Name: Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüs Ekspresyon Vektör Yapısı için Kesintisiz Bir Klonlama Yaklaşımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Öğrenin, homolog rekombinasyon ve çoklu DNA parça birleştirme yöntemiyle PRRSV gen ekspresyon vektörü oluşturmayı. Bu yaklaşım, moleküler biyoloji ve viral genetik çalışmalarında karmaşık klonlama süreçlerini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Batı Normal Üniversitesi (No. 20E059) tarafından sağlanan doktora araştırma başlatma fonlarının mali desteği ile desteklenmiştir.

1. PRRSV geninin şablonunun hazırlanması
<ol><li>Virüs stoğunu 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi içinde çözün (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>0.2 mL kloroform ekleyin ve iyice karıştırın. 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Karışımı 4 ° C'de 12.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin. NOT: Karışım, renksiz bir sulu faz, bir interfaz ve bir kırmızı fenol-kloroform faz olmak üzere üç faza ayrılır.</li>
	<li>Renksiz sulu fazı pipetleyin ve yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Sulu fazı 0,5 mL izopropanol ile iyice karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>4 ° C'de 12.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. NOT: Tüpün alt kısmında beyaz bir RNA çökeltisi vardır.</li>
	<li>Tüpün süpernatantını atmak için bir mikropipet kullanın.</li>
	<li>Peleti yeniden süspanse etmek ve kısaca girdap yapmak için 1 mL %75 etanol ekleyin.</li>
	<li>4 ° C'de 7.500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün süpernatantını atmak için bir mikropipet kullanın.</li>
	<li>RNA'yı 5 dakika kurutun, RNA'yı yeniden süspanse etmek için 20-50 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Ters transkripsiyon yapmaya devam edin; Tablo 1'de gösterildiği gibi ters transkripsiyon gerçekleştirmek için reaksiyonları ayarlayın. NOT: Başarılı bir ters transkripsiyon sağlamak için yüksek kaliteli RNA şablonları kullanın.</li>
	<li>Elde edilen cDNA'yı PCR için kullanın veya -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. PCR astar tasarımı
<ol><li>İleri astarın tasarlanması<ol><li>Yazılımı açın ve Yeni DNA Dosyası'nı seçin.</li>
		<li>PRRSV gen dizisini (GenBank: FJ548852.1) NCBI'den yazılıma yapıştırın. Sıra dosyalarını oluşturmak için Tamam'a tıklayın.</li>
		<li>Diziyi analiz edin ve parça bağlantılarını işaretleyin. Parçaların ileri spesifik dizi astarını tasarlayın. Çoğu durumda, tercih edilen erime sıcaklığı (Tm) 55 °C ile 62 °C arasındadır ve GC içeriği %40-60'tır.</li>
		<li>Primer'lara tıklayın ve Primer Ekle'yi seçin.</li>
		<li>Spesifik diziyi yapıştırın ve vektörün örtüşme dizilerini, belirli dizi astarının ilk 5' nükleotidine ekleyin. Her kavşağın yakınında, iki bitişik parça arasındaki örtüşme bölgesi olarak hizmet etmek için 20-40 bp seçin.</li>
		<li>Çıkıntıları ve belirli sırayı içeren ön astarı adlandırın (bkz. Ek Şekil S1).</li>
		<li>Şablona astar ekle'ye tıklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Ters astarın tasarlanması<ol><li>Sırayı analiz edin ve yazılımdaki parça bağlantılarını işaretleyin. Parçaların ters spesifik dizi astarını tasarlayın.</li>
		<li>Primer'lara tıklayın ve Primer Ekle'yi seçin.</li>
		<li>Spesifik diziyi yapıştırın ve kısıtlama bölgesini belirli dizi astarının ilk 5' nükleotidine ekleyin. NOT: Eklenen kısıtlama bölgeleri, çoklu klonlama siteleri dışında, ekleme parçasında ve vektörde bulunmamalıdır.</li>
		<li>Kısıtlama bölgesinin ilk 5' nükleotidine 20-40 bp çıkıntı vektör dizileri ekleyin.</li>
		<li>Çıkıntıları ve spesifik sırayı içeren ters astarı adlandırın (bkz. Ek Şekil S1).</li>
		<li>Şablona astar ekle'ye tıklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Parçaları yükseltmek için PCR
<ol><li>Altı ayrı PCR reaksiyonu ayarlayın (Tablo 2): fragman 1 için P1 ve P2 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 2 için, P3 ve P4 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 3 için, P5 ve P6 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 4 için, P7 ve P8 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 5 için P9 ve P10 primerlerini kullanın; ve fragman 6'yı büyütmek için P11 ve P12 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2). NOT: Kullanmadan önce her bir bileşeni çözdürün, karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.</li>
	<li>Tablo 2'deki üç adımlı protokolü kullanarak PCR'yi çalıştırın.</li>
	<li>5 μL PCR ürününe 1 μL 6x DNA yükleme tamponu ekleyin, karıştırın ve içeriği kısaca santrifüjleyin.</li>
	<li>Numuneleri %1 agaroz jel elektroforezi kullanarak analiz edin.</li>
</ol>4. PCR fragmanlarının saflaştırılması
NOT: PCR ürünlerinin bir jel ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak bir jelden saflaştırılması, vektör yapımı için önemlidir.
<ol><li>45 μL PCR ürününe 9 μL 6x DNA yükleme tamponu ekleyin, karıştırın ve içeriği kısaca santrifüjleyin.</li>
	<li>DNA parçalarını ayırmak için %1 agaroz jel/goldview elektroforezi gerçekleştirin. NOT: pH değeri DNA fragmanı geri kazanımını etkileyeceğinden TAE çalışan tamponu tekrar kullanmayın.</li>
	<li>Bantların yeterince ayrılmasından sonra, DNA bantlarını dikkatlice çıkarmak için keskin bir neşter kullanın. NOT: Fazla agarozu keserek jel diliminin boyutunu en aza indirin.</li>
	<li>Jel dilimini temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde tartın, jel dilimine eşit hacimde bir bağlayıcı tampon ekleyin (ör., 0.3 mL ila 0.3 g'lık bir dilim) ve 60 ° C'de 7 dakika inkübe edin.</li>
	<li>2 mL'lik bir toplama tüpüne mini bir sütun yerleştirin. Adım 4.4'ten mini kolona 700 μL DNA/agaroz çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve toplama tüpünü tekrar kullanın.</li>
	<li>300 μL bağlayıcı tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve toplama tüpünü tekrar kullanın.</li>
	<li>700 μL yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve toplama tüpünü tekrar kullanın.</li>
	<li>Sütun matrisini kurutmak için boş mini sütunu maksimum hızda 2 dakika döndürün. Mini sütunu temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>20 μL deiyonize suyu doğrudan kolon zarının ortasına ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika bekletin. 13.000 × g hızında 1 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>DNA'yı -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>5. Doğrusallaştırılmış bir vektörün hazırlanması
NOT: Plazmidi hazırladıktan sonra, seçilen enzimler onu kesmek için kullanılabilir. Uzun sindirim veya çift enzimli sindirim, tüm DNA'nın sindirimini sağlamak için çok önemlidir. Bu, sonraki deneylerde yanlış pozitif klonların sayısını azaltacaktır.
<ol><li>pVAX1 doğrusallaştırma
	<ol><li>Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında belirtilen sırayla hazırlayın (Tablo 3). NOT: Belirtilen toplam reaksiyon hacmini korumak için su hacmi eklenmelidir. Burada, 1 μg plazmit, reaksiyon karışımındaki enzimlerle sindirildi. Plazmit konsantrasyonuna bağlı olarak, reaksiyon karışımında plazmitin hacmi ayarlanabilir.</li>
		<li>Yavaşça karıştırın; Sonra aşağı döndürün. 37 °C'de bir ısı bloğunda veya su termostatında 60 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Jel ekstraksiyon kitini kullanarak bölüm 4'teki PCR fragmanlarının saflaştırılmasına benzer jel saflaştırması gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	</ol></li>
	<li>pVAX1-F1 doğrusallaştırma NOT: pVAX1-F1, pVAX1'in ilk turundan (NdeI ve HindIII) ve fragman 1 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F2, pVAX1-F1 (NdeI) turundan ve fragman 2 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F3, pVAX1-F2 (NdeI) turundan ve parça 3 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F4, pVAX1-F3 (NdeI) turundan ve fragman 4 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F5, pVAX1-F4 (EcoRV ve NtoI) turundan ve fragman 5 rekombinasyonundan elde edilen vektördür.<ol><li>Her vektör için, reaksiyon karışımını oda sıcaklığında belirtilen sırayla ayrı ayrı hazırlayın (Tablo 3).</li>
		<li>Yavaşça karıştırın; Sonra aşağı döndürün. 37 °C'de bir ısı bloğunda veya su termostatında 60 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Jel ekstraksiyon kitini kullanarak bölüm 4'teki PCR fragmanlarının saflaştırılmasına benzer jel saflaştırması gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Yeni bir vektöre alt klonlama
NOT: 50-200 ng vektör ve ekler kullanıldığında iyi klonlama verimliliği elde edilebilir.
<ol><li>ExonArt dikişsiz klonlama ve montaj reaksiyonunu ayarlayın (Tablo 4). Sterilize deiyonize H2O kullanarak toplam reaksiyon hacmini 10 μL'ye ayarlayın ve karıştırın.</li>
	<li>Reaksiyonu bir termodöngüleyicide 50 ° C'de 15-60 dakika inkübe edin. Numuneleri buz üzerinde saklayın. NOT: Kuluçkanın 60 dakikaya kadar uzatılması montaj verimliliğini artırabilir.</li>
	<li>DH5α kimyasal olarak yetkin hücreleri buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>Yetkili hücrelere 10 μL montaj ürünü ekleyin; Ardından, yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.</li>
	<li>Karışımı 30 dakika buzun üzerine koyun.</li>
	<li>45 ° C'de 45 saniye boyunca şok uygulayın ve tüpleri 3 dakika boyunca buzun üzerine aktarın.</li>
	<li>Tüpe 900 μL SOC ortamı ekleyin.</li>
	<li>Tüpü 37 ° C çalkalama makinesinde, 1 saat boyunca 225 rpm'de çalkalayın.</li>
	<li>Dönüşüm reaksiyonunu 6.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 100 μL taze SOC ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Dönüştürülmüş hücre süspansiyonunu 50 μg/mL kanamisin içeren ayrı bir LB plakasına yayın.</li>
	<li>Tüm plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Her deney plakasından ayrı ayrı izole koloniler seçin.</li>
</ol>7. Dönüştürücülerin analiz edilmesi
<ol><li>50 μg / mL kanamisin içeren 20 μL LB ortamına sekiz koloni seçin.</li>
	<li>Koloni PCR reaksiyonunu ayarlayın ve PCR'yi çalıştırın (Tablo 5). NOT: Fragman 1 için koloni PCR reaksiyonu için, P1 ve P2 primerlerini kullanın (bkz. Ek Dosya 1); fragman 2 için, P3 ve P4 primerlerini kullanın (Ek Dosya 1'e bakınız); fragman 3 için, P5 ve P6 primerlerini kullanın (Ek Dosya 1'e bakınız); fragman 4 için, P7 ve P8 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 5 için P9 ve P10 primerlerini kullanın; ve fragman 6'yı tespit etmek için P11 ve P12 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2).</li>
	<li>5 μL PCR ürününe 1 μL 6x DNA yükleme tamponu ekleyin, karıştırın ve içeriği kısaca santrifüjleyin.</li>
	<li>Sonuçları %1 agaroz jel elektroforezi kullanarak analiz edin.</li>
	<li>50 μg/mL kanamisin içeren 5 mL LB ortamına bir pozitif koloni seçin ve gece boyunca 37 °C'de büyütün.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre bir plazmid DNA mini kiti ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak plazmidi elde edin.</li>
	<li>%1 agaroz jel elektroforezi kullanarak sonuçları görselleştirin.</li>
</ol>

pVAX1 Ekspresyon Vektöründe Tam Uzunlukta PRRSV Geninin Klonlanması

<ol><li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning.</a> Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).</li>
<li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J. Biol. Eng. 2, 5(2008).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Horton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+recombination+and+mutagenesis.+SOEing+together+tailor-made+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes.</a> Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).</li>
<li>Bang, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+by+circular+assembly+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis by circular assembly amplification.</a> Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).</li>
<li>Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USER+fusion%3A+a+rapid+and+efficient+method+for+simultaneous+fusion+and+cloning+of+multiple+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 35 (7), e55(2007).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Cho, J. G., Dee, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Porcine reproductive and respiratory syndrome virus.</a> Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).</li>
<li>Holtkamp, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+on+United+States+pork+producers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Swine+Health+Prod%22%5BJournal%5D)">Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers.</a> J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).</li>
<li>Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+economic+effects+of+vaccination+against+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome%3A+Impact+of+vaccination+effectiveness%2C+vaccine+price%2C+and+vaccination+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage.</a> Front Vet Sci. 7, 500(2020).</li>
<li>Dwivedi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+immune+responses+to+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+pigs+during+early+stage+of+infection+under+farm+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions.</a> Virol J. 9, 45(2012).</li>
<li>Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+consequences+of+exposing+pregnant+gilts+to+strains+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+%28PRRS%29+virus+isolated+from+field+cases+of+%26%2334%3Batypical%26%2334+PRRS%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of &#34;atypical&#34 PRRS.</a> Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+the+spread+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+endemically+infected+pig+herds+by+nursery+depopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Rec%22%5BJournal%5D)">Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation.</a> Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+control+PRRS%3A+a+summary+of+field+and+research+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences.</a> Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).</li>
<li>Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+vaccines%3A+Current+status+and+future+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction.</a> Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).</li>
<li>Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%2C+a+member+of+the+arterivirus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group.</a> Virology. 193 (1), 329-339 (1993).</li>
<li>Han, M. Y., Yoo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+PRRS+virus+genome%3A+Updates+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives.</a> Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction-based+multiple-fragment+assembly+strategy+to+avoid+random+mutation+during+long+cDNA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning.</a> J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).</li>
<li>Zhang, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+outbreak+in+four+Chinese+farms%3A+Based+on+cost+and+revenue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis.</a> Front Vet Sci. 9, 1024720(2022).</li>
<li>Chen, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+genetic+diversity+of+Chinese+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+viruses+from+2016+to+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019.</a> Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).</li>
<li>Wang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Zhang, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+infectious+clone+of+HuN4-F112%2C+an+attenuated+live+vaccine+strain+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+high+copy+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid.</a> Virol J. 8, 410(2011).</li>
<li>Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+DNA-launched+infectious+clone+for+a+highly+pneumovirulent+strain+of+type+2+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%3A+identification+and+in+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+large+spontaneous+deletion+in+the+nsp2+region%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region.</a> Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Gibson montaj tekniği, DNA fragmanlarınınbirleştirilmesi için in vitro rekombinasyon tabanlı bir moleküler klonlama yöntemidir 8. Bu yöntem, birden fazla DNA fragmanının, tek tüplü bir izotermal reaksiyonda dairesel bir plazmide birleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, Gibson Assembly tekniğinin önündeki engellerden biri, cDNA'dan uzun parçaların elde edilmesidir. Uzun parçaların birçok nedenden dolayı doğru bir şekilde büyütülmesi zordur. Örneğin, primerlerin uzun uzama süreleri boyunca uyumsuzluğu daha kolaydır, cDNA iyi kalitede olmayabilir veya GC açısından zengin bölgeler DNA polimerizasyonunu durduracaktır. Tam uzunluktaki fragman, PCR kullanılarak cDNA'dan kolayca elde edilemediğinde, tam uzunluktaki fragmanın amplifikasyon için birden fazla fragmana bölünmesi gerekir. Bununla birlikte, eklenen DNA fragmanlarının sayısı ve uzunluğu arttıkça, homolog rekombinasyon testinden elde edilen verimlilik ve pozitif klonlar da önemli ölçüde azalacaktır. Bu nedenle, eklerin 3' ucuna uygun kısıtlama bölgeleri ekleyerek alternatif bir çözüm denedik. Daha sonra, vektörü doğrusallaştırabilir ve homolog rekombinasyon teknolojisi ile DNA parçalarını tek tek vektöre birleştirebilir ve homolog rekombinasyon reaksiyonu yoluyla istenmeyen kısıtlama bölgelerini ortadan kaldırabiliriz.
Küresel pazarlarda ekonomik açıdan en önemli patojenlerden biri olan PRRSV, son 30 yılda her zaman araştırmacıların dikkatini çekmiştir 10,21,22. Yaklaşık 15 kb uzunluğunda pozitif sarmallı bir RNA virüsüdür ve uzun DNA fragmanı cDNA'dan kolayca amplifiye edilemez. Bu nedenle, bu yöntemin uzun parçaların klonlanması için kullanılıp kullanılamayacağını araştırmak için, PRRSV'yi tam uzunlukta genom klonlaması için bir şablon olarak kullandık. Bu çalışmada, tam uzunluktaki diziyi altı fragmana böldük ve ters primere uygun kısıtlama bölgeleri ekledik ve PCR ile altı fragman elde ettik. Daha sonra birkaç tur rekombinasyon reaksiyonu ile tam uzunlukta pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü başarıyla elde ettik. Ek olarak, yapılandırılmış PRRSV ekspresyon vektörü, transfeksiyon veya mRNA aşı araştırması için kapaklı RNA'lar elde etmek için in vitro transkripsiyon için bir şablon görevi görebilir. Bu arada, yapılandırılmış mRNA virüsü plazmidi, yüzey plazmon rezonansı23,24 gibi moleküler etkileşim teknikleri yoluyla in vitro olarak antiviral doğal bileşiklerin toplu taraması için kullanılabilir. pVAX1 plazmidi gereksinimleri karşılar çünkü bir in vitro transkripsiyon testi, bir T7 promotörü ile yüksek kopyalı bir plazmit gerektirir. Ayrıca, CMV promotörü içeren pVAX1-PRRSV plazmidi, viral genom ekspresyonu25,26 için BHK-21 hücrelerine transfekte edilebilir.
Özetle, bu protokolle, uzun tam uzunluktaki genlerin PCR amplifikasyonu ile elde edilen birkaç parçaya bölünebileceğini gösteriyoruz. Tam uzunlukta gen ekspresyon vektörünün birkaç tur rekombinasyon reaksiyonu ile elde edilebilmesi için ters primerlerin uygun kısıtlama bölgelerine sokulması önemlidir. Bu yöntem, tek bir PCR ile doğrudan elde edilemeyen tam uzunluktaki genler için veya çoklu insertlerin homolog rekombinasyonu ile elde edilemeyen tam uzunluktaki genler için kullanılabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım Gibson Assembly tekniğinin önemli bir tamamlayıcısıdır, uzun DNA parçalarının klonlanması ve füzyon gen yapımı için yaygın olarak kullanılabileceğini tahmin ediyoruz.

Prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde ekspresyon için DNA tabanlı deneysel araçlar oluşturmak için temel bir teknik olan moleküler klonlama, deneysel biyolojinin çok önemli bir bileşenidir. Moleküler klonlama dört işlemi içerir: insert DNA'nın elde edilmesi, insertin uygun vektöre bağlanması, rekombinant vektörün Escherichia coli'ye (E. coli) dönüştürülmesi ve pozitif klonların tanımlanması1. Şimdiye kadar, restriksiyon enzimleri 2,3 ve PCR aracılı rekombinasyon 4,5,6 kullanılarak DNA moleküllerini birleştirmek için birden fazla yöntem benimsenmiştir. Dikişsiz klonlama teknolojisi olarak bilinen homolog rekombinasyon, bir veya daha fazla DNA parçasının bir vektöre diziden bağımsız ve yara izi bırakmadan yerleştirilmesine izin veren klonlama yöntemleri grubudur. Bu teknoloji, dizi ve ligasyondan bağımsız klonlama (SLIC), Dikişsiz Ligasyon Klonlama Özü (SLiCE), In-Fusion ve Gibson Assembly'yi içerir. Kesici ucun bir zincirini bozmak için bir eksonükleaz ve yapışkan uçlar oluşturmak için bir vektör kullanır ve fosfodiester bağları oluşturarak eki vektöre kovalent olarak birleştirmek için in vivo onarım veya in vitro rekombinasyon kullanır. Herhangi bir dizide herhangi bir sekansta tek bir eki herhangi bir yara izi olmadan bir vektöre birleştirme yeteneği çok çekici. Ayrıca teknoloji, dizi kısıtlaması olmaksızın önceden belirlenmiş bir sırayla 5-10 parçayı birleştirme yeteneğine sahiptir.
Birçok rekombinant DNA tekniğinden biri olarak, şu anda en etkili klonlama yöntemi olan Gibson Assembly tekniği 7,8, bir veya birden fazla doğrusallaştırılmış DNA parçasını sorunsuz bir şekilde birleştirmek için sağlam ve zarif bir eksonükleaz bazlı yöntemdir. Gibson Assembly reaksiyonu, izotermal koşullar altında, 5' eksonükleaz, yüksek kaliteli polimeraz ve termostabil bir DNA ligaz olmak üzere üç enzimin bir karışımı kullanılarak gerçekleştirilir. 5'-3' eksonükleaz tarafından oluşturulan tek iplikli 3' çıkıntılar, bir uçta tamamlayıcılığı paylaşan parçaların tavlanmasına katkıda bulunur. Yüksek kaliteli polimeraz, dNTP'ler ekleyerek tavlanmış tek sarmallı bölgelerdeki boşlukları etkili bir şekilde doldurur ve termostabil DNA ligaz, eklem DNA molekülleri oluşturmak için çentikleri kapatır8. Bu nedenle, bu teknik yöntem, gen ekspresyon vektörlerinin inşası için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Domuz üreme ve solunum sendromu (PRRS), herhangi bir9 yaşında PRRSV'nin neden olduğu domuzlarda üreme bozukluğuna ve solunum yetmezliğine yol açan viral bir hastalıktır. Sendrom ateş, iştahsızlık, zatürree, uyuşukluk, depresyon ve solunum sıkıntısı ile kendini gösterir. Ayrıca, bazı salgınlarda kulaklarda kırmızı / mavi renk değişikliği de dahil olmak üzere klinik belirtiler gözlenmiştir. Arteriyor ailesinin bir üyesi olan PRRSV, idrar, kolostrum ve tükürük dahil olmak üzere sıvıların doğrudan teması ve değişimi yoluyla domuz eti üreten ülkelere yaygın olarak bulaşır. Amerika Birleşik Devletleri'nde PRRSV'nin yayılması nedeniyle, domuz endüstrisinin toplam ekonomik kayıplarının, 664 milyon domuz ve 5.8 milyon domuzun üreme ölçeğine dayalı olarak yılda yaklaşık 110 milyon dolar olduğu tahmin edilmektedir10,11. Hayvan ve Bitki Sağlığı Denetim Servisi raporu, aşılanmamış domuzların %49,8'inin serumdaPRRSV varlığını gösterdiğini 12 ve enfekte domuzlarda düşük PRRSV seviyelerinin tükürük, burun salgıları, idrar ve dışkı yoluyla atıldığınıgöstermektedir 13. PRRSV yayılımını kontrol etmek için çoklu stratejiler uygulanmıştır 14,15,16. Tamamen virüs negatif popülasyonlar oluşturmak veya biyogüvenlik ve yönetimi iyileştirmek için eliminasyon prosedürlerine ek olarak, aşıların uygulanması PRRS'yi kontrol etmenin etkili bir yoludur.
PRRSV, yaklaşık 15 kilobaz (kb) uzunluğunda, zarflı, tek sarmallı, pozitif anlamlı bir RNA virüsüdür. PRRSV genomu, en az 10 açık okuma çerçevesi (ORF), kısa bir 5' çevrilmemiş bölge (5' UTR) ve 3' terminalinde bir poli(A) kuyruktan oluşur (Şekil 1A)17. Negatif sarmallı bir RNA virüsünün genomu bulaşıcı değildir, oysa pozitif sarmallı RNA virüslerinin genomu bulaşıcıdır. Virüs döllerini oluşturmak için RNA ve DNA transfeksiyonu için iki ana strateji vardır18. Bununla birlikte, RNA genomuna karşılık gelen tam uzunluktaki parçanın klonlanması, bulaşıcı klonların inşası için çok önemlidir. PRRSV genomunun uzun ve karmaşık doğası nedeniyle, tam uzunlukta genom bir kerede PCR yoluyla kolayca elde edilemez. Ek olarak, PRRSV genlerinin yapay sentezi etkili bir çözüm olmasına rağmen, uzun parçaların sentezi genellikle pahalıdır. Bu nedenle, PRRSV tam uzunlukta ifade vektörünü elde etmek için, onu çoklu ekler homolog rekombinasyon yöntemi19,20 ile oluşturmaya çalıştık. Ne yazık ki, tam uzunlukta gen ekspresyon vektörünü elde edemedik. Bu nedenle, bu çalışmada, ters primere uygun kısıtlama bölgeleri ekledik ve birkaç tur homolog rekombinasyon reaksiyonu ile pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü başarıyla elde ettik. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda hedef genlerin silinmesini veya mutasyona uğratılmasını sağlayabilir ve çok sayıda DNA parçasını ekspresyon vektörüne verimli bir şekilde birleştirebilir.

<table><tbody><tr><td>1 kb artı DNA Merdiveni</td><td>Tiangen Biyokimyasal Teknoloji (Pekin) Co., Ltd</td><td>MD113-02</td><td></td></tr><tr><td>2x Evrensel Yeşil PCR Master Mix</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A303-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co., Ltd.</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah Üstü</td><td>Mikrosantrifüj Thermo Fisher Scientific & nbsp; Co., Ltd</td><td>FRESCO17</td><td></td></tr><tr><td>Temiz Tezgah</td><td>Sujing Antai Air Technology & nbsp; Co., Ltd</td><td>VD-650-U</td><td></td></tr><tr><td>DNA Elektroforez Ekipmanları</td><td>Cleaver Scientific &nbsp; Co., Ltd</td><td>170905117</td><td></td></tr><tr><td>DNA Yükleme Tamponu (6x)</td><td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td><td>BL532A</td><td></td></tr><tr><td>E. Z. N. A. Jel Ekstraksiyon kiti</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D2500-01</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plazmid DNA Mini Kit I</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>Elektro-ısıtma Daimi Sıcaklık Kültivatörü</td><td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>DHP-9082</td><td></td></tr><tr><td>ExonArt Dikişsiz Klonlama ve Montaj kiti</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A101-02</td><td></td></tr><tr><td>ExonScript RT SuperMix ile dsDNase</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A502-1</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0303</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HindIII</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0504</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NheI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0974</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NotI</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0596</td><td></td></tr><tr><td>Jel Doc XR</td><td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td><td>721BR07925</td><td></td></tr><tr><td>Goldview Nükleik Asit Jel Lekesi</td><td>Şangay Yubo Biyoteknoloji Co, Ltd</td><td>YB10201ES03</td><td></td></tr><tr><td>Buz Makinesi Makinesi</td><td>Şanghay Bilang Enstrüman İmalat A.Ş., Ltd</td><td>FMB100</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polimeraz</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp; Co., Ltd</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Plakası (Kanamisin)</td> <td>Sangon Biotech (Şangay) Co., Ltd.</td><td>B530113-0010</td><td></td></tr><tr><td>LB steril sıvı ortam (Kanamisin)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B540113-0001</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetleyiciler</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp; Co., Ltd</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga Fırın</td><td>Panasonic Electric (Çin) Co., Ltd</td><td>NN-GM333W</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcılar</td><td>Şangay Zhicheng Analitik Alet İmalat Co, Ltd</td><td>ZHWY-2102C</td><td></td></tr><tr><td>PRRSV virüsü</td><td>Sichuan Ziraat Üniversitesi</td> <td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>GSL Biotech, LLC</td><td>v5.1</td><td>Primer tasarlamak için</td></tr><tr><td>T100 PCR Gradyan Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad Laboratories&nbsp; Co., Ltd</td><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td></td></tr><tr><td>TAE tamponu</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B040123-0010</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp; Co., Ltd</td><td>15596026</td><td>RNA ekstraksiyon reaktifi</td></tr></tbody></table>

domuz Üreme ve solunum sendromu virüs ekspresyon vektör yapısı için kesintisiz bir klonlama yaklaşımı

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

Gen ekspresyon vektörlerinin inşası, deneysel biyolojide laboratuvar çalışmalarının önemli bir bileşenidir. Gibson Assembly gibi teknik gelişmelerle vektör yapımı nispeten basit ve verimli hale geliyor. Bununla birlikte, Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüsünün (PRRSV) tam uzunluktaki genomu, cDNA'dan tek bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile kolayca amplifiye edilemediğinde veya çoklu eklerin homolog rekombinasyonu ile tam uzunlukta bir gen ekspresyon vektörü elde etmek zor olduğunda in vitro, mevcut Gibson Assembly tekniği bu hedefe ulaşmakta başarısız olur.
Sonuç olarak, PRRSV genomunu birkaç fragmana bölmeyi ve PCR ile amplifiye edilmiş fragmanları elde etmek için ters primere uygun kısıtlama bölgelerini sokmayı amaçladık. Önceki DNA fragmanını homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektöre kattıktan sonra, yeni vektör kısıtlama enzimi bölünme bölgesini elde etti. Böylece, yeni eklenen enzim bölünme bölgesini kullanarak vektörü doğrusallaştırabilir ve bir sonraki DNA parçasını, yukarı akış DNA parçasının akış aşağısına sokabiliriz.
Yukarı akış DNA fragmanının 3' ucuna eklenen kısıtlama enzimi bölünme bölgesi elimine edilecek ve aşağı akış DNA fragmanının 3' ucuna yeni bir bölünme bölgesi eklenecektir. Bu şekilde DNA parçalarını tek tek vektöre birleştirebiliriz. Bu yöntem, PRRSV ifade vektörünü başarılı bir şekilde oluşturmak için uygulanabilir ve çok sayıda parçayı ifade vektörüne monte etmek için etkili bir yöntemdir.

Bu yazıda, sürekli olarak eklenen kısıtlama bölgeleri aracılığıyla ters primer kullanarak örtüşen DNA moleküllerini birleştirmek ve onarmak için bir in vitro rekombinasyon sistemi sunuyoruz (Şekil 1B). Bu sistem, doğrusal vektörün ve PCR tarafından getirilen çıkıntıları içeren kesici uç parçalarının, uygun 5' uzatma dizilerine ve kısıtlama bölgelerine sahip primerlerle hazırlanmasını içeren basit ve verimli bir prosedürdür; bir in vitro tek izotermal reaksiyon ve rekombinasyon ürünlerinin uygun konakçı bakterilere standart kimyasal dönüşümü; ve pozitif bir koloninin seçimi ve bir sonraki klonlama turu için rekombinant vektörün elde edilmesi. pVAX1-PRRSV vektörünü adım adım elde etmek için, rekombinant vektörün eklerinde ve çoklu klonlama bölgelerinde kısıtlama bölgeleri bulunmamalıdır.
Tek bir PCR ile tam uzunlukta ve karmaşık gen dizileri elde etmek zor olduğundan, PRRSV'nin insert fragmanları sadece altı PCR reaksiyonu ile amplifiye edilebilir (Şekil 1C). İlk rekombinasyon turu sırasında, PRRSV'nin Fragman 1'i, pVAX1 vektörüne başarıyla yerleştirildi ve tanıtılan kısıtlama bölgeleri (NheI, tek bir enzim bölünme bölgesi) ile yeni rekombinant plazmit, pVAX1-F1 olarak adlandırıldı (Şekil 1D). İkinci rekombinasyon turunda, pVAX1-F1 vektörü, kısıtlama enzimi NheI ile doğrusallaştırıldı. Fragman 2, pVAX1-F1 vektörüne başarıyla yerleştirildi ve rekombinant plazmid pVAX1-F2'yi kısıtlama bölgeleriyle birlikte verdi (NheI, tek bir enzim bölünme bölgesi) (Şekil 1D). Üçüncü rekombinasyon turu için, Şekil 1D'de gösterildiği gibi, fragman 3, kısıtlama bölgeleri (NheI, tek bir enzim bölünme bölgesi) ile pVAX1-F3 elde etmek için pVAX1-F2 vektörüne başarıyla yerleştirildi. Dördüncü rekombinasyon turunda, pVAX1-F4 vektörünü, kısıtlama bölgeleri EcoRV (tek bir enzim bölünme bölgesi) ile fragman 4'ü ekleyerek elde ettik. Daha sonra, pVAX1-F4 vektörü, kısıtlama enzimi EcoRV tarafından doğrusallaştırıldı ve I Değil, Fragman 5, kısıtlama bölgeleri ile pVAX1-F5 elde etmek için pVAX1-F4 vektörüne klonlandı (Ideğil, tek bir enzim bölünme bölgesi). Son rekombinasyon turundan sonra, PRRSV tam uzunlukta aşırı ekspresyon vektörü (pVAX1-PRRSV) başarıyla elde edildi (Ek Dosya 1). Şekil 1D'de gösterildiği gibi, yeni rekombinant plazmit, fragmanların sürekli eklenmesiyle daha da büyür. Bu nedenle, bu sonuçlar, uygun kısıtlama bölgelerinin eklenmesi ve Gibson Assembly tekniğinin kullanılmasının kombinasyonunun, DNA parçalarının vektöre verimli bir şekilde sokulmasını sağlayabileceğini göstermiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66320/66320fig01.jpg"> Şekil 1: Homolog rekombinasyon ile pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) vektörlerinin organizasyonu ve yapımı. (A) PRRSV genomunun organizasyonu. ORF1b, RNA'ya bağımlı RNA polimeraz, RNA helikaz ve çok çekirdekli çinko bağlama alanlarını kodlar. Diğer ORF'ler, zarla ilişkili glikoproteinleri (GP2, GP3, GP4 ve GP5), E proteinini, zar zarf proteinini ve nükleokapsid proteinini kodlar. (B) pVAX1-PRRSV vektörünün oluşturulma sürecinin şematik diyagramı. (C) DNA agaroz jeli, hedef fragmanların PCR amplifikasyonunu gösterir. (D) Fragmanların eklenmesiyle, rekombinant vektörün boyutu kademeli olarak artar. Kısaltmalar: PRRSV = Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüsü; ORF = açık okuma çerçevesi; GP = glikoprotein; E = E proteini; M = zar zarf proteini; N = nükleokapsid proteini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parça</td>
			<td>Hacim</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>PRRSV RNA</td>
			<td>2 μL (25 ng)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td>
			<td>11 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x Reaksiyon Karışımı</td>
			<td>4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Yüce Enzim Karışımı</td>
			<td>3 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sıcaklık</td>
			<td>Süre</td>
			<td>Döngü</td>
		</tr><tr><td>25 °C</td>
			<td>10 dk</td>
			<td>Genomik DNA'yı çıkarın, rastgele primerler RNA şablonlarıyla eşleşir</td>
		</tr><tr><td>55 °C</td>
			<td>15 dk</td>
			<td>dsDNaz'ın hızlı inaktivasyonu ve ters transkripsiyon</td>
		</tr><tr><td>85 °C</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>Ters transkriptaz inaktivasyonu</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Ters transkripsiyon kurulumu ve koşulları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parça</td>
			<td>Hacim</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x SuperFi II Tampon</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM İleri Astar</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM Ters Astar</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 mM dNTP'ler</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>cDNA (PRRSV)</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Platin SuperFi II DNA Polimeraz</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>32 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Döngü adımı</td>
			<td>Sıcaklık</td>
			<td>Süre</td>
			<td>Döngü</td>
		</tr><tr><td>İlk denatürasyon</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 Saniye</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>denatürasyon</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 saniye</td>
			<td>35</td>
		</tr><tr><td>Tavlama</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>10 saniye</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Uzantı</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>3 dk</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Son uzatma</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Tutmak</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: PCR reaksiyon kurulumu ve koşulları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>pVAX1 doğrusallaştırma</td>
			<td>pVAX1-F1 doğrusallaştırma</td>
			<td>pVAX1-F2 doğrusallaştırma</td>
			<td>pVAX1-F3 doğrusallaştırma</td>
			<td>pVAX1-F4 doğrusallaştırma</td>
			<td>pVAX1-F5 doğrusallaştırma</td>
		</tr><tr><td>Parça</td>
			<td>Hacim</td>
			<td>Hacim</td>
			<td>Hacim</td>
			<td>Hacim</td>
			<td>Hacim</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vektör</td>
			<td>10 μL (1 μg) pVAX1</td>
			<td>6 μL (1 μg) pVAX1-F1</td>
			<td>3,5 μL (1 μg) pVAX1-F2</td>
			<td>7,5 μL (1 μg) pVAX1-F3</td>
			<td>10 μL (1 μg) pVAX1-F4</td>
			<td>15 μL (1 μg) pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>Restriksiyon enzimi 1</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL EkoRV</td>
			<td>1 μL Ben Değilim</td>
		</tr><tr><td>Restriksiyon enzimi 2</td>
			<td>1 μL HindIII</td>
			<td>1 μL HindIII</td>
			<td>0,5 μL CIAP</td>
			<td>0,5 μL CIAP</td>
			<td>1 μL Ben Değilim</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>10x FastDigest arabelleği</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>13 μL</td>
			<td>9 μL</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Toplam</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 ve pVAX1-F5'in doğrusallaştırma karışımı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parça</td>
			<td>Hacim</td>
		</tr><tr><td>ExonArt Dikişsiz Klonlama ve Montaj kiti</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Doğrusallaştırılmış Vektör</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>Parça</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>10 μL'ye kadar</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 4: ExonArt kesintisiz klonlama ve montaj reaksiyonu kurulumu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parça</td>
			<td>Hacim</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>2x Evrensel Yeşil PCR Master Karışımı</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM İleri Astar</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM Ters Astar</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Şablon</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>8,2 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Toplam</td>
			<td>20 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sıcaklık</td>
			<td>Süre</td>
			<td>Döngü</td>
		</tr><tr><td>95 °C</td>
			<td>30 Saniye</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>10 saniye</td>
			<td>28</td>
		</tr><tr><td>56 °C</td>
			<td>10 saniye</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>3 dk</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 5: Koloni PCR kurulumu ve koşulları.
Ek Şekil S1: Astar tasarım sürecinin şeması. P5 ve P6 gibi diğer astar tasarımları da gösterilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS1.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S2: Primer dizileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS2.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: DNA dizileme verileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/Supplemental_File_2.rar" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, eklerin 3' ucunda uygun kısıtlama bölgelerini tanıtarak pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektörü doğrusallaştırabilir ve DNA parçalarını vektöre tek tek birleştirebiliriz.

Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüs Ekspresyon Vektör Yapısı için Kesintisiz Bir Klonlama Yaklaşımı

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

Bu protokol, uzun ve karmaşık bir gen ekspresyon vektörünün yapısını göstermektedir. cDNA'dan tek bir PCR ile tam uzunlukta bir DNA fragmanı elde edilemediğinde veya tam uzunlukta gen ekspresyon vektörü, in vitro olarak çoklu ekleme homolog rekombinasyon ile elde edilemediğinde, bu yöntem uygulanabilir. Şu anda, uygun bir vektöre klonlama için tam uzunlukta DNA fragmanı elde etmek için çoklu ekleme ligasyon klonlaması kullanılmaktadır.Bu yöntem, hedef genlerin silinmesini veya mutasyona uğratılmasını sağlayabilir ve çok sayıda DNA parçasını ekspresyon vektörüne verimli bir şekilde birleştirebilir.

a-seamless-cloning-approach-for-porcine-reproductive-respiratory

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100'den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Gen hedefleme metodolojileri, nakavt, knock-in ve etiketli alellere sahip transgenik fareler oluşturmak için kullanılabilir.  Burada, E. coli'de, özel gen hedefleme vektörlerini hızlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek 'alt klonlama artı ekleme' olarak adlandırdığımız gelişmiş bir yeniden birleştirme yöntemini açıklıyoruz.

Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus yaygın bir vektör platform olarak kuş hastalıkların bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için kullanılır. Bu makalede bir entegre NHEJ-CRISPR/Cas9 ve Cre-Lox sistemi kullanılarak rekombinant galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik aşı üretimi için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar.

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Bu konak aralığı seçimi ve rekombinant virüslerin görsel kimlik kullanarak "scarless" rekombinant vaccinia virüsler oluşturmak için bir yöntemdir.

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.

Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Öğrenin, homolog rekombinasyon ve çoklu DNA parça birleştirme yöntemiyle PRRSV gen ekspresyon vektörü oluşturmayı. Bu yaklaşım, moleküler biyoloji ve viral genetik çalışmalarında karmaşık klonlama süreçlerini kolaylaştırır.

Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüs Ekspresyon Vektör Yapısı için Kesintisiz Bir Klonlama Yaklaşımı

Daha fazla video keşfet