Name: Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Öğrenin, virüs enfeksiyonunun bağırsak epitelindeki kalsiyum sinyalini nasıl bozduğunu insan bağırsak organoidleri kullanarak. Bu yöntem, viral patogenez araştırmalarında uzun süreli görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH) R01DK115507 ve R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) hibeleri ile desteklenmiştir. Stajyer desteği, NIH hibe F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F.J. Scribano) ve F32DK130288 (PI: K.A. Engevik) tarafından sağlandı. Organoid bakım ortamını sağladığı için Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Enteroid Çekirdeğine teşekkür ederiz.

Virüsle Enfekte İnsan Bağırsağı Organoid Tek Tabakalarının Kalsiyum Görüntülemesi

<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
<li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium%3A+Significance+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
<li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522(2022).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmek için rekabet eden mali çıkarları yoktur.

Sitozolik Ca2+ seviyelerindeki değişiklikler,epitel 10,16,17 içindeki patolojilerin hem nedeni hem de sonucu olabilir. Sitozolik kalsiyumdaki artışlar, kalsiyuma bağımlı klorür kanalının aktivasyonu yoluyla doğrudan sekresyona neden olabilirTMEM16A 18,19. Ca2+'ya yanıt olarak TMEM16A aktivasyonu, apikal klorür akışına izin vererek, sıvı sekresyonunu destekleyen ozmotik bir gradyanoluşturur 20,21. Ayrıca, enteroendokrin hücrelerdekiCa2+ artışları, enterik sinir sistemi22 içindeki aktiviteyi modüle edebilen afferent duyusal nöronları uyaran serotonin salınımını tetikler. Ca2+ sinyalleri ayrıca bariyer fonksiyonunu 23,24 etkilemek için sıkı bağlantıları modüle edebilir ve bağırsak kök hücrelerinde25 proliferasyonu düzenleyebilir. Bu nedenle,Ca2+'nın düzensizliği geniş ve geniş kapsamlı etkilere sahip olabilir.
Birçok virüs, replikasyona elverişli bir hücresel ortam oluşturmak için sitozolikCa2+'yı manipüle eder26. Rotavirüs, bağırsak epiteli27 içinde bunun en iyi örneğidir. Rotavirüs yapısal olmayan protein 4 (NSP4),Ca2+'nın endoplazmik retikulumdan sitozole28,29 akışına izin veren bir Ca 2+ iletken kanaldır. Bu, otofajiyi uyarır ve dış kapsid30,31,32'nin montajına yardımcı olur. Rotavirüs enfeksiyonu ayrıca ADP salınımını indükleyerek patogeneze katkıda bulunan hücreler arasıCa2+ dalgalarını tetikler17. Hem kalisivirüsler hem de enterovirüsler dahil olmak üzere diğer enterik virüsler, enfekte hücreler içinde benzer Ca2+ düzensizliğini tetikleyen Ca2+ iletken viroporinleri kodlar33,34.
İnsan bağırsak organoidlerinin canlı hücre Ca2+ görüntülemesi, epitel içindeki virüs kaynaklı sinyalleri incelemek için çok yönlü bir platform sunar. Bununla birlikte, görüntüleme verilerinden elde edilen sonuçların gücü, ayrılmaz bir şekilde, HIO'ların sağlığına ve kalitesine, uygun görüntüleme parametrelerine ve sağlam bir analitik yaklaşıma bağlıdır.
Etkili lentiviral transdüksiyon, yeni HIO hatları oluştururken genellikle sınırlayıcı adımdır, ancak yüksek titreli lentivirüs ve çoklu transdüksiyonlar, yeterli transgen ekspresyonunun sağlanmasına yardımcı olur. Daha da önemlisi, bunun transdüksiyon üzerine önemli hücresel stres potansiyeli ile dengelenmesi gerekecektir. Bu genellikle geçicidir ve seçimden ve çoklu geçişlerden sonra azalır. Bununla birlikte, GECI'leri ifade etmek için tasarlanan HIO'ların deneylere başlamadan önce normal büyüme ve çoğalma göstermesi çok önemlidir. Benzer şekilde, 3 boyutlu HIO'ların dağıtılması ve bunların tek tabakalar olarak yeniden düzenlenmesi hücresel strese neden olur. Tek katmanların kaplamadan sonra uyum sağlaması için üç veya daha fazla gün beklemek en iyi uygulamadır. Plakaların kollajen IV ile kaplanması tek tabaka bütünlüğü için kritiköneme sahiptir 35,36. Kollajen IV'ün alikote edilmesi ve kullanımlar arasında -80 °C'de saklanması, tek tabaka aderansının sağlanmasına yardımcı olur. Her HIO hattı için en uygun tohumlama yoğunluğunun belirlenmesi de tutarlılığın iyileştirilmesine yardımcı olabilir. Son olarak, uygun kontrollerin dahil edilmesi ve bunların deneyler arasında karşılaştırılması, herhangi bir gözlemin teknik bir karıştırıcıdan ziyade söz konusu değişkene bir yanıtı temsil etmesini sağlamak için vazgeçilmezdir.
Tek tabakalı bir puanlama istenmeyen hücre hasarına neden olabilirken, 2D HIO'ların RV enfeksiyonunu büyük ölçüde artırır. Şekil 2 bunu göstermektedir, çünkü neredeyse tüm enfekte olmuş hücreler doğrudan çiziğe bitişiktedir. Deneysel kanıtlar, RV'nin bağırsak epitel hücrelerinin bazolateral yüzeyinde en verimli şekilde enfekte olduğunu göstermektedir37. Bu nedenle, tek tabakalı bir tabakanın puanlanmasının bazolateral yüzeyi açığa çıkararak enfektiviteyi arttırdığı tahmin edilmektedir. Etkili tek tabakalı enfeksiyon, bazolateral yüzeye erişime izin veren kültür ortamı içeren kuyucuklarda asılı duran polikarbonat membranlar üzerine HIO'ların kaplanmasıyla da elde edilebilir. Bununla birlikte, plaka ile polikarbonat membran, polikarbonat membranın kendisi ve kuyu tabanındaki plastik yüzey arasındaki nispeten uzun mesafe, onları epifloresan görüntüleme için uygunsuz hale getirir. Bu nedenle, bu protokolde açıklanan puanlama yöntemi tercih edilen yaklaşım olmaya devam etmektedir. Puanlamanın kendisinin sinyal bozulmalarına yol açabileceği göz önüne alındığında, enfekte olmamış, puanlanmış kontrolün dahil edilmesi yorumlama için kritik öneme sahiptir. Apikal membran yoluyla etkili bir şekilde enfekte olan insan norovirüsü gibi virüsler için tek tabakanın puanlanması gerekli değildir38.
Herhangi bir canlı görüntüleme sisteminde olduğu gibi, fototoksisite, HIO tek katmanlarını kullanan deneyleri kolayca karıştırabilir. Bir görüntüleme deneyi boyunca, beklenmeyen vakuolizasyon, membran kanaması veya stresin diğer morfolojik göstergelerini izlemek önemlidir39. Bu belirtilerden herhangi biri tespit edilirse, uyarılma süresi, sıklığı veya gücü azaltılmalıdır. Sinyal-gürültü oranının arttırılması genellikle uzun vadeli hücre sağlığı pahasına gelir, bu nedenle parametrelerin ampirik olarak optimize edilmesi çok önemlidir. Foto ağartma, zamanla başlangıç floresan yoğunluğundaki bir azalma ile gösterildiği gibi, hücre stresinin habercisidir ve bundan kaçınılmalıdır.
Görüntüleme verilerinin görselliği, araştırmacıların nicel analizlerden ziyade nitel analizleri tercih etmesine yol açabilir. Bununla birlikte, herhangi bir modalitede olduğu gibi, tekrarlanabilir sonuçlar nicelleştirme gerektirir. Kantitatif görüntü analizi, tek bir makalede ele alınabilecek olandan çok daha fazla karmaşıklık içerir, ancak birkaç önemli noktayı vurgulamakta fayda var. İlk olarak, tutarlı nicelik, tutarlı bir kazanım gerektirir. Belirli bir dizi toplama parametresi için geliştirilen bir analiz hattı, farklı frekanslarda, pozlama sürelerinde, lazer güçlerinde veya dalga boylarında elde edilen görüntüler için etkili olmayabilir. İkincisi, enfeksiyonun çokluğu, viral olarak indüklenen kalsiyum sinyallerinin sıklığı üzerinde çok büyük bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, görüş alanı başına enfekte olmuş hücre sayısını değerlendirmek ve tedavi koşulları arasında tutarlılığı sağlamak önemlidir. Alternatif olarak, sinyal frekansını görüş alanı başına enfekte hücre sayısına normalleştirmek, hatayı azaltmaya yardımcı olabilir. Son olarak, yakın zamanda geliştirilen mNG tabanlı kalsiyum göstergesi (NEMO),40 hücrelerindeki mutlak Ca2+ konsantrasyonlarını belirlemek için umut verici bir yaklaşım sunarken, çoğu biyosensör biyolojik sistemler hakkında yalnızca göreceli bilgi iletir. Bu nedenle, arka plan çıkarma, normalleştirme ve bir denetimle karşılaştırma kritik öneme sahiptir.
Bu protokol viral enfeksiyon sırasında kalsiyum görüntülemeye odaklanırken, genel yaklaşım kolayca uyarlanabilir. Viral enfeksiyon, alternatif bir tedavi koşulu için kolayca ikame edilebilir ve birçok farklı hücresel yolu ve süreci izlemek için sürekli büyüyen bir biyosensör litanyası vardır. Herhangi bir protokol uyarlamasında, araştırmacılar analizi akılda tutmalı ve net, ölçülebilir sonuçları olan deneyler tasarlamalıdır.
Genel olarak, canlı görüntüleme rakipsiz zamansal çözünürlük sağlayarak son derece dinamik süreçlerin karakterizasyonunu geliştirir. Organoidlerin canlı görüntüleme deneylerine dahil edilmesi, bu süreçlerin dokuya doğru, fizyolojik olarak ilgili bir modelde gözlemlenmesine izin verir. Burada açıklanan protokolün deneysel tasarım ve optimizasyonu kolaylaştırdığını ve araştırmacıları hücre ve doku sinyalizasyonunun yeni yönlerini ortaya çıkarmaları için güçlendirdiğini umuyoruz.

Kalsiyum, hücresel fizyolojinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynayan, yaygın olarak korunan ikinci bir habercidir1. Güçlü yükü, küçük boyutu ve fizyolojik koşullarda yüksek çözünürlüğü göz önüne alındığında, kalsiyum, protein konformasyonunun ideal bir manipülatörüdür. Bu, kalsiyumu elektrokimyasal sinyalleri enzimatik, transkripsiyonel veya transkripsiyon sonrası değişikliklere dönüştürmek için güçlü bir araç haline getirir. Endoplazmik retikulum (ER) ve plazma membranları boyunca katı kalsiyum konsantrasyonu gradyanları, sitozolik kalsiyum konsantrasyonunda hızlı değişikliklere izin veren yüksek bir itici güç oluşturur. Hem arabelleğe alma hem de aktif aktarım dahil olmak üzere birden çok mekanizma bu gradyanı sıkı bir şekilde korur. Normal hücresel fonksiyonlar için gerekli olsa da, bu bakım enerjik olarak pahalıdır ve bu da onu stres durumlarında özellikle duyarlı hale getirir 2.
Bu nedenle, sitozol içindeki kalsiyumun düzensizliği, birçok hücresel stres türünün neredeyse evrensel bir sinyalidir. Metabolik bozukluklar, toksinler, patojenler, mekanik hasar ve genetik bozulmaların tümü kalsiyum sinyalini bozabilir. Uyarandan bağımsız olarak, tüm hücre düzeyinde, sitozolik kalsiyumdaki sürekli, kontrolsüz artışlar apoptozu ve sonunda nekrozu teşvik edebilir 3,4. Bununla birlikte, daha düşük genlikli veya daha yüksek frekanslı sitozolik kalsiyum seviyelerindeki değişikliklerin değişen etkileri vardır2. Benzer şekilde, kalsiyum dalgalanmalarının sonuçları, meydana geldikleri uzamsal mikro alana bağlı olarak farklılık gösterebilir5. Bu nedenle kalsiyum seviyelerinin izlenmesi, dinamik sinyalleme süreçleri hakkında fikir verebilir, ancak bu, nispeten yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip örnekleme gerektirir.
Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleri (GECI'ler), canlı hücre sistemlerinde sürekli örnekleme için güçlü araçlardır6. En yaygın kullanılan GECI'lerden bazıları, GCaMPs7 olarak bilinen GFP bazlı kalsiyuma duyarlı floresan proteinlerdir. Kanonik GCaMP, üç farklı protein alanının bir birleşimidir: dairesel olarak permütasyonlu bir GFP (cpGFP), kalmodulin ve M136. Kalmodulin alanı, kalsiyumun bağlanması üzerine bir konformasyon değişikliğine uğrar ve M13 ile etkileşimine izin verir. Kalmodulin-M13 etkileşimi, cpGFP'de, uyarma üzerine floresan emisyonunu artıran konformasyonel bir değişikliğe neden olur. Bu nedenle, kalsiyum konsantrasyonundaki bir artış, GCaMP floresan yoğunluğundaki bir artışla ilişkilidir. Bu sensörler sitozolik olabilir veya belirli organellerihedefleyebilir 8.
Çoğu dokuya benzer şekilde, kalsiyum gastrointestinal epitel içindeki çeşitli işlevleri düzenler. Bağırsak epiteli, besin ve sıvı emilimi için ayrılmaz bir parçadır, ancak aynı zamanda patojen istilasını veya toksik hakaretleri önlemek için sıkı bir bariyer ve bağışıklık arayüzü oluşturmalıdır. Kalsiyuma bağımlı yollar bu hayati fonksiyonların neredeyse tamamını etkiler 9,10,11. Bununla birlikte, bağırsak epiteli içindeki kalsiyum sinyali, terapötik bir hedef olarak umut verici potansiyele sahip, yeterince keşfedilmemiş bir sınır olmaya devam etmektedir. Bağırsak epitelindeki kalsiyum dinamiklerinin in vivo olarak izlenmesi zorluklar sunmaya devam ederken, insan bağırsak organoidleri (HIO'lar) deney için uyarlanabilir bir ex vivo sistem sunar12. HIO'lar, insan bağırsak kök hücrelerinden türetilen 3 boyutlu (3D) sferoidlerdir ve farklılaşma üzerine, doğal bağırsak epitelinin hücresel çeşitliliğinin çoğunu özetler12.
Bu protokol, GECI'leri eksprese eden HIO'ları tasarlamak ve daha sonra tasarlanmış HIO'ları canlı hücreli kalsiyum görüntüleme için tek katmanlar olarak hazırlamak için kapsamlı yöntemleri açıklar. Kalsiyum sinyalizasyonunu bozan patolojik bir manipülasyon örneği olarak viral enfeksiyonu sunar ve bu değişiklikleri ölçmek için analitik bir yaklaşım sağlar.

<table><tbody><tr><td>Gelişmiş DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>%0.05 Tripsin EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>% 0.05 Tripsin EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>%16 formaldehit</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge iğne</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikositik&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>CellView Hücre Kültürü Slaytı, PS, 75/25 MM, Cam Alt, 10 bölme</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Florobrit</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>İnsan epidermal büyüme faktörü</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td> <td>(değişken)</td><td></td></tr> <tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>N2 Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-asetilsistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş 24 Kuyulu Plakalar</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzim, fenol kırmızısı yok</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

genetik olarak kodlanmış kalsiyum İndikatörleri kullanılarak virüsle enfekte İnsan bağırsak organoid tek tabakalarının canlı kalsiyum görüntülemesi

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Kalsiyum sinyali, hemen hemen her dokunun ayrılmaz bir düzenleyicisidir. Bağırsak epiteli içinde kalsiyum, salgı aktivitesinin, aktin dinamiklerinin, inflamatuar yanıtların, kök hücre proliferasyonunun ve diğer birçok karakterize edilmemiş hücresel fonksiyonun düzenlenmesinde rol oynar. Bu nedenle, bağırsak epiteli içindeki kalsiyum sinyal dinamiklerinin haritalanması, homeostatik hücresel süreçler hakkında fikir verebilir ve çeşitli uyaranlara benzersiz tepkileri ortaya çıkarabilir. İnsan bağırsak organoidleri (HIO'lar), bağırsak epitelini incelemek için yüksek verimli, insan kaynaklı bir modeldir ve bu nedenle kalsiyum dinamiklerini araştırmak için yararlı bir sistemi temsil eder. Bu makale, HIO'ları genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) ile kararlı bir şekilde dönüştürmek, canlı floresan mikroskobu gerçekleştirmek ve kalsiyum sinyallerini anlamlı bir şekilde karakterize etmek için görüntüleme verilerini analiz etmek için bir protokolü açıklamaktadır. Temsili bir örnek olarak, 3 boyutlu HIO'lar, yeşil floresan protein bazlı sitozolik bir GECI olan GCaMP6'ları stabil bir şekilde eksprese etmek için lentivirüs ile dönüştürüldü. Tasarlanan HIO'lar daha sonra tek hücreli bir süspansiyona dağıtıldı ve tek katmanlar olarak tohumlandı. Farklılaşmadan sonra, HIO tek tabakaları rotavirüs ile enfekte edildi ve/veya kalsiyum yanıtını uyardığı bilinen ilaçlarla tedavi edildi. Sıcaklık kontrollü, nemlendirilmiş canlı görüntüleme odası ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu, enfekte olmuş veya ilaçla tedavi edilmiş tek tabakaların uzun süreli görüntülenmesine izin verdi. Görüntülemenin ardından, elde edilen görüntüler ücretsiz olarak kullanılabilen analiz yazılımı ImageJ kullanılarak analiz edildi. Genel olarak, bu çalışma HIO'larda hücresel sinyallemeyi karakterize etmek için uyarlanabilir bir boru hattı oluşturur.

Şekil 1A , GCaMP6'ları stabil bir şekilde ifade etmek için dönüştürülmüş 3 boyutlu insan bağırsak organoidlerini içeren bir BMM kubbesini göstermektedir. Şekil 1B , tohumlamadan 24, 48 ve 72 saat sonra tek tabaka olarak yeniden kaplanan aynı organoid hattını göstermektedir. GCaMP6'ların işlevini doğrulamak için, tek tabaka 4 dakika boyunca her 2 saniyede bir floresan mikroskobu ile görüntülendi ve ~20 saniye sonra ortama 100 nM ADP eklendi. Her maruziyette 488 nm kanalında tespit edilen floresan yoğunluğu Şekil 1C'de çizilmiştir. İz, sabit bir başlangıç floresan yoğunluğunu, ardından ADP ilavesi üzerine hızlı bir artış ve taban çizgisine doğru kademeli bir dönüş gösterir. Yanıtın gerçek bir sinyalleşme olayı olduğunu ve yalnızca ortam ilavesinden kaynaklanabilecek floresan yoğunluğundaki bir değişiklik olmadığını doğrulamak için bir araç kontrolü dahil edilmiştir.
Bir HIO tek tabakasının puanlanması, rotavirüs enfeksiyonunun etkinliğini artırır. Puanlama teknikleri farklılık gösterse de, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, tek katmanın uzunluğu boyunca tek bir skor kullanarak tutarlı enfeksiyon elde etmek en kolay yoldur. Floresan proteinleri eksprese eden rekombinant rotavirüs suşları kullanıldığında, canlı görüntüleme sırasında enfeksiyon doğrulanabilir (Şekil 2B). Bir belirteç ifade etmeyen bir suş kullanıldığında, görüntülemeden sonra immünofloresan ile enfeksiyon tespit edilebilir. HIO tek katmanlarındaki hücrelerin hareketliliği göz önüne alındığında, zaman içinde tek bir enfekte hücreyi izlemek genellikle zordur. Bunun yerine, enfeksiyonu doğrulamak ve enfeksiyon çokluğunun görüş alanları arasında eşleştiğini doğrulamak için bir yöntem olarak uç nokta boyamayı kullanın (Şekil 2C).
HIO'lardaki hücreler arası kalsiyum dalgaları, Şekil 3A'da gösterildiği gibi kalitatif olarak gözlemlenebilir. Bununla birlikte, belirli bir görüş alanındaki kalsiyum dalgalarının frekansını belirlemek, kantitatif analiz gerektirir. Yukarıdaki protokolün 6. adımında açıklandığı gibi başarılı segmentasyon adımları Şekil 3A'da gösterilmektedir. Şekil, ham görüntüyü (Şekil 3Ai), önceki kareden piksel yoğunlukları çıkarıldıktan sonraki görüntüyü (Şekil 3Aii), ardından segmentli kalsiyum dalgasını (Şekil 3Aiii) göstermektedir.
Kalsiyum dalgaları, görüntüleme çalışması boyunca her bir görüş alanı için bölümlere ayrıldıktan ve ölçüldükten sonra, çeşitli koşullara maruz kalan tek tabakalardaki dalgaların frekansını karşılaştırmak genellikle bilgilendiricidir. Şekil 3B'deki şerit grafiği, sahte ve rotavirüs aşılanmış tek katmanlarda görüş alanı başına toplam kalsiyum dalgası sayısını göstermektedir. Bu örnek iki RV suşu içerir: bir insan rotavirüsü suşu (Ito HRV) ve mRuby'yi (SA11-mRuby) eksprese eden bir simian rotavirüs SA11 rekombinant suşu. Sahte enfekte kontrol, temel kalsiyum dalga frekansı olarak alınır, tedavi edilmemiş rotavirüs ile enfekte tek tabakalar pozitif kontroller olarak görev yapar ve rotavirüs ile enfekte, tedavi edilmiş tek tabakalar deneysel koşullardır. ADP reseptör inhibitörü BPTU da dahil olmak üzere ilaçlarla tedavi edilen sahte enfekte ve RV ile enfekte tek tabakalar daha sonra tek yönlü ANOVA ile her iki kontrol koşulu ile karşılaştırılabilir. Veriler, BPTU'nun hücreler arası kalsiyum dalgalarının sıklığını etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> Şekil 1: Jejunal insan bağırsak organoidlerinde GCaMP6s ekspresyonunun doğrulanması. (A) Lentivirüs transdüksiyonundan sonra, GCaMP eksprese eden HIO'lar, burada en son geçişten 7 gün sonra gösterilen seçilim ve çoklu geçişlere tabi tutuldu. 488 nm lazer ile stimülasyon üzerine, GCaMP6s ekspresyonu, 15 μL bazal membran matrisinde 3 boyutlu sferoidler (Ai) olarak kaplanmış transdüksiyonlu HIO'larda belirgindir. 50x objektif kullanılarak %50 lazer gücünde 20 ms pozlama elde edildi, ardından tüm bazal membran matris kubbesini görselleştirmek için bir araya getirildi. Benzer bir işlem, 4 ms parlak alan pozlamaları (Aii) kullanılarak gerçekleştirildi. Parlak alan görüntüsünde, kubbenin ortasındaki karanlık HIO'lar, kültürlerin geçişe hazır olduğunun bir göstergesidir. (B) HIO'lar enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi, daha sonra kollajen IV ile önceden kaplanmış bir görüntüleme alt plakasının oyuk başına 150.000 hücre yoğunluğunda (5 mm çapında) yeniden kaplandı. Tohumlamadan 72 saat sonra, tek tabaka birleşti ve sonraki uygulamalar için hazırdı. GCaMP'nin işlevini doğrulamak için, görüntüler 4 dakika boyunca her 2 saniyede bir% 50 lazer gücünde 50 ms pozlama ile 488 nm filtre seti kullanılarak elde edildi. (C) Burada gösterilen izler, görüntüleme sırasında ilk edinime normalize edilen tüm alan floresan yoğunluğunu temsil eder. Yaklaşık 20 s'de (ok), onuncu maruziyetten sonra, sitozolik kalsiyumda (kırmızı) bir artış ortaya çıkarmak için 100 nM adenozin difosfat (ADP) eklendi. Eşit hacimde 1x PBS'nin eklenmesi anlamlı bir yanıt (mavi) ortaya çıkarmadı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> Şekil 2: RV enfeksiyonunu kolaylaştırmak için bir HIO tek tabakasının puanlanması. (A) Şekil, 25G iğne kullanarak tek tabakalı bir tabakayı puanlamak için uygun bir tekniği göstermektedir. (B) Bir HIO tek tabakası, enfekte olmuş hücrelerin tanımlanmasına izin veren mRuby floresan proteinini (macenta, ok) eksprese eden rekombinant bir RV suşu ile enfekte edildi. Alternatif olarak, doğal olarak oluşan bir RV suşu kullanıldığında, enfekte olmuş hücreler immünofloresan kullanılarak tanımlanabilir. (C) Gösterilen görüntüler, fiksasyon, DAPI boyama (mavi) ve rotavirüs antijeninin (macenta) antikor etiketlemesinden sonra 4 farklı HIO tek katmanından alınmıştır. Her iki teknik de tek tabakanın çentikli kısmının yakınında tercihli RV enfeksiyonunu göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> Şekil 3: RV ile indüklenen hücreler arası kalsiyum dalgalarının segmentasyonu ve kantitasyonu. GCaMP6'ları eksprese eden RV ile enfekte olmuş HIO'ların 488 nm maruziyetleri, protokol kullanılarak 16 saat boyunca her 1 dakikada bir elde edildi. (A) Şekil, hücreler arası kalsiyum dalgası segmentasyonu sürecini göstermektedir. İlk olarak, floresan yoğunluğundaki (Aii) değişikliği ölçmek için önceki edinimden (t-1) piksel değerleri her ham görüntüden (Ai) çıkarılır. Ardından, önceki kareden deneysel olarak optimize edilmiş minimum yoğunluk artışına dayalı bir eşik uygulanır. Görüntüler daha sonra hücreler arası kalsiyum dalgalarını (Aiii) seçmek ve tek hücreli kalsiyum sinyallerini hariç tutmak için minimum bitişik sinyal alanı için filtrelenir. Bu işlem, her görüş alanında kalsiyum dalgalarının ölçülmesine izin verir. Bu deneyde, tek tabakalar ya sahte enfekte edildi, insan rotavirüsünün (HRV) ITO suşu ile enfekte edildi ya da yapısal olmayan protein 3'ün (SA11-mRuby) akış aşağısındaki gen segmenti 7'de mRuby'yi kodlayan rekombinant bir simian rotavirüs suşu ile enfekte edildi. Enfekte tek tabakalar ya ADP reseptör inhibitörü BPTU ile tedavi edildi ya da tedavi edilmeden bırakıldı. Tek katmanlar daha sonra 8 farklı pozisyonda görüntülendi ve her görüş alanındaki kalsiyum dalgaları, bu protokolde açıklanan boru hattı kullanılarak ölçüldü. Şerit grafiğindeki noktalar, ortalama ve SD'yi işaretleyen bir çubuk grafik üzerine bindirilmiş her pozisyonda tespit edilen kalsiyum dalgalarının sayısını gösterir. Tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in testleri, her iki RV suşunun da enfekte olmamış grubunkinden daha fazla hücreler arası kalsiyum dalgalarının frekansını arttırırken, BPTU tedavisinin kalsiyum dalga frekansında RV aracılı artışı önlediğini göstermektedir. **p<0.01, ***p<0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Iletim</td>
			<td>Kontrol</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (1 mM stok)</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>Polibren (1 mg/μL stok)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Lentivirüs virüsü</td>
			<td>değişken*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *notlara bakın</td>
			<td>400 μL'ye kadar</td>
			<td>400 μL'ye kadar</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Lentivirus transdüksiyon ortamı. Reaktifleri sırasıyla ikinci ve üçüncü sütunlarda belirtilen hacimlerde birleştirerek transdüksiyon ortamını ve kontrol ortamını hazırlayın. Hücre başına 10 lentivirüs transdüksiyon biriminden oluşan çok sayıda enfeksiyonu (MOI) hedefleyin. Şirket içinde paketlenmiş LV için bu genellikle ~25-50 μL konsantre LV gerektirir. Ticari olarak paketlenmiş LV'lerin çoğunun titresine Analiz Sertifikası verilecektir.
Ek Kodlama Dosyası 1: Toplu işleme ile kalsiyum dalgası nicelleştirmesine izin vermek için ImageJ makro komut dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Çalışmamızla, virüslerin bağırsak epitelinde sinyalleşmeyi nasıl bozduğunu anlamayı amaçlıyoruz. Özellikle, virüsle enfekte olmuş hücrelerin, komşu enfekte olmamış hücrelerin patogeneze katkıda bulunmak için nasıl düzensizleştiğini anlamakla ilgileniyoruz. Yakın zamanda, rotavirüs ile enfekte olmuş hücrelerin, komşu enfekte olmamış hücreleri düzensizleştiren ve viral yayılmayı kolaylaştıran ve hastalığı şiddetlendiren ADP darbeleri salgıladığını keşfettik.Kalsiyum görüntüleme sinirbilim gibi alanlarda çok popüler olsa da, epitel biyolojisi veya virolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılmamıştır. Bu protokol, kalsiyum sinyalizasyonunu ve canlı virüsle enfekte epitel dokusunu incelemek için mevcut teknolojileri ve model sistemleri uyarlamak için bir yaklaşım sunar. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade etmek için organoidleri tasarlayarak, yaklaşımımız, insan bağırsak epitelinin hücresel çeşitliliğini özetleyen bir model sistemde tutarlı, tekrarlanabilir uzun vadeli bir görüntülemeye izin verir.Virüs kaynaklı parakrin purinerjik sinyallemenin hem konakçı hem de virüs için etkilerini anlamayı amaçlıyoruz. Gelecekteki çalışmalarımız, bu tür sinyallerin diğer virüsler arasında geniş çapta korunup korunmadığını ve etkilerin benzer olup olmadığını da belirleyecektir.

live-calcium-imaging-virus-infected-human-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Bu video, kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agaroz kuyularında bulunan solucanların hızlandırılmış görüntülemesi için örnek bir protokol içerir.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Kaynak: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In Situ Ca2+ Enterik sinir sisteminin görüntülenmesi. J. Vis. Uzm.  (2015)Bu video kalsiyumu göstermektedir fare Kolonik Myenterik pleksus preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini görselleştirmek ve analiz etmek için görüntüleme.

Bir Fare Kolonik Myenterik Pleksusunda Enterik Nöron ve Glia Aktivitelerinin Kalsiyum Görüntülemesi

Kaynak: Doser, R., et al. Nöronal Kalsiyum İşleminin In Vivo Hücre Altı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, transgenik Caenorhabditis elegans suşlarının ventral sinir kordonu nöronlarındaki hücre altı kalsiyum akışının in vivo görüntülemesini göstermektedir. İki farklı kalsiyum indikatörü kullanılır: bir suşta bir sitoplazmik indikatör ve diğerinde bir mitokondriyal indikatör kullanılır. Nöronlar, nöronal sitoplazma ve mitokondri içindeki floresan yoğunluğundaki gerçek zamanlı...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Bu protokol ana Lgr5-pozitif yer alan organoid kültür ve Retroviral transdüksiyonun müteakip bir uygulama açıklanmaktadır. Bu in vitro olarak Organotipik bir roman içinde gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar teslim transjenin uyarımlı Cre aşırı ekspresyonunu veya demonte sağlar ve sağlar   model sistem.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Enterik sinir sistemi (ENS), bağırsak duvarında bulunan ve bağırsak reflekslerini kontrol eden bir nöron ve glia ağıdır. Bu protokol, Ca2+ görüntüleme kullanılarak ENS'nin canlı preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini kaydetme yöntemlerini açıklar.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Burada, nanoakışkan bir cihazda akut olaylar ve üretken HIV-1 enfeksiyonu için tek hücrelerin izlendiği bir protokol sunuyoruz. Görüntüleme verileri virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlar. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntülemenin sinyal kinetik ve moleküler etkileşimleri incelemek için ilk yöntemidir.

Multiparametre Optofluidik Platform Kullanılarak Kalsiyum Akını ve HIV-1 Enfeksiyonunun Tek Hücreli Karakterizasyonu

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Kalsiyum sinyalinin canlı hücre görüntülemesi, monokatmanlarda yetiştirilen stabil hücre hatlarında kalsiyum mobilizasyonunu incelemek için yoğun şekilde kullanılır. Bu protokol, karmaşık ve birincil dokuda canlı hücre boyaları kullanılarak kalsiyum sinyalinin canlı hücre floresans görüntülemesini tanımlar ve binlerce bireysel hücrenin floresan yoğunluğunu aynı anda nicelikten ölçmek için makine öğrenimi yazılımını kullanarak analizleri kolaylaştırır.

Otomatik hücre segmentasyonu kullanılarak birincil insan hava yolu epitelyal kültürlerinde floresans tabanlı kalsiyum görüntüleme

Öğrenin, virüs enfeksiyonunun bağırsak epitelindeki kalsiyum sinyalini nasıl bozduğunu insan bağırsak organoidleri kullanarak. Bu yöntem, viral patogenez araştırmalarında uzun süreli görüntüleme sağlar.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet