Name: Küçük RNAları Ölçmek için AQRNA-seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Öğrenin, AQRNA-seq ile Mycobacterium bovis BCG'de açlık kaynaklı dormansı sırasında tRNA havuzundaki değişiklikleri nicel olarak nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, geleneksel RNA-Seq tekniklerinin sınırlamalarını aşarak küçük RNA'ların mutlak nicelendirilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmanın yazarları, AQRNA-seq teknolojisinianlatan orijinal makalenin yazarlarına minnettardır 7. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) ve Singapur-MIT Araştırma ve Teknoloji Antimikrobiyal Direnç IRG İttifakı aracılığıyla Singapur Ulusal Araştırma Vakfı'ndan alınan hibelerle desteklenmiştir.

AQRNA-seq Kullanarak tRNA Dinamiklerini Analiz Etme

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D., yayınlanan çalışmayla ilgili iki patentin (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) mucididir.

AQRNA-seq kütüphanesi hazırlama iş akışı, bir numune içindeki RNA'ların yakalanmasını en üst düzeye çıkarmak ve ters transkripsiyon 7 sırasında polimeraz düşüşünü en aza indirmek içintasarlanmıştır. İki aşamalı bir bağlayıcı ligasyonu yoluyla, yeni DNA oligoları (Bağlayıcı 1 ve Bağlayıcı 2), numune içindeki RNA'yı tam olarak tamamlamak için fazla miktarda bağlanır. Fazla bağlayıcılar, tek sarmallı DNA'lara özgü 5' ila 3' eksonükleaz olan RecJf ile verimli bir şekilde çıkarılabilir ve bağlanmış ürü...

Büyük paralel dizileme olarak da bilinen yeni nesil dizileme (NGS), DNA parçalanmasını, adaptör oligonükleotidlerin bağlanmasını, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı amplifikasyonu, DNA'nın dizilenmesini ve parça dizilerinin bir genomda yeniden birleştirilmesini içeren bir DNA dizileme teknolojisidir. NGS'nin RNA dizisine (RNA-dizilimi) adaptasyonu, RNA transkriptlerini ve varyantlarını tanımlamak ve ölçmek için güçlü bir yaklaşımdır1. RNA kütüphanesi hazırlama iş akışlarındaki ve biyoinformatik analiz boru hatlarındaki yenilikçi gelişmeler, laboratuvar cihazlarındaki ilerlemelerle birleştiğinde, RNA-seq uygulamalarının repertuarını genişletti ve ekzom dizilemenin ötesine geçerek, kodlamayan RNA profillemesi2, tek hücre analizi3, uzamsal transkriptomik 4,5, alternatif birleştirme analizi6 gibi gelişmiş fonksiyonel omiklere ilerledi, diğerleri arasında. Bu gelişmiş RNA-seq yöntemleri, normal ve hastalıklı hücre ve dokudaki transkriptomun kantitatif analizi yoluyla karmaşık RNA fonksiyonlarını ortaya çıkarır.
RNA dizilimindeki bu ilerlemelere rağmen, birkaç temel teknik özellik yöntemin nicel gücünü sınırlamaktadır. Çoğu RNA-seq yöntemi, deneysel değişkenler (yani biyolojik numuneler ve/veya fizyolojik durumlar) arasındaki RNA seviyelerindeki değişikliklerin kesin ve doğru bir şekilde ölçülmesine izin verirken, bir numune içindeki RNA moleküllerinin seviyelerinin nicel karşılaştırmalarını sağlayamazlar. Örneğin, çoğu RNA-seq yöntemi, eksprese edilen tRNA'ların hücresel bir havuzundaki tek tek tRNA izoseptör moleküllerinin nispi kopya sayısını doğru bir şekilde ölçemez. Eşlik eden yayın7'de vurgulandığı gibi, RNA-seq ile ilgili bu sınırlama, RNA yapısının çeşitli özelliklerinden ve kütüphane hazırlığının biyokimyasından kaynaklanmaktadır. Örneğin, 3' ve 5' uçlu dizileme bağlayıcılarını RNA moleküllerine bağlamak için kullanılan ligasyon enzimlerinin aktivitesi, RNA'nın terminal nükleotidlerinin ve dizileme bağlayıcılarının kimliğinden güçlü bir şekilde etkilenir. Bu, bağlayıcı ligasyonlarının verimliliğinde büyük farklılıklara ve sıralama okumalarında derin artefaktal artışlara yol açar 8,9,10.
İkinci bir sınırlama seti, RNA moleküllerinin doğal yapısal özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Spesifik olarak, RNA ikincil yapı oluşumu ve epitranskriptomun düzinelerce transkripsiyon sonrası RNA modifikasyonundaki dinamik değişiklikler, ters transkripsiyon sırasında polimeraz düşmesine veya mutasyonuna neden olabilir. Bu hatalar, eksik veya kesilmiş cDNA sentezi veya değişmiş RNA dizisi ile sonuçlanır. Bu fenomenlerin her ikisi de ikincil yapıları veya bazı modifikasyonları haritalamak için kullanılabilse de, sonraki kütüphane hazırlama adımları kesilmiş cDNA'ları yakalayamazsa veya veri işleme, bir referans veri kümesiyle eşleşmeyen mutasyona uğramış dizileri atarsa, RNA-seq'in nicel doğruluğunu düşürür11,12. Ayrıca, RNA transkriptlerinin muazzam kimyasal, uzunluk ve yapısal çeşitliliğinin yanı sıra uzun RNA'ları düzgün bir şekilde parçalamak için araçların olmaması, çoğu RNA-seq yönteminin tüm RNA türlerineuygulanabilirliğini azaltır 13.
AQRNA-seq (mutlak miktar tayini RNA dizileme) yöntemi, kantitatif doğruluğu sınırlayan bu teknik ve biyolojik kısıtlamaların birçoğunu ortadan kaldırmak için geliştirilmiştir7. RNA dizileme kütüphanesi hazırlığı sırasında yakalama, ligasyon ve amplifikasyonda diziye bağlı önyargıları en aza indiren AQRNA-seq, diğer yöntemlere kıyasla üstün doğrusallık elde eder ve 963 miRNA'dan oluşan bir referans kütüphanesinin %75'ini 2 kat doğrulukla doğru bir şekilde ölçer. Dizileme okuma sayısı ve RNA bolluğunun bu doğrusal korelasyonu, RNA oligonükleotid standartlarının değişken uzunluklu bir havuzunun analizinde ve kuzey blotlama gibi ortogonal yöntemlere atıfta bulunulduğunda da gözlenir. Dizileme okuma sayısı ve RNA bolluğu arasında doğrusallık oluşturmak, AQRNA-seq'in bir numune içindeki tüm RNA türlerinin doğru ve mutlak miktar tayinini elde etmesini sağlar.
Burada, AQRNA-seq kitaplığı hazırlama iş akışı ve beraberindeki aşağı akış veri analizi işlem hattı için protokolün bir açıklaması yer almaktadır. Yöntem, Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) tüberküloz modelinde açlığa bağlı uyku hali ve ardından resüsitasyon sırasında tRNA bolluğunun dinamiklerini aydınlatmak için uygulandı. Dizileme verilerinin keşifsel görselleştirilmesi için sonuçlar, çeşitli fenotiplerle ilişkili tRNA bolluğundaki fark edilebilir kalıpları ortaya çıkaran müteakip kümeleme ve diferansiyel ifade analizleriyle birlikte sunuldu.

<table><tbody><tr><td>2-ketoglutarat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>Çalışan bir çözelti (1 M) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör Cihazı</td><td>Agilent</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-Trifosfat (ATP)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (bileşen #: N0437AVIAL)</td><td>NEB M0437M, T4 RNA Ligaz 1 (30 U/&mu; L), T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X), PEG 8000 (1X) ve ATP (100 mM); çalışan bir çözelti (10 mM) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>AGAROSE GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>Ortam sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Amonyum demir(II) sülfat hekzahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td><td>Çalışan bir çözelti (0.25 M) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Biyoanalizör Küçük RNA Analizi</td><td>Agilent</td><td>5067-1548&nbsp;</td><td>Küçük RNA Analizi, girdi RNA'larının kalitesini ve enzimatik reaksiyonların verimliliğini kontrol etmek için kullanılır (örneğin, Bağlayıcı 1 ligasyonu)</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA; 10 mg / mL)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>Bu ürün 12/15/2022 tarihinde kullanımdan kaldırılmış ve Rekombinant Albümin, Moleküler Biyoloji Sınıfı (NEB B9200) ile değiştirilmiştir.</td></tr><tr><td>Kloroform&nbsp;</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>Demetilaz&nbsp;</td><td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>Demetilaz, rtStar tRNA Ön Arıtma ve Birinci İplikli cDNA Sentez Kiti (AS-FS-004</td></tr><tr><td>)Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti Karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L (bileşen #: N0447LVIAL)</td><td>Bu dNTP Çözelti Karışımı, dATP, dCTP, dGTP ve dTTP'nin eşmolar konsantrasyonlarını içerir (her biri 10 mM)</td></tr><tr><td>Dijital Çift Isı Bloğu</td><td>VWR Bilimsel Ürünler</td><td>13259-052</td><td>Isıtma bloğu QIAquick&nbsp ile birlikte kullanılır; Jel Ekstraksiyon Kiti&nbsp;</td></tr><tr><td>Boya Ex&nbsp; 2.0 Döndürme Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>63204&nbsp;</td><td>Kısa kalıntıların uzaklaştırılmasında etkilidir (örneğin, uzunluğu 10 bp'den az olan oligolar)</td></tr><tr><td>Elektroforez Güç</td><td>Kaynağı Bio-Rad Labrotories</td><td>PowerPac 300</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR Tüpleri (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>0030124537</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>Etil alkol (Etanol), Saf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td>Saf etanol, Zymo Research'ün Oligo Temizleme ve Yoğunlaştırıcı Kiti ile birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>Jel Görüntüleme Sistemi</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>Jel Yükleme Boyası, Mor (6X), SDS yok</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (bileşen #: B7025SVIAL)</td> <td>NEB N0556S, Hızlı Yükleme Mor 50 bp DNA Merdiveni ve Jel Yükleme Boyası içerir, Mor (6X), SDS</td></tr><tr><td>yok GENESYS 180 UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840-309000</td><td>Spektrofotometre, Bira yasasını kullanarak oligo konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Çalışma çözeltisi hazırlayın (1 M; NaOH ile pH = 8) ve -20 °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)&nbsp;</td><td>VWR Bilimsel Ürünler</td><td>BDH3028&nbsp;</td><td>Çalışan bir solüsyon (5 M) hazırlayın ve ortam sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>İzopropil Alkol (İzopropanol), Saf</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>3032-16</td><td>İzopropanol, QIAquick&nbsp ile birlikte kullanılır; Jel Ekstraksiyon Kiti&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Bir çalışma çözeltisi (0,5 M) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (bileşen #: B7002SVIAL)</td><td>NEB M0264L, RecJf (30 U/&mu; L) ve NEBuffer 2 (10X); -20 & °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile Arıtılmamış)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Temiz & Konsantratör Kiti&nbsp;</td><td>Zymo Araştırma</td><td>D4061&nbsp;</td><td>Ortam sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>PEG 8000 (%50 çözelti)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (bileşen #: B1004SVIAL)</td><td>NEB M0437M, T4 RNA Ligaz 1 (30 U/&mu; L), T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X), PEG 8000 (1X) ve ATP (100 mM); çalışan bir çözelti (10 mM) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Peltier Termal Döngüleyici</td><td>MJ Araştırma</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: choloroform: izoamil ve nbsp; alkol 25:24:1 pH = 5.2&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>J62336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Tamponu (5X)</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Ters Transkriptaz</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAhızlı&nbsp; Jel Ekstraksiyon Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td> Bu kit, Hızlı Yükleme Mor 100 bp DNA Merdiveni New England Biolabs N0551S (bileşen #: N0551SVIAL) Hızlı Yükleme Mor 50 bp DNA Merdiveni ile <td>çalışmak için bir ısıtma bloğu ve izopropanol gerektirir</td></tr> <tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (bileşen #: N0556SVIAL)</td> <td>NEB N0556S, Hızlı Yükleme Mor 50 bp DNA Merdiveni ve Jel Yükleme Boyası, Mor (6X) içerir, SDS içermez</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RecJf&nbsp; (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (bileşen #: M0264LVIAL)</td><td>NEB M0264L, RecJf (30 U/&mu; L) ve NEBuffer 2 (10X); -20 & °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü (murin; 40 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314L&nbsp;( bileşen #: M0314LVIAL)</td> <td>-20 derecede saklayın > C</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; DNA Polimeraz&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 SeqAMP&nbsp; içerir; DNA Polimeraz&nbsp; ve SeqAMP&nbsp; PCR Tamponu (2X)</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; PCR Tamponu (2X)&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 SeqAMP&nbsp; içerir; DNA Polimeraz&nbsp; ve SeqAMP&nbsp; PCR Tamponu (2X)</td></tr><tr><td>Karides Alkalin Fosfataz (1 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371L&nbsp;( bileşen #: M0371LVIAL)</td><td></td></tr> <tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td> <td>ve nbsp; S5881</td><td>Çalışan bir çözelti (5 M) hazırlayın ve ortam sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz (400 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( bileşen #: M0202LVIAL)</td> <td>NEB M0202L, T4 DNA Ligaz (400 U/&mu; L) ve T4 DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X)</td></tr> <tr><td>T4 DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X) &nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( bileşen #: B0202SVIAL)</td> <td>NEB M0202L, T4 DNA Ligaz (400 U/&mu; L) ve T4 DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X)</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaz 1 (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (bileşen #: M0437MVIAL)</td><td>NEB M0437M, T4 RNA Ligaz 1 (30 U/&mu; L), T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X), PEG 8000 (1X) ve ATP (100 mM)</td></tr> <tr><td>T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X) &nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (bileşen #: B0216SVIAL)</td><td>NEB M0437M, T4 RNA Ligaz 1 (30 U/&mu; L), T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X), PEG 8000 (1X) ve ATP (100 mM)</td></tr></tbody></table>

küçük rna'ları Ölçmek için aqrna-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq, biyolojik bir numunedeki sıralama okuma sayıları ile küçük RNA kopya sayıları arasında doğrudan doğrusal bir ilişki sağlar, böylece küçük RNA havuzunun doğru bir şekilde nicelleştirilmesini sağlar. Burada açıklanan AQRNA-seq kütüphanesi hazırlama prosedürü, özel olarak tasarlanmış dizileme bağlayıcılarının kullanımını ve ters transkripsiyon sürecini bloke eden metilasyon RNA modifikasyonlarını azaltmak için bir adımı içerir, bu da tam uzunlukta cDNA veriminin artmasıyla sonuçlanır. Ek olarak, eşlik eden biyoinformatik boru hattının ayrıntılı bir uygulaması sunulmaktadır. AQRNA-seq'in bu gösterimi, 20 günlük bir besin yoksunluğu ve 6 günlük resüsitasyon süreci boyunca seçilen 5 günde hasat edilen Mycobacterium bovis BCG'deki 45 tRNA'nın kantitatif bir analizi yoluyla gerçekleştirildi. AQRNA-seq'in verimliliğini ve titizliğini artırmaya yönelik devam eden çabalar da burada tartışılacaktır. Bu, PCR amplifikasyonundan sonra primer dimer sorunlarını azaltmak için jel saflaştırmasını ortadan kaldırmaya ve daha doğru okuma eşlemesi sağlamak için tam uzunlukta okumaların oranını artırmaya yönelik yöntemlerin araştırılmasını içerir. AQRNA-seq'te gelecekteki iyileştirmeler, çeşitli organizmalardan alınan hücre ve doku örneklerindeki tüm küçük RNA türlerinin miktarını belirlemek için bu teknolojinin otomasyonunu ve yüksek verimli uygulamasını kolaylaştırmaya odaklanacaktır.

Mikobakteri bovis Üstel büyüme geçiren BCG (bacilli de Calmette et Guérin) suşu 1173P2, bir zaman serisine (0, 4, 10 ve 20 gün) besin açlığına tabi tutuldu, ardından daha önce Hu ve ark.7'de sunulduğu gibi besin açısından zengin ortamda 6 günlük bir resüsitasyon izledi. Küçük RNA'lar, belirlenen beş zaman noktasının her birinde üç biyolojik kopya ile bakteri kültüründen izole edildi. Illumina kütüphaneleri, yukarıda açıklanan AQRNA-seq kütüphane hazırlama iş akışı (Şe...

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

AQRNA dizilimi, hemen hemen her hücre veya doku örneğindeki mikroRNA'lar, tRNA'lar ve tRNA fragmanları gibi küçük RNA'ları kantitatif olarak haritalandırır. Bilinen 170 tRNA modifikasyonundan bazılarını haritalamak için kullanılabilir, ancak haritalama için daha spesifik olan başka yöntemler de vardır. RNome'daki hastalık biyobelirteçlerini keşfetmek ve sistem düzeyinde protein translasyon mekanizmalarını keşfetmek için AQRNA-seq'i kullanabilirsiniz.Çoğu RNA-seq yöntemi, bir numunedeki tek tek RNA moleküllerinin bolluğunu doğru bir şekilde ölçemez. Bu, hem RNA'nın ikincil yapılar, transkripsiyon sonrası modifikasyonlar gibi yapısal özelliklerinden hem de RNA'lar üzerindeki terminal nükleotidler tarafından indüklenen bin katlı ligasyon önyargıları gibi kütüphane hazırlığının biyokimyasından kaynaklanır. AQRNA-seq, numunedeki RNA bolluğunun doğru bir şekilde ölçülmesini sınırlayan çeşitli teknik ve biyolojik zorlukların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir.Diğer konularla karşılaştırıldığında, RNA moleküllerinin sayımları ve kopya sayıları arasında doğrusallık sağlar, doğru bir şekilde, bir referans kütüphanesinin %75'ini ölçer ve 963 mikroRNA'yı iki kat doğrulukla sıkıştırır. AQR

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

MicroRNA'lar (miRNA'lar), yaygın olarak korunan bir düzenleyici molekül sınıfıdır. Burada, iki güçlü ligasyon adımına ve ardından yüksek verimli dizilemeye dayanan bir miRNA klonlama yöntemini açıklıyoruz. Yöntemimiz, miRNA'ların genom çapında doğru bir şekilde kantitasyonuna izin verir.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Gerçek zamanlı PCR aracılığıyla kıyı çökeltilerinden bakteriyel 16S rRNA genlerini ve transkriptlerini ölçmek için bir protokol sağlanır. Metodoloji, DNA ve RNA'nın birlikte ekstraksiyonunu içerir; DNA'sız RNA'nın hazırlanması; ve standart eğri yapısı dahil olmak üzere RT-q-PCR yoluyla 16S rRNA geni ve transkript miktar tayini.

Gerçek zamanlı PCR ile Kıyı tortulları ve Niceleme 16S rRNA Genler ve Transkriptler eşzamanlı DNA-RNA Ekstraksiyon

Gen ekspresyonu, mutasyonlar ve gen füzyonları için seçilen transkriptleri sorgulamak için indekslenmiş cDNA kütüphanelerinin hazırlanmasını, özel problarla hibridizasyon ve yakalama ve veri analizini içeren hedefli RNA dizileme tabanlı bir yöntemi tanımlıyoruz. Hedeflenen RNAseq, seçilen transkriptlerin bir masaüstü sıralayıcıda uygun maliyetli, hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

Bu iletişim kuralı için siteleri işleme eşleme pre-mRNA 3' ucu bir yöntemi açıklar.

A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

Burada, küçük RNA'ları yalıtmak, mikroRNA'lar için zenginleştirmek ve yüksek iş elde etme sıralaması için numune hazırlamak için adım adım bir strateji tanımlıyoruz. Daha sonra açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumaları nasıl işleyip mikroRNA'lara hizalayan açıklarız.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2'-O-metil RNA'lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

Burada sunulan bitki dokularının lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) için bir protokoldür. LCM, doku alanlarını kontaminasyonsuz bir şekilde izole etmek için mikroskobik bir tekniktir. Prosedür doku fiksasyonu, parafin katıştırma, kesit, LCM ve RNA ekstraksiyon içerir. RNA, transkripsiyonların alt dokuya özgü, zamansal olarak çözümlenmiş analizinde kullanılır.

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster'in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir.

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Öğrenin, AQRNA-seq ile Mycobacterium bovis BCG'de açlık kaynaklı dormansı sırasında tRNA havuzundaki değişiklikleri nicel olarak nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, geleneksel RNA-Seq tekniklerinin sınırlamalarını aşarak küçük RNA'ların mutlak nicelendirilmesini sağlar.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Daha fazla video keşfet