222 kolorektal kanser organoidlerinin üretimini ve karakterizasyonunu. Bu yöntem, organoid morfolojisi ve biyofonksiyonelleştirme etkilerini inceleyerek rejeneratif tıbba katkı sağlar.

Ultra Kısa Kendi Kendine Birleşen Peptit Matrisinde SW1222 Hücre Hattından Kolorektal Kanser Organoidlerinin İmalatı ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal

Ultra Kısa Kendi Kendine Birleşen Peptit Matrisinde SW1222 Hücre Hattından Kolorektal Kanser Organoidlerinin İmalatı ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet