Alzheimer Hastalığının (AD) Nöral Modelinde Mitokondri ile İlişkili Endoplazmik Retikulum Membranı (MAM) Stabilizasyonunun Kantitatif Analizi

AD de dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıkların patofizyolojisini düzenlemede önemli olan çeşitli kalınlıklarda veya boşluk genişliklerinde mitokondri ile ilişkili ER membranlarının stabilitesini kantitatif olarak ölçmeye çalışıyoruz. Genellikle MAM olarak adlandırılan mitokondri ile ilişkili ER membranları üzerine yapılan son çalışmalar, bunları AD'nin erken evresinde amiloid patolojisini başlatmada anahtar faktörlerden biri olarak tanımlamıştır. Bulgular, MAM hipotezi adı verilen yeni bir hipotezin geliştirilmesine yol açtı ve bu da AD'nin yalnızca MAM ile ilişkili bir hastalık olduğunu öne sürdü.

Protokolümüz, şimdiye kadar zorlu olan canlı hücrelerde MAM stabilizasyonunu ölçmek için nicel bir araç sağlayan ilk protokoldür. Protokolümüzün en büyük avantajı, canlı hücrelerde MAM boşluk genişliklerinin sıkılması veya gevşetilmesi üzerine MAM stabilizasyonundaki değişiklikleri kantitatif olarak ölçmek için mitokondrinin içsel dinamik özelliğini kullanmasıdır.

Yakın gelecekteki odak noktamız, yakın zamanda geliştirilen bir AD ilaç tarama platformunu kullanarak, bir dizi FDA onaylı sentetik veya doğal küçük moleküllü MAM modülatörünü veya MAM'a bağlı sigma bir reseptörü taramak için son teknoloji canlı hücre görüntüleme ve kimografik tekniğimizi geliştirmek ve kullanmaktır.

[Ekran Okuyucusu] Hücreleri MAM stabilizatörleri ile transfekte etmek için, kemik iliği mononükleer karışımını her oyukta iki mililitre oda sıcaklığında DMEM-F12 ortamı ile değiştirin. Nükleofektör reaktifini 4.5'e bir oranında bir takviye ile birleştirin. Karışıma 100 mikrolitre nükleofektör reaktifi ekleyin. Sonra DNA çözeltisini girdaplayın. Her transfeksiyon için ayrı bir mililitre mikro santrifüj tüplerine tedavi başına bir ila beş mikrogram DNA ekleyin. Mevcut ortamı hücrelerden aspire ettikten sonra, hücreleri 10 mililitre PBS ile bir kez yıkayın. PBS'yi aspire edin ve doğrudan hücrelere bir mililitre akutaz ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri çıkarmak için tabağın yan tarafına hafifçe vurun. Mikroskop altında, hücrelerin gevşediğini ve serbestçe aktığını doğrulayın. Keskinleri 10 mililitre DMEM-F12 ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunu temiz 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, askıya alınmış hücrelerden 10 mikrolitre alın ve bunları bir hücre sayma odasının A tarafına ekleyin. Ardından, doldurulmuş haznenin A tarafını hücre sayacının önündeki ana yuvaya yerleştirin. Mililitre başına hücre sayısını ölçün ve kaydedin. Gerekli sayıda hücreyi 300 G'de beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin ve peleti her elektroporasyon için 100 mikrolitre nükleofektör karışımında yeniden süspanse edin. Daha sonra, DNA içeren tüplerden birine 100 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonu ekleyin. Solüsyonu birkaç kez pipetleyerek karıştırın. Daha sonra DNA hücresi karışımını bir elektroporasyon küvetine aktarın ve verilen kapakla kapatın. Cihazda uygun nükleofektör programını seçin. Steril pipetler kullanarak önceden doldurulmuş altı oyuklu bir plakadan hemen yaklaşık 500 mikrolitre DMEM ekleyin. Bir kez nazikçe karıştırın ve elektroporasyonlu hücreleri ve ortamı ilgili kuyuya aktarın. Başlamak için, hücreleri içeren altı oyuklu plakayı mikroskop odasına yerleştirin ve hücreler görünür hale gelene kadar mikroskobun odağını ayarlayın. Kırmızı floresan protein sinyalini yakalamak için, 594 nanometre lazer kullanarak floroforu uyarın ve emisyonu 570 ila 640 nanometreye ayarlayın. Yeşil floresan proteini için, 510 ila 540 nanometre emisyonlu uyarma için 488 nanometre lazer kullanın. Tarama alanını aksonun etrafına sığacak şekilde kırpın. Daha küçük bir tarama alanı, işlem süresini azaltacak ve kimografi üretimini basitleştirecektir. Aralığı saniyede bir kare ve toplam süreyi 181 saniye olarak ayarlayın. İşlemi başlatmak için çalıştır'a tıklayın. MAM 1X işaretli ER'ye bağlı mitokondrinin aksonal hızı, serbest ve MAM 9X'e bağlı mitokondriye kıyasla %50 oranında azaltılmıştır. MAM 1X mitokondrilerinin %26.6'sı hareketliyken, serbest mitokondrinin %53.82'si ve MAM 9X mitokondrilerinin %44.79'u hareketliydi. Retrograd hareket, MAM 1X mitokondri için Mito-RFP mitokondri ve MAM 9X mitokondriden daha düşüktü. MAM 1X mitokondrinin anterograd hareketi de Mito-RFP'ye karşı azalmıştır. MAM 1X mitokondrinin durağan yüzdesi, MAM 9X mitokondriden önemli ölçüde daha yüksekti, bu da motilitedeki bir azalmayı yansıtırken, MAM 1X mitokondrinin genel hızı MAM 9X mitokondriden önemli ölçüde daha düşüktü.