Kronik Akciğer Allogreft Rejeksiyonunun Murin Modellerinde Kollajen Birikiminin Yarı Kantitatif Histopatolojik Değerlendirmesi için Picrosirius Kırmızı Boyama

Araştırmamız, kronik akciğer allogreft rejeksiyonunda fibroz gelişimini analiz etmeye odaklanmaktadır. Bu nedenle fibrotik doku kompartmanını karakterize eden yöntemlerle ilgileniyoruz. Nakille ilgili hastalıkları yeniden üretmek için, birkaç yıl önce tanıttığımız tek akciğer naklinin fare modelini kullanıyoruz.

Bu modelde, allojenik fare suşları arasında bir akciğerin transplantasyonunun farklı seviyelerde greft fibrozu ile sonuçlandığı gösterilmiştir. Fibrotik doku yeniden şekillenmesi ile ilgili histoloji verileri genellikle kalitatif olarak sunulur. Picrosirius Red boyamayı kullanan yöntemimiz, yarı kantitatif bir değerlendirme avantajı sunar ve kalın ve ince kollajen lifleri arasında ayrım yapar.

Başlamak için, parafine gömülü fare akciğer örneklerini her biri iki dakika boyunca azalan etanol konsantrasyonlarında nemlendirin. Slaytı Meyer'in hemalum solüsyonunda sekiz dakika boyunca boyayın. Slaytı akan musluk suyu altında 10 dakika yıkayın, ardından slaytı Picrosirius Red solüsyonunda bir saat inkübe edin.

Slaytı beş ila 10 kez% 0.5 asetik asit çözeltisine batırın. Solüsyonu çıkarmak için slaytı hafifçe sallayın. Şimdi slaytı artan etanol konsantrasyonlarında ve% 100 Xylol'de her biri beş dakika boyunca kurutun.

Gömmek için numunenin üzerine bir damla montaj ortamı ekleyin ve bir kapak fişi ile örtün. Slaytların çeker ocak altında kurumasına izin verin. Işık mikroskobu altında, net ve keskin bir görüntü elde edilene kadar numuneyi odaklamak için uygun görüntüleme yazılımı kullanın.

Arka plan tamamen koyu veya siyah olana kadar polarizasyon filtresinin derecesini ayarlayın. Örneği 20x büyütme altında tarayın ve görüntüleri TIFF formatında dışa aktarın. Görüntüleri Fiji yazılımına aktarın.

Düzenle'ye tıklayın ve Dışını Temizle'yi seçin. Ardından toplam yüzey alanını ölçmek için Analiz Et'i ve ardından Ölç'ü tıklayın. Örnek başına toplam kolajen içeriğini ölçmek için Görüntü'ye ve ardından Ayarla ve Renk Eşiği'ne tıklayın.

Renk tonunu 2 ile 130 arasında ve parlaklığı 35 ile 255 arasında ayarlayın. Ardından Analiz Et'e tıklayın ve Parçacıkları Analiz Et penceresinde boyutu 1 eksi sonsuz olarak ayarlayın ve Temizle ve Özetle kutularını işaretleyin. Kalın kollajen liflerinin analizi için tonu kırmızıya ve ince kollajen lifleri için sarı yeşile ayarlayın ve toplam kollajen sayısını ölçün.

Son olarak, tıklayın Eklentiler, Makrolar, ve Rekor makroyu otomatik işleme için yapılandırmak için. Masson'un trikrom, Herovici'nin ve Picrosirius Red boyamaları, majör histouyumluluk kompleksi uyumsuz modelinde geniş parabronşiyal ve paravasküler kollajen birikimini gösterdi. Küçük uyumsuz model öncelikle daha az yoğun kollajen birikimi ile yoğun lenfositik infiltratlar gösterdi.

Polarizasyon filtresi ile yapılan Picrosirius Red boyama, her iki modelde de biriken liflerin yeşil bir görünümünü ortaya çıkardı. İzogreft kontrolleri, naif murin akciğerlerine benzer şekilde parabronşiyal ve paravasküler sınırlarla sınırlı kollajen gösterdi. Dijital görüntü analizi, majör histouyumluluk kompleksi uyumsuz akciğer greftlerinde, minör uyumsuz greftlere, sağ taraflı naif akciğer dokusuna veya naif BALB/c sol akciğerlere kıyasla toplam kollajenin arttığını ortaya koydu.

Kalın kollajen liflerinde herhangi bir fark gösterilmedi. İnce kollajen liflerinin analizi, minör uyumsuz modele, naif sağ taraflı akciğer dokusuna veya naif BALB/c sol akciğerlere kıyasla majör uyumsuz modelde daha fazla varlık gösterdi.