Name: Canlı Caenorhabditis elegansta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta endojen kargoların aksonal taşımasını floresan mikroskobuyla görüntülemek için edinim parametrelerini optimize etme yöntemini. Bu protokol, sinirbilim araştırmalarında canlı nöronlardaki protein dinamiklerini incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>GFP Etiketli RAB-3 Kullanılarak Canlı C. elegans'ta Aksonal Taşıma Analizinin Geliştirilmesi

<ol><li>Millecamps, S., Julien, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axonal+cytoskeleton%3A+from+organization+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The axonal cytoskeleton: from organization to function.</a> Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).</li>
<li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+unseen%3A+the+hidden+world+of+slow+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport.</a> Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).</li>
<li>Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+proteins+are+selectively+delivered+to+axons+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons.</a> Elife. 12, e82568(2023).</li>
<li>Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap%2C+a+toolkit+for+high-throughput+CRISPR%2FCas9+gene+modification+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).</li>
<li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+to+analyze+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons.</a> J Vis Exp. (128), e56690(2017).</li>
<li>Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cgc.umn.edu/">https://cgc.umn.edu/</a> (2023).</li>
<li>Ghanta, K. S., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melting+dsDNA+donor+molecules+greatly+improves+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).</li>
<li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NATF+%28Native+and+Tissue-Specific+Fluorescence%29%3A+A+strategy+for+bright%2C+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+Project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Taylor, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+topography+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular topography of an entire nervous system.</a> Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Takihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Li, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+kinesin+UNC-104%2FKIF1A+is+a+key+regulator+of+synaptic+aging+and+insulin+signaling-regulated+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory.</a> Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).</li>
<li>Viancour, T. A., Kreiter, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+fast+axonal+transport+rates+in+young+and+old+rat+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons.</a> Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).</li>
<li>Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decrease+in+axonal+transport+measured+by+MR+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo.</a> Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).</li>
<li>Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Lissencephaly-1+levels+augments+mitochondrial+transport+and+has+a+protective+effect+in+adult+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons.</a> J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Hall, D. H., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+posterior+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+serial+reconstruction+of+identified+neurons+and+complete+pattern+of+synaptic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions.</a> J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+ventral+nerve+cord+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-binding+protein+1+promotes+specific+motor-cargo+association+in+the+cell+body+prior+to+axonal+delivery+of+dense+core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles.</a> Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+homology-directed+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-wrmScarlet+and+split-sfGFP%3A+tools+for+faster%2C+easier+fluorescent+labeling+of+endogenous+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 217 (4), (2021).</li>
<li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap+assembly+of+Caenorhabditis+elegans+MosSCI+transgene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors.</a> G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).</li>
<li>Glomb, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-1+adaptor+complex+controls+bimodal+slow+axonal+transport+of+spectrin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri (22 mm x 22 mm, No1); Altın Mühür Kapak Camı</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A14</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>ChemCruz</td><td>sc-205730</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop: Nikon Ti2 ters mikroskop, Yokogawa CSU-W1 SoRa Tarama Kafası, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS kamera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA yağa daldırma objektifi, ET525/36 emisyon filtreli 488nm'de Nikon fotostimülasyon tarayıcısı</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eğirme Diski Konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>&nbsp; Nikon Ti2 için NIS elemanları AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Yazılımı&nbsp;</td></tr><tr><td>Düz önceden temizlenmiş mikroskopi slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Nematod suşu</güçlü></td><td>Tanımlayıcı</td><td>Kaynak</td><td></td></tr><tr><td>rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)</td><td>Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)</td><td>MTS1161&nbsp;</td><td>CGC'ye yatırılacak (https://cgc.umn.edu/)</td></tr></tbody></table>

canlı caenorhabditis elegans'ta floresan mikroskobu ile endojen yükün aksonal taşınmasının görüntülenmesinin optimize edilmesi

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Model sistemine ve ölçüm prosedürüne genel bakış Sinaptik vezikül öncüllerinin aksonal taşınmasını görselleştirmek için, endojen olarak GFP etiketli RAB-3'ü izledik. Burada, bir hücreye özgü promotör (glr-4p) altındaki rekombinaz Flippase ekspresyonunun, DA9 motor nöronunda endojen RAB-3'ü etiketlediği, yakın zamanda oluşturulan bir GFP::Flip-on::RAB-3 suşu6'yı kullanıyoruz. DA9 bipolar bir motor nörondur ve hücre gövdesi hayvanın arka tarafında, ventral tarafta, anüse yakın bir yerde bulunur (Şekil 1A). Ventral sinir kordonu boyunca öne doğru uzanan kısa bir dendrit ve arkaya doğru uzanan uzun bir akson içerir, bir komissür oluşturur ve daha sonra dorsal kas ve VD nöronunu innerve eden en passan sinapslar oluşturduğu dorsal sinir kordonu boyunca öne doğru ilerler 22,23,24. Asinaptik bölgede aksonal taşımayı görselleştiriyoruz; çoğu taşıma olayı tek bir odak düzlemi ile yakalanabilir (Şekil 1A). Bu bölgedeki sabit veziküllerin arka planını azaltmak için bir ilk foto-ağartma adımı uygulanır ve bu genellikle bu bölgede duraklama eğilimindedir (Şekil 1B). Hızlandırılmış videolar 3 dakika boyunca kaydedilir ve asinaptik bölge boyunca RAB-3 sinyali, bireysel taşıma olaylarını çıkarmak için bir kimografa çizilir (Şekil 1C).
Aksonal taşıma görselleştirmesini optimize etmek için edinme parametresinin ayarlanması Birçok endojen floresan etiketli proteinin düşük sinyal yoğunluğunun üstesinden gelmek için, mikroskobun edinim parametrelerinin optimize edilmesi gerekir. Taşıma olaylarının sağlam bir şekilde ölçülmesi için, bireysel taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunun, sitoplazmik arka plan veya duraklayan, sabit kargo üzerinde mümkün olduğunca parlak olması gerekir. Sinaptik vezikül öncüleri genellikle asinaptik bölgede farklı vezikül havuzlarında duraklar, bu da yeni gelen veziküllerin tespitine müdahale eder ve taşıma izlerini takip etmeyi zorlaştırır7.
Tek bir ilk floresan ağartma adımı, yeni gelen veziküllerin hareket tespitini geliştirmek için vezikül havuzlarından türetilen floresan sinyalini güçlü bir şekilde azaltabilir (Şekil 2A). Ağartma adımı, muhtemelen RAB-3'ün sitoplazmik fraksiyonunun çok düşük olması nedeniyle, sitoplazmik arka plan yoğunluğu üzerinde hareket eden RAB-3 veziküllerinin sinyalini sadece hafifçe arttırdı (Şekil 2D).
Gruplama kullanımı, bir piksel dizisini tek bir pikselde birleştirerek tek tek taşıma olaylarının arka planı üzerindeki sinyali iyileştirmek için ek bir katman sağlar. 2 x 2'lik bir gruplama, uzamsal çözünürlüğü yarıya indirecektir (burada 108.33 nm/pikselden 216.7 nm/piksele), bu da tek tek RAB-3 taşıma parçacıklarını izlemek için hala yeterlidir (Şekil 2B), ancak tek tek veziküllerin sinyal yoğunluğunu güçlü bir şekilde iyileştirir (Şekil 2D). Çok yüksek uzamsal çözünürlük gerekmedikçe, diğer birçok aksonal kargoyu görselleştirmek için gruplama da uygulanabilir.
Daha sonra, maruz kalma süresindeki değişikliklerin tek taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunu nasıl iyileştirebileceğini sorduk. Özellikle, sonraki görüntüleme zaman noktaları arasında 700 ms ile 500 ms'ye kadar maruz kalma süresinin, sinaptik vezikül öncülerinin izlenebileceği zamansal bir çözünürlük sağladığını göstermek için analize maruz kalma süresini dahil ettik (Şekil 2C, D).
Fiji ile kimografi oluşturma ve analiz etme Bir kymograf oluşturmak ve bireysel taşıma olaylarını analiz etmek için Şekil 3'teki adımları izleyin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig01.jpg"> Şekil 1: Endojen floresan RAB-3'ün aksonal taşınmasını görselleştirmek için model sistemine genel bakış. (A) Üst panel: Belirtilen arka-ön ve ventral-dorsal eksen ile nematodun genel görünümü. Motor nöron DA9 mavi olarak etiketlenmiştir. Orta panel: Belirtilen DA9 bölümlendirmesi ile üst panelde gösterilen kutulu bölgeyi yakınlaştırın. En passant sinapslar yeşil renkle gösterilmiştir, * anüsü gösterir. Aksonun vulvayı geçene kadar dorsal sinir kordonunda devam ettiğini unutmayın. Kırmızı kutu, asinaptik bölgenin bölgesini gösterir. Alt panel: Tek bir odak düzleminde proksimal aksonda RAB-3 işaretli endojen GFP'nin konfokal mikroskopi görüntüsü. Çoğu RAB-3 sinaptik bölgede kümelenmesine rağmen, asinaptik bölgede daha uzun duraklayan RAB-3 vezikül lavaboları olduğunu unutmayın. Asinaptik bölge kırmızı renkle kutulanmıştır. Ölçek: 20 μm. (B) Aksonal taşımayı görselleştirmek için hızlandırılmış bir kaydın temsili görüntüleri. Bireysel taşıma parçacıklarının sabit parçacıklar üzerinde izlenebilirliğini artırmak için, asinaptik bölge başlangıçta foto-ağartılır. Mor kutulu bölgedeki alt paneller, anterograd (turuncu ok ucu) ve retrograd (mavi ok ucu) hareket olayının bir örneğini göstermektedir. Yukarıdan aşağıya paneller ardışık zaman noktalarını temsil eder. (C) (B)'deki hızlandırılmış kayıt, bir kimograf (konum üzerinden zamanın 2D temsili) olarak çizildi. Çapraz çizgiler, eğimin hızı gösterdiği hareket olaylarını temsil eder. Dikey çizgiler durağan olayları gösterir. Mor kutu, (B)'de de gösterilen taşıma olaylarını vurgulamak için kimografinin yakınlaştırılmasıdır ve anterograd (turuncu) ve retrograd (mavi) taşıma olayları izlenir. Kesikli dikey çizgiler duraklama olaylarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig02.jpg"> Şekil 2: Endojen aksonal yükün görselleştirilmesini iyileştirmek için edinim adımlarının ve parametrelerinin optimize edilmesi. Endojen GFP::RAB-3, DA9 aksonunun asinaptik bölgesinde görüntülendi ve konfokal eğirme diski mikroskobu üzerinde tek bir odak düzleminin görüntülerini aldı. Kimografiler, anterograd (sağdan sola) ve retrograd (soldan sağa) yönde (A-C) bireysel taşıma olaylarını görselleştirmek için elde edildi. (A) Kymograflar, RAB3 taşıma olaylarını (sol kimografiler) olmadan veya entegre bir ağartma adımıyla gösterir. Ağartma adımının, ardışık taşıma olayları (turuncu ok uçları) arasındaki duraklatma olaylarının (sarı ok başlarıyla gösterilir) görselleştirilmesini iyileştirdiğini unutmayın. (B) 2 x 2 gruplamanın uygulanması, zayıf RAB3 taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunun iyileştirilmesine yardımcı olur. Görüntüler 300 ms pozlama süresinde elde edilmiştir ve (C) pozlama süresinin kademeli olarak artırılması (en solda 100 ms'den en sağda 500 ms'ye), bireysel taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunun iyileştirilmesine yardımcı olur. Görüntüler 2 x 2 gruplamada ve ilk foto ağartma adımı kullanılarak elde edildi. Tüm kymograflar toplam 3 dakikalık bir süre gösterir ve aynı ölçekte çizilir, böylece ardışık görüntüleme noktaları arasındaki daha uzun zaman aralığı nedeniyle daha az çekim zaman noktasına sahip kymografların toplam kymograf uzunluğu daha kısadır. (D) (AC)'deki kimograflardan arka plan floresansının çıkarılmasından sonra taşıma olayı başına sinyal yoğunluğunun ölçülmesi. Gruplama ve fotoğraf ağartma adımının 300 ms pozlama süresinde elde edildiğini unutmayın. 100 ms (nolay= 27hayvan= 2), 200 ms (nolay= 30 nhayvan= 2), 300 ms (nolay= 88 nhayvan= 6), 500 ms (nolay= 12n hayvanda= 1), (w.o.) gruplamasız 300 ms(n olay= 31hayvanda= 3), 300 ms (w) gruplamalı (nolay= 88n hayvanda= 6) ve 300 ms, Ağartma ile 2 x 2 gruplama (nolay= nhayvanda = 88) ve ağartma olmadan. Her veri noktası, rastgele seçilen izi boyunca tek bir zaman noktasında arka plan (aksonun sitoplazması) çıkarılmasından sonra bireysel bir RAB-3 taşıma olayının sinyal yoğunluğunu temsil eder. Maruz kalma süresi bir Kruskal-Wallis testi kullanılarak karşılaştırıldı, ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırması, gruplama ve foto ağartma, ikili bir Mann-Whitney testi kullanılarak karşılaştırıldı. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig03.jpg"> Şekil 3: Bir kimografi oluşturmak ve bireysel taşıma olaylarını ölçmek için adım adım prosedür. (A) Video kaydını Fiji'ye yükledikten sonra, analiz edilecek olan aksonal segmentin uzunluğu boyunca bir çizgi izlemek için segmentli çizgi aracı kullanılır. (B) Sol panelde gösterilen parametrelerle Kymoreslicewide eklentisi kullanılarak bir kymograf (sağ panel) oluşturulur. (C) Bireysel taşıma olayları, doğrusal çizgi aracıyla izlenir ve ROI yöneticisine saklanır. Sağdaki panel, sonuç tablosunu oluşturmak için kullanılan ölçüm ayarlarını gösterir. (D) Tablodaki sonuçlar taşıma parametresini hesaplamak için kullanılır. Kutular, protokolün yöntemler bölümünde açıklanan önemli parametreleri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

optimizing-visualization-axonal-transport-endogenous-cargo

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri...

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Bu video, nöronal veziküllerin hareketlerini görselleştirmek için belirli floresan proteinlerle nasıl etiketlendiğini gösterir. İlk olarak, bir floresan proteini kodlayan bir plazmit, bir transfeksiyon ajanı ile inkübe edilir ve daha sonra bir nöron kültürüne sokulur. Daha sonra, veziküllerin hareketini izlemek için nöronların görüntüleri elde edilir ve analiz edilir.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

Veziküller veya organeller gibi yüklerin hücre içi taşınması, polarize mikrotübüller üzerinde izlenen moleküler motor proteinler tarafından gerçekleştirilir. Bu protokol, nöronların içinde hareket eden bireysel kargo parçacıklarının taşınma yönlülüğünün, ilişkili motor proteinlerin nispi miktarı ve türü ile korelasyonunu tanımlar.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Bu protokol, yaşlanma sırasında C. elegans'ın çoklu dokularında mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için standart bir yaklaşım sağlar.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Burada, geniş alan mikroskobu görüntülerinde tek tek solucanların otomatik segmentasyonu için geliştirdiğimiz bir derin öğrenme sistemi olan SegElegans'ın daha sonra ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında kullanılmak üzere etkin bir şekilde kullanılmasına ilişkin talimatlar sunuyoruz. Sistemi hem çevrimiçi hem de çevrimdışı kullanmanın yollarını sunuyoruz.

SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta endojen kargoların aksonal taşımasını floresan mikroskobuyla görüntülemek için edinim parametrelerini optimize etme yöntemini. Bu protokol, sinirbilim araştırmalarında canlı nöronlardaki protein dinamiklerini incelemeyi kolaylaştırır.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Daha fazla video keşfet