Name: Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Keşfedin Shigella ile epitel hücre enfeksiyonu analizlerini in vitro hücre hatları kullanarak. Bu yöntem, patojenin yapışma, istila ve hücre içi çoğalma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlara verilen destek arasında Massachusetts General Hospital Pediatri Bölümü, Araştırma Geçici Destek Fonu İcra Komitesi (ISF) ödülü 2022A009041, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü hibe R21AI146405 ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü Harvard'daki Beslenme Obezite Araştırma Merkezi (NORCH) 2P30DK040561-26. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

1. Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması
NOT: Tüm hacimler, iki adet 6 oyuklu plaka kullanan bir tahlil ile tutarlıdır.
<ol><li>TSB ortamı: 15 g Triptik Soya Suyu (TSB, Malzeme Tablosuna bakınız) ortamına ve otoklava 0,5 L deiyonize (DI) su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Safra tuzları ortamı (TSB + BS): % 0.4 (a / h) safra tuzları içeren TSB'yi hazırlamak için, 15 mL otoklavlanmış TSB içinde 0.06 g safra tuzunu (BS, Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden süspanse edin. Filtre, 0,22 μm PES filtresi kullanarak sterilize edilir. NOT: Safra tuzları, 1:1 sodyum kolat ve sodyum deoksikolat karışımından oluşur. Kullanmadan hemen önce yeni ortam hazırlayın.</li>
	<li>DMEM +% 10 (h / h) FBS: 45 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'una (DMEM) 5 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>DMEM + gentamisin: 50 mL'lik bir tüpe 50 mL DMEM ve 50 μL 50 mg/mL gentamisin ekleyin (bkz. NOT: Her deneyden önce taze alikot yapın ve 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.</li>
	<li>PBS +% 1 (h / h) Triton X-100: 150 μL Triton X-100 ila 15 mL Fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. NOT: Her deneyden önce taze alikot yapın ve 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.</li>
	<li>TSB + Kongo kırmızı gösterge plakaları: 1 L'lik bir şişeye 15 g TSB, 7,5 g seçkin agar ve 0,125 g Kongo kırmızı boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 0,5 L DI su ve otoklav ekleyin. Ayrı steril Petri kaplarına (100 mm x 15 mm) 10-20 mL ortam dökün ve katılaşmasına izin verin. DİKKAT: Kongo kırmızısı kanserojendir ve üreme toksinidir. Kongo kırmızısının işlenmesinin uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak yapıldığından emin olun. Daha fazla bilgi için ürün güvenlik bilgi formuna bakın. NOT: 0,5 L Kongo kırmızı malzemesinden yaklaşık 20 plaka yapılmıştır. Plakalar 2-3 gün önceden hazırlanabilir ve kullanıma kadar oda sıcaklığında ters çevrilmiş halde bırakılabilir. Uzun süreli saklama için, ters çevrilmiş plakaları 3 aya kadar 4 °C'de plastik kılıflara yerleştirin.</li>
	<li>DMEM +% 10 (h / h) FBS ve% 5 (h / h) dimetil sülfoksit (DMSO): 50 mL'lik bir tüpe 42.5 mL DMEM, 5 mL FBS ve 2.5 mL DMSO ekleyin. 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Bakterilerin hazırlanması
NOT: Tüm Shigella laboratuvar yetiştirme ve depolama protokolleri Payne, S. M.43'ten uyarlanmıştır.
DİKKAT: Shigella spp. Risk Grubu 2 patojenleridir44. Tüm laboratuvar çalışmalarını, Shigella spp.'nin düşük bulaşıcı dozu nedeniyle kazara maruziyetleri sınırlamak için alınan ek güvenlik önlemleri ile bir BSL-2 ortamında gerçekleştirin.
<ol><li>Shigella'nın donmuş stoklardan büyümesi<ol><li>Steril bir aplikatör kullanarak kriyojenik flakondan az miktarda donmuş kültürü bir TSB + Kongo kırmızı agar plakasına aktarın.</li>
		<li>Bir aşılama döngüsünü alevle sterilize edin ve soğumaya bırakın. İnokulumu plakanın bir çeyreği boyunca ileri geri hareket ettirin. Halkayı alevlendirin, soğumaya bırakın, ardından ilk kadrandan plakanın ikinci çeyreğine doğru çizin. Aşılamayı plakanın üçüncü ve dördüncü kadranlarına sürmek için tekrarlayın. NOT: Alternatif olarak, her kadran arasında yeni bir steril aplikatör kullanarak aşılamayı çizgileyin.</li>
		<li>Plakayı ters çevirin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. NOT: Kongo kırmızı-pozitif (CR+) fenotipi45'in gözlemlenmesi için gerekli olan Shigella virülans faktörlerinin ekspresyonu için ≥37 °C sıcaklıklarda inkübasyon gereklidir. Avirulent koloniler beyaz bir görünüme sahip olacak ve istilacı olmayacaktır.</li>
		<li>Plakayı parafin filmle kapatın ve 4 °C'de buzdolabında saklayın. NOT: Bakteri kolonileri agar plakalarında 1-2 hafta canlı kalacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Shigella'nın sıvı kültürde bir gecede büyümesi<ol><li>3 mL TSB ortamını steril 14 mL kültür tüplerine alın.</li>
		<li>Steril bir aplikatör kullanarak tek, iyi izole edilmiş kırmızı (CR +) bir koloni seçin ve sıvı ortamda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Kültürleri gece boyunca (16-18 saat) 37 ° C'de dakikada 250 devirde (rpm) çalkalayarak inkübe edin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. HT-29 ökaryotik hücrelerin hazırlanması
NOT: Tüm hacimler, iki adet 6 oyuklu plaka kullanan bir tahlil ile tutarlıdır. HT-29 hücre hatları, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC) elde edildi. HT-29 bakım protokolleri, ATCC tavsiyelerinden46 uyarlanmıştır. Tüm ortamlar kullanımdan önce 37 °C'de bir su banyosunda önceden ısıtılmalıdır. Tüm HT-29 bakım protokolleri bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. pH'ta dramatik değişikliklerden kaçınmak için ortamdaki HT-29 hücrelerini karıştırırken/çalışırken kabarcık üretmekten kaçının.
<ol><li>HT-29 hücrelerinin donmuş stoktan çözülmesi<ol><li>HT-29 hücrelerinin şişesini 37 ° C'lik bir su banyosunda çözdürün. NOT: Kirlenmeyi önlemek için kapağın tamamen suyun üzerinde kaldığından emin olun. Çözdürme işlemi 2 dakikadan az sürmelidir.</li>
		<li>Kültür tamamen çözüldükten hemen sonra şişeyi sudan çıkarın ve% 70 etanol ile dekontamine edin. Bu noktadan itibaren tüm adımların aseptik teknikler kullanılarak gerçekleştirildiğinden emin olun.</li>
		<li>Şişenin tüm içeriğini 9 mL DMEM +% 10 FBS içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 125 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı bir atık kabına boşaltın ve peleti 10 mL sıcak DMEM +% 10 FBS içinde yeniden süspanse edin. Süspanse hücreleri, 10 mL sıcak DMEM +% 10 FBS (toplam hacim 20 mL) içeren 75cm2'lik bir doku kültürü şişesine (T75) aktarın.</li>
		<li>Hücreleri% 90 birleşmeye ulaşana kadar (yaklaşık 6-7 gün) hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Birleşme görsel yaklaşımla tahmin edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>HT-29 hücrelerinin tohumlanması<ol><li>37 °C su banyosunda 20 mL PBS ve 50 mL DMEM +% 10 FBS'yi önceden ısıtın ve 3 mL% 0.25 (a / h) Tripsin-EDTA'yı oda sıcaklığına önceden ısıtın.</li>
		<li><li></li><li><li><li></li><li><li><li> </li><li><ol><li><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66426/66426eq01v3.jpg" style="margin: auto;"></li><li></li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66426/66426eq02v3.jpg" style="margin: auto;"></li><li></li><li></li><li><li> </li></ol></li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66426/66426eq03.jpg" style="margin: auto;"></li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li> </li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li> </li><li></li><li><ol><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li></ol></li><li><li><li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li> </li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li> </li><li> </li><li></li><li><ol><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li></ol></li><li></li><li><ol><li></ol></li><li></li><li><ol><li></ol></li><li><li><li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li> </li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li> </li><li> </li><li></li><li><ol><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li></ol></li><li></li><li><ol><li></ol></li><li></li><li><ol><li></ol></li><li><li><li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li></ol>

Kolon Epitel Hücrelerinde Shigella Enfeksiyonunu Analiz Etmek için Protokoller

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Bu protokol, bağırsak epitel hücrelerinin Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu incelemek için üç standart testi açıklar. Bu yöntemler, konakçı hücreler içindeki çeşitli bakteriyel patojenlerin invazyonunu ve hücre içi replikasyonunu incelemek için kullanılan klasik gentamisin testlerinin yalnızca değiştirilmiş versiyonları olsa da 49,50,51, Shigella'yı incelerken özel hususlar uygulanmalıdır.
Shigella, havalandırma43 ile zengin ortamda 37 ° C'de optimal olarak büyüyen fakültatif anaeroblardır. Farklı çevresel sinyallerin veya metabolitlerin Shigella enfeksiyonları üzerindeki etkilerini sorgulamak için bu tahlilleri gerçekleştirirken, Shigella'nın gece boyunca zengin besiyerinde büyütülmesi, daha sonra enfeksiyondan önce orta log fazına kadar tanımlanmış veya takviye edilmiş besiyerine alt kültürün yetiştirilmesi önerilir. Maksimal virülans gen ekspresyonu, büyümenin logaritmik fazı sırasında ortaya çıkar52,53. Bu nedenle, gece boyunca Shigella kültürlerinin alt kültüre alınması ve bakteri üremesinin üstel faza (OD600 ~ 0.7) izin verilmesi, Shigella virülansını doğru bir şekilde değerlendirmek için gerekli adımlardır. Ayrıca, virülans gen ekspresyonu sıcaklığa bağlıdır. Sadece konak enfeksiyonu sırasında ekspresyon için özgüllüğü sağlamak için, virülans genleri konakçı fizyolojik sıcaklıklarında (37 °C) indüklenir ve daha düşük sıcaklıklarda (örneğin, 30 °C) sıkı bir şekilde bastırılır54. Virülans genlerinin ekspresyonunu sağlamak için, bakteriyel subkültürasyon ve enfeksiyonlar, sıcaklığın 37 °C'nin altına düşmemesini sağlamak için uygun özenle 37 °C'de gerçekleştirilmelidir. İnvazyon ve epitel hücre enfeksiyonu için gerekli moleküler mekanizmayı kodlayan büyük, 220 kilobaz virülans plazmidi, tüm Shigella spp5 için temel bir virülans belirleyicisidir. 37 °C'de tekrarlanan pasajlama ve uzun süreli büyüme, virülans plazmit kararsızlığını teşvik ederek plazmit kaybına neden olur ve Shigella hücrelerini avirulenthale getirir 55. Virülans plazmid bakımını ve önemli virülans genlerinin ekspresyonunu sağlamak için, bakterilerin her iki haftada bir doğrudan dondurucu stoklarından taze TSB + Kongo kırmızı gösterge plakalarına yeniden yerleştirilmesi önerilir. Kongo kırmızı agarı, vahşi tip virülan (kırmızı, CR+) koloniler ile virülans plazmidini45 kaybetmiş avirulent (beyaz, CR-) koloniler arasında ayrım yapmak için kullanılabilir. Virülans plazmit instabilitesi tekrar tekrar gözlenirse, virülans plazmit kaybını önlemek için gece boyunca Shigella kültürleri 30 °C'de inkübe edilebilir, ardından virülans gen ekspresyonunu teşvik etmek için 37 °C'de alt kültürleme yapılabilir43. Son olarak, bu bakteri suşlarında antibiyotik belirteçlerinin bulunduğu mutantlar ve/veya kompleman suşlarla analizler yapılırsa, bakteri geceleme ve subkültürasyon aşamalarında uygun antibiyotik seçiminin kullanılması önerilir.
HT-29 epitelyal tek tabakalarının kullanımı, in vitro Shigella patogenezinin moleküler mekanizmalarını incelemek için birçok avantaja sahiptir. Shigella insana adapte olmuş bir patojen olduğundan, küçük hayvan modelleri insanlarda gözlenen shigellozis karakteristik patogenezini doğru bir şekilde yansıtmamaktadır36. Bu nedenle, insan kaynaklı hücre hatlarının enfeksiyonu için standartlaştırılmış protokollerin kullanılması, bu patojen ile doğal konakçısı arasındaki moleküler etkileşimi karakterize etmek için bakteriyel patogenezin bireysel adımlarının kantitatif sorgulanmasını sağlar. Tarihsel olarak, HeLa hücreleri ağırlıklı olarak in vitro 25,56,57 konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, HeLa hücreleri, enterik bakteriyel patojenler için doğal olmayan konakçı hücreler olan ölümsüzleştirilmiş bir rahim ağzı kanseri hücre dizisidir. Bu nedenle, enterik patogenezin in vitro çalışmaları, bağırsak epitel morfolojisini daha sadık bir şekilde özetleyen ve farklılaşmış apikal ve bazolateral yüzeylere sahip epitelyal tek tabakalar olarak transwelller üzerinde büyütülebilen kolon adenokarsinom hücre hatlarının (örneğin, HT-29, Caco-2 ve T84) kullanımına kaymıştır 58,59,60. Her hücre hattının kendine özgü güçlü ve zayıf yönleri olmasına rağmen, bağırsak enterositlerine fenotipik benzerlikler ve hücre yüzeyi reseptörlerinin ve proinflamatuar sitokinlerin sağlam ekspresyonu nedeniyle burada açıklanan testlerde HT-29 hücreleri kullanılır 58,59,61. Bununla birlikte, tartışılan bu modellerin her biri, in vivo58 kolon epitelinin doğal fizyolojik durumunu doğru bir şekilde temsil etmeyen anormal metabolik ve büyüme fenotiplerine sahip kanser kaynaklı hücre dizileridir. İnsan doku kültürü tekniklerindeki son gelişmeler, doku biyopsilerinden elde edilen insan bağırsak kök hücrelerinin, insan gastrointestinal (GI) kanalında bulunan çeşitli hücre tiplerini özetleyen organoidlere veya tek iki boyutlu hücre tek katmanlarına yetiştirilmesini sağlamıştır 62,63,64. Bağırsak organoidleri, enterositleri, mukus üreten goblet hücrelerini, M hücrelerini ve diğer dokuya özgü hücre tiplerini içerecek şekilde ayırt edilebilir. Son çalışmalar, çeşitli Shigella spp., Salmonella enterica ve Escherichia coli patovarları 62,63,64 dahil olmak üzere enterik patojenleri incelemek için bu organoid modellerin kullanımını doğrulamıştır. Organoidler, insan GI epitelinin daha doğru modelleri olmasına ve hatta küresel nüfusu65 temsil etmek için çeşitli besin koşullarında kültürlenebilmesine rağmen, göreceli karmaşıklıkları önemli eğitim ve teknik uzmanlık gerektirir, bu da geleneksel kanser hücre hatlarına kıyasla daha yüksek maliyetlere ve daha uzun kültürleme sürelerine neden olur58.
Bu protokol, test için mevcut toplam 12 tek katman için iki adet 6 oyuklu plakanın kullanıldığı orta verimli yöntemleri açıklar. Bununla birlikte, deneyler, ek teknik kopyaları barındırmak veya ek Shigella mutantlarını ve çevresel sinyalleri test etmek için ekilen tek katmanların sayısını artırmak için kolayca ölçeklendirilebilir. Daha fazla oyuklu doku kültürü plakaları (örneğin, 12 oyuklu veya 24 oyuklu plakalar), daha küçük çaplı kuyucukları hesaba katmak için uygun ayarlamalarla da kullanılabilir. Adım 3.2'de özetlenen HT-29 büyüme koşulları altında, HT-29 titreleri, HT-29 hücre kültürünü korumak için yeterli kalan hücre ile bir T75 şişesinden ekimi takiben yaklaşık altı adet 6 oyuklu plakanın tohumlanması için yeterlidir. Ayrıca, HT-29 tek tabakalarının tohumlanması ve bakteri aşılama adımlarının hazırlanması, bakteriyel aderans, invazyon ve hücre içi replikasyon deneyleri arasında aynıdır. Bu nedenle, aynı Shigella suşlarını veya alt kültür koşullarını test eden tahliller, Shigella enfeksiyonunun çeşitli aşamalarında her bir deneysel durumun rolünü aynı anda incelemek için paralel olarak kolayca gerçekleştirilebilir.
Yapışık (adım 4), invaze (adım 5) ve hücre içi bakteriler (adım 6) için kurtarma titreleri, Shigella enfeksiyonunun her aşamasının etkinliğinin kantitatif değerlendirmesini sağlayan lizizi takiben enfekte HT-29 hücrelerinin seri dilüsyonlarının kaplanmasıyla belirlenir. Klasiktahlillere dayanan invazyon ve hücre içi replikasyon tahlillerindeki santrifüj adımları 49,50,51, anında invazyon için konakçı hücrelerle bakteriyel teması teşvik eder ve invazyon oranlarını arttırır. Bu nedenle, santrifüjleme, daha sonra Shigella enfeksiyonunun önemli bir yönü olduğu keşfedilen yapışma adımını "atlar" 17,18,19,66. Santrifüj aşamasının, transwell'lere ekilen polarize epitel hücreleri ile gerçekleştirilemeyeceğine dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, yapışma testi için, yapışma santrifüjleme ile zorlanmaz ve lizizden önce enfekte olmuş HT-29 hücrelerine gentamisin eklenmez, böylece yapışkan bakteri hücrelerinin sayımına izin verilir. Bakterilerin HT-29 hücreleri ile daha verimli temasını sağlamak için doku kültürü ortamının hacmi 1 mL'ye düşürülür (invazyon ve hücre içi replikasyon deneyleri için 2 mL'nin aksine). Ayrıca, yapışma oranına bağlı olarak, 3 saatlik inkübasyon sırasında bir miktar invazyon ve hücre içi replikasyon meydana gelebilir, ancak miktar tipik olarak ihmal edilebilir düzeydedir (ör., konakçı hücre lizizini takiben geri kazanılan bakteri popülasyonunun sadece% 0.05'i). Bununla birlikte, 3 saatlik inkübasyon sırasında yapışık ve hücre içi bakterileri düzgün bir şekilde hesaba katmak için, belirtilen protokole ek olarak, ikinci bir plakanın 50 μg / mL gentamisin ile inkübe edildiği paralel deneylerin yapılması önerilir 2 mL DMEM içinde toplam 45 dakika boyunca (15 dakika inkübasyon, yıkama, 30 dakika boyunca taze DMEM + gentamisin) hücre dışı bakterileri iyice parçalamak için. Protokolde belirtildiği gibi HT-29 hücre lizizini takiben, hücre içi bakteriler yukarıda belirtildiği gibi numaralandırılabilir ve istila eden bakteri sayısını temsil eder. Bu değer daha sonra yapışık ve istila edilmiş bakterileri uygun şekilde belirlemek için gentamisin tedavisi olmadan plakadan sayılan bakterilerden çıkarılabilir. İnvazyondan sonra HT-29 hücreleri içinde Shigella'nın hücre içi replikasyonu hakkında daha fazla bilgi vermek için paralel analizler de yapılabilir, ör., hücre içi büyüme eğrilerini gerçekleştirmek için birden fazla zaman noktası kullanarak. Son olarak, 18 saatlik bir gentamisin inkübasyonundan sonra hücre içi bakterilerin numaralandırılmasının yanı sıra, kültür süpernatantları toplanabilir ve enfekte HT-29 hücrelerinin sitokin sekresyonu için analiz edilebilir. Örneğin, IL-8, epitel hücreleri tarafından salgılanan ve büyük ölçüde PMN'leri enfeksiyon bölgesine almak için işlev gören bir kemokindir. Enfekte HT-29 hücrelerinin kültür ortamına salgılanan IL-8 miktarı, bir IL-8 ELISA testi67 ile analiz edilebilir.
Safra tuzlarının, insan GI sisteminden geçiş sırasında Shigella için önemli bir virülans sinyali olduğu kanıtlanmıştır ve tipik GI koşullarını çoğaltmak için bu protokollerde bakteri üreme ortamını desteklemek için kullanılabilir. Doğal olarak, safra tuzları sindirime yardımcı olmak için duodenuma veya ince bağırsağın üst kısmına verilir; ve terminal ileumda veya ince bağırsağın sonunda, safra tuzlarının% 95'i çıkarılır ve safra kesesinde nihai birikim için dolaşıma geri dönüştürülür68. Safra tuzları genellikle ince bağırsakta %0.2-%2.0 (a/h) arasında bir konsantrasyona sahiptir ve doğal olarak bakterisittir. Bununla birlikte, Shigella, çoğu enterik bakteri ile birlikte safra tuzlarına direnir ve enfeksiyonu arttırmak için sinyalleri kullanır47. Birkaç çalışma, safra tuzlarına maruz kalmanın, zaman zaman glikoz gibi diğer ince bağırsak sinyalleriyle birlikte, enfeksiyondan önce Shigella'nın sağkalımını ve virülans regülasyonunu nasıl etkilediğini belgelemiştir. Shigella'nın safra tuzlarına direndiği, gen ekspresyonunu değiştirdiği ve ince bağırsak geçişini yeniden üreten koşullarda bir biyofilm oluşturduğu ve dağıttığıgösterilmiştir 17,69. Çalışmalar, bu değişikliklerin Shigella17,18,19,48,66 tarafından müteakip kolon enfeksiyonu üzerine yapışma ve invazyonun indüklendiği hipervirülan bir fenotiple sonuçlandığını göstermiştir. Bu nedenle, yukarıda özetlenen koşullar, aderans, invazyon veya hücre içi replikasyon testlerini gerçekleştirmeden önce ince bağırsak geçişini taklit etmek için Shigella'nın safra tuzlarında nasıl alt kültürleneceğini belgelemektedir. Belirtilen TSB formülasyonu, tipik Luria suyuna (LB) göre ilave glikoz içerir.17. Bu nedenle, LB kullanılıyorsa, ince bağırsaktaki glikoz sinyallerini uygun şekilde değerlendirmek için ortamı glikozla (%0.5-%2.0 [a/h]) takviye etmek de önemlidir17. Ayrıca, yukarıda bahsedildiği gibi, tüm Shigella alt kültürleri safra tuzlarını uzaklaştırmak ve enfeksiyon analizleri için kolona geçişi taklit etmek için yıkanır.
Geleneksel olarak ve yukarıdaki sonuçlarda vurgulandığı gibi (Şekil 1 ve Şekil 2), enfeksiyon tahlilleri, Shigella enfeksiyonunda belirli bir genin rolünü belirlemek için değerlidir. Bununla birlikte, çeşitli mutantların fenotipi, bakteri kültürü ortamının uygun şekilde takviyesi olmadan gerçekten takdir edilemeyebilir. Önceki araştırmaların gösterdiği gibi, safra tuzları, merkezi metabolizma genleri, transkripsiyon faktörleri, şeker taşıyıcıları, ilaç direnci ve kromozom veya virülans plazmidi17 üzerinde kodlanmış virülans genleri dahil olmak üzere S. flexneri gen ekspresyonunu önemli ölçüde değiştirir. Bu genler, Shigella'nın gen ekspresyonunu değiştirmek ve kolonun nihai enfeksiyonuna hazırlanmak için bir sinyal olarak safra tuzlarını nasıl kullandığına dair fikir verir ve bu nedenle sonraki mutasyon analizlerinin, aderans, invazyon ve hücre içi replikasyon deneylerinde virülans üzerindeki etkileri incelemeden önce uygun takviye edilmiş bakteri üreme ortamında yapılması gerekir. Yukarıda Şekil 1 ve Şekil 2'de görüldüğü gibi, ΔVF mutasyonu uyumu etkilemedi, ancak invazyonu ve hücre içi replikasyonu etkiledi. Mutasyon invazyonu ve hücre içi replikasyonu arttırdığından, gen ürününün enfeksiyonu nasıl düzenlediğini belirlemek için deneyler devam etmektedir. Mutant analizleri, Shigella patogenezindeki yeni anlayışların, özellikle insan GI yolunu daha iyi kopyalayan koşullarda nasıl çalışılabileceğinin bir örneği olarak hizmet eder. Çeşitli mutantların fenotiplerini doğrulamak için uygun tamamlama analizleri önerilir.
Kombinasyon halinde, bu prosedürler, enfeksiyon sırasında insan GI yolunun doğal ortamını en iyi şekilde taklit ederek, HT-29 kolon epitel hücrelerine Shigella yapışması, istilası ve replikasyonunun moleküler mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlayacak kantitatif deneyleri tanımlar. Gelecekteki çalışmalar, Shigella'nın insan konakçılara nasıl hazırlandığını ve etkili bir şekilde enfekte ettiğini daha iyi anlamak için mutantları ve deneysel koşulları genişletebilir. Onlarca yıl süren araştırmalara rağmen, Shigella enfeksiyonu hakkında keşfedilecek daha çok şey var.

Enterik bakteriyel patojenlerin neden olduğu ishalli hastalıklar önemli bir küresel sağlık yüküdür. 2016 yılında, ishalli hastalıklar dünya çapında 1,3 milyon ölümden sorumluydu vebeş yaşından küçük çocuklarda dördüncü önde gelen ölüm nedeniydi 1,2. Gram-negatif, enterik bakteriyel patojen Shigella, dünya çapında ishal ölümlerinin önemli bir nedeni olan shigellozun etken maddesidir3. Shigellosis her yıl düşük ve orta gelirli ülkelerdeki çocuklarda önemli morbidite ve mortaliteye neden olurken, 4,5 yüksek gelirli ülkelerdeki enfeksiyonlar kreş, gıda kaynaklı ve su kaynaklı salgınlarlabağlantılıdır 6,7,8,9. Etkisiz aşı geliştirme10 ve artan antimikrobiyal direnç (AMR) oranları11,12, büyük ölçekli Shigella salgınlarının yönetimini karmaşıklaştırmıştır. Son Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri verileri, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki Shigella enfeksiyonlarının yaklaşık %46'sının 2020'de ilaç direnci gösterdiğinigösteriyor 13,14, Dünya Sağlık Örgütü ise Shigella'yı acilen yeni tedavilere ihtiyaç duyulan AMR öncelikli bir patojen olarak ilan etti15.
Shigella enfeksiyonları, kontamine yiyecek veya suyun yutulması üzerine fekal-oral yolla veya doğrudan insan teması yoluyla kolayca bulaşır. Shigella, hastalığa neden olmak için yeterli 10-100 bakteri dozu ile verimli, insana uyarlanmış bir patojen olarak gelişmiştir16. İnce bağırsak geçişi sırasında Shigella, yüksek sıcaklık ve safra gibi çevresel sinyallere maruz kalır17. Bu sinyallerin saptanması, bakterilerin insan kolonunu enfekte etme yeteneğini artıran virülans faktörlerini ifade etmek için transkripsiyonel değişiklikleri indükler 17,18,19. Shigella, apikal yüzeyden kolon epitelini istila etmez, bunun yerine folikülle ilişkili epitel20,21,22 içindeki özel antijen sunan mikro kıvrım hücrelerine (M hücreleri) alımını takiben epitel tabakası boyunca geçiş yapar. Transsitozu takiben, Shigella hücreleri yerleşik makrofajlar tarafından fagosite edilir. Shigella hızla fagozomdan kaçar ve makrofaj hücre ölümünü tetikleyerek proinflamatuar sitokinlerin salınmasına neden olur 5,23,24. Shigella daha sonra bazolateral taraftan kolon epitel hücrelerini istila eder, makropinositik vakuolün parçalanması ve sitoplazmada replikatif bir niş oluşturur 5,25. Pro-inflamatuar sitokinler, özellikle interlökin-8 (IL-8), polimorfonükleer nötrofil lökositleri (PMN'ler) enfeksiyon bölgesine toplar, bu da epitelyal sıkı bağlantıları zayıflatır ve bazolateral enfeksiyonu şiddetlendirmek için epitel astarının bakteriyel infiltrasyonunu sağlar5. PMN'ler, enfeksiyonu kontrol altına almak için enfekte epitel astarını tahrip eder, bu da basiller (kanlı) dizanteri5'in karakteristik semptomlarına neden olur. İnvazyon ve hücre içi replikasyon mekanizmaları kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş olsa da, yeni araştırmalar Shigella enfeksiyonunda gastrointestinal (GI) geçiş sırasında virülans regülasyonu17, aderans19, bariyer geçirgenliği26 yoluyla gelişmiş bazolateral erişim ve yetersiz beslenen çocuklarda asemptomatik taşıma27 dahil olmak üzere önemli yeni kavramları göstermektedir.
Shigella spp.'nin ishal hastalığına neden olma yeteneği insanlar ve insan olmayan primatlarla sınırlıdır (NHP)28. Zebra balığı 29, fareler30, kobaylar31, tavşanlar21,32,33 ve domuzlar34,35 için Shigella bağırsak enfeksiyonu modelleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu model sistemlerin hiçbiri, insan enfeksiyonu sırasında gözlemlenen hastalık özelliklerini doğru bir şekilde kopyalayamaz36. Shigella patogenezini incelemek için NHP shigellosis modelleri oluşturulmuş olsa da, bu model sistemlerin uygulanması pahalıdır ve insanların enfeksiyöz dozundan dokuz kat daha yüksek olan yapay olarak yüksek enfeksiyöz dozlar gerektirir 37,38,39,40,41,42. Bu nedenle, Shigella'nın insan konakçıların enfeksiyonu için dikkate değer adaptasyonu, Shigella patogenezinin doğru bir şekilde sorgulanması için fizyolojik olarak ilgili modelleri yeniden oluşturmak için insan kaynaklı hücre kültürlerinin kullanılmasını gerektirir.
Burada, HT-29 kolonik epitel hücrelerinde Shigella'nın yapışması, invazyonu ve replikasyon oranlarını ölçmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. Bu standartlaştırılmış protokoller kullanılarak, bakteriyel virülans genlerinin ve çevresel sinyallerin Shigella enfeksiyonunun her adımını etkilediği moleküler mekanizmalar, dinamik konakçı-patojen etkileşimi ilişkisini daha iyi anlamak için sorgulanabilir.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu; m PES filtre</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525</td><td>50 mL'ye kadar ortamı sterilize etmek için steril, polietersülfon filtre</td></tr><tr><td>14 mL kültür tüpleri</td><td>Corning</td><td>352059</td><td>17 mm x 100 mm kapaklı polipropilen test tüpleri</td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL şeffaf polipropilen konik tabanlı santrifüj tüpleri, sızdırmaz kapaklı</td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Plakalar optimal hücre bağlantısı için işlenir</td></tr><tr><td>Safra tuzları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>1:1 kolatın deoksikolat oranı</td></tr><tr><td>Kongo kırmızı boyası</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>Benzidin bazlı anyonik diazo boya, %>85 saflıkta</td></tr><tr><td>Kontes hücre sayma odası slaydı</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Kontes Otomatik Hücre Sayacı</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>ile birlikte kullanılmak üzereSigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>A oldukça polar bir organik reaktif</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEM, yüksek glikoz, sodyum piruvat, GlutaMAX ve Fenol ile desteklenmiştir Kırmızı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Isı ile aktive edilmiş, steril</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td><td>Stok konsantrasyonu 50 mg / mL'dir</td></tr><tr><td>HT-29 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Adenokarsinom hücre hattı; kolorektal in Menşei</td></tr><tr><td>Parafin filmi</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>Laboratuvar sızdırmazlık filmi</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>100 mm x 15 mm Katı ortamlar için petri kapları</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>1x konsantrasyon; pH 7.4</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen 30391023</td><td></td> <td>seçinBakteriyel kaplama ortamı yapmak için kırmızı deniz yosunu hücre duvarlarından ekstrakte edilen bir polisakkarit karışımı</td></tr><tr><td>T75 şişeleri</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Doku kültürü şişeleri</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Yaygın bir iyonik olmayan yüzey aktif madde ve emülgatör;</td></tr><tr><td>Tripan mavisi leke</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Ölü doku kültürü hücrelerini tespit etmek için bir boya; sadece canlı hücreler boyayı dışlayabilir</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Hücre hattı bakımı ve pasajı için hücre ayrışması için reaktif</td></tr><tr><td>Triptik Soya Suyu (TSB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>Bakteri üreme ortamı</td></tr></tbody></table>

shigella ile epitel hücre enfeksiyonu analizleri

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

İnsan tarafından uyarlanmış enterik bakteriyel patojen Shigella, her yıl milyonlarca enfeksiyona neden olur, pediatrik hastalar arasında uzun vadeli büyüme etkileri yaratır ve dünya çapında ishal ölümlerinin önde gelen nedenidir. Enfeksiyon, patojenin gastrointestinal sistemden geçmesi ve kolonu kaplayan epitel hücrelerini enfekte etmesi sonucu sulu veya kanlı ishale neden olur. Antibiyotik direncindeki şaşırtıcı artışlar ve onaylanmış aşıların mevcut eksikliği nedeniyle, standartlaştırılmış araştırma protokolleri bu zorlu patojeni incelemek için kritik öneme sahiptir. Burada, kolonik epitel hücrelerinde bakteriyel aderans, invazyon ve hücre içi replikasyonun in vitro analizlerini kullanarak Shigella'nın moleküler patogenezini incelemek için metodolojiler sunulmaktadır. Enfeksiyon analizlerinden önce, Shigella kolonilerinin virülans fenotipi, Kongo kırmızı boyasının agar plakalarına alınmasıyla doğrulandı. Takviye edilmiş laboratuvar ortamı, in vivo koşulları taklit etmek için bakteri kültürü sırasında da düşünülebilir. Bakteri hücreleri daha sonra, enfeksiyonun her aşamasını analiz etmek için adaptasyonlarla belirlenmiş bir enfeksiyon çokluğunda doku kültürü plakalarındaki kolon epitel hücrelerini enfekte etmek için standart bir protokolde kullanılır. Aderans testleri için, Shigella hücreleri, epitel hücreleriyle bakteriyel teması teşvik etmek için azaltılmış ortam seviyeleri ile inkübe edilir. Hem invazyon hem de hücre içi replikasyon deneyleri için, hücre dışı bakterileri ortadan kaldırmak ve invazyonun değerlendirilmesini ve / veya hücre içi replikasyon oranlarının ölçülmesini sağlamak için çeşitli zaman aralıklarında gentamisin uygulanır. Tüm enfeksiyon protokolleri, enfekte epitel hücre lizatlarını seri olarak seyrelterek ve Kongo kırmızı agar plakaları üzerindeki enfekte titrelere göre bakteri kolonisi oluşturan birimleri kaplayarak yapışık, istila edilmiş ve/veya hücre içi bakterileri numaralandırır. Birlikte, bu protokoller, bu patojeni başarılı bir şekilde incelemek için epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonunun her aşaması için bağımsız karakterizasyon ve karşılaştırmalar sağlar.

Aderans, invazyon ve hücre içi replikasyon testleri, S. flexneri 2457T vahşi tip (WT) ile Shigella virülansını negatif olarak düzenlediği varsayılan bir mutant olan S. flexneri ΔVF (ΔVF) karşılaştırılarak gerçekleştirildi. Shigella, virülansıdüzenlemek için bir sinyal olarak safra tuzlarını kullandığından 17,18,47, TSB ortamında bakteri alt kültüründen sonra deneyler yapıldı ve TSB% 0.4 (a / h) safra tuzları ile desteklendi18. Alt kültür aşaması sırasında safra tuzlarına maruz kalma, kolon enfeksiyonundan önce ince bağırsak geçişini çoğaltmak için bir ön tedavi görevi görür 17,18,47. Şekil 1, ΔVF mutasyonunun S. flexneri'nin HT-29 kolonik epitel hücrelerine yapışma yeteneği üzerindeki etkisini analiz etmektedir. Yapışma yüzdesi y ekseninde çizilir ve standardize edilmiş HT-29 lizizini takiben geri kazanılan bakterilerin giriş bakteri sayısına oranını temsil eder. Beklendiği gibi, hem S. flexneri WT hem de ΔVF suşları, safra tuzları takviyesi olmadan TSB'ye kıyasla safra tuzları takviyesi ile alt kültürlendiğinde yapışmada önemli bir artışa sahipti18. Bununla birlikte, her bir alt kültür koşulunda WT ve ΔVF mutant suşları arasında HT-29 hücrelerine bağlılıkta bir fark yoktu. Bu veriler, ΔVF mutasyonunun, S. flexneri'nin HT-29 epitel hücrelerine ön tedavi ile veya safra tuzları olmadan yapışma yeteneği üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir.
Şekil 2'de, ΔVF mutasyonunun, S. flexneri'nin HT-29 kolon epitel hücrelerinin içinde safra tuzları ön tedavisi olan veya olmayan istila etme (Şekil 2A) ve replike etme (Şekil 2B) yeteneği üzerindeki etkisi analiz edildi. Geri kazanım yüzdesi y ekseninde çizilir ve standardize edilmiş HT-29 hücre lizizini takiben geri kazanılan bakteri hücrelerinin giriş bakteri sayısına oranını temsil eder. Şekil 2A'da, WT S. flexneri 2457T'nin safra tuzlarına48 ön maruziyetten sonra HT-29 hücrelerini istila etme yeteneğinde önemli bir artış beklenirken, S. flexneri ΔVF mutantı WT suşuna kıyasla safra tuzlarına maruz kaldıktan sonra invazyonda daha küçük bir artış gösterdi. ΔVF mutantı, TSB'de alt kültürlenen WT'ye kıyasla HT-29 hücrelerinin invazyon oranlarını arttırdı, ancak TSB'de safra tuzları ile desteklendiğinde WT ile benzer invazyon oranlarına sahipti (Şekil 2A). Bu sonuçlar, ΔVF mutasyonunun, S. flexneri'nin HT-29 hücrelerini istila etme yeteneğini arttırdığını, bu da ΔVF mutantının invazyon kabiliyetinin safra tuzları alt kültürünü takiben daha da artmasına rağmen, maruziyet öncesi safra tuzlarının etkisini azalttığını göstermektedir.
Genel olarak, gece boyunca inkübasyondan sonra 10 kat daha fazla bakteri geri kazanıldı (Şekil 2B), 90 dakikalık inkübasyona (Şekil 2A) kıyasla, sırasıyla hücre içi büyümenin invazyona karşı izlenmesindeki farklılıkları göstermektedir. Enfekte HT-29 hücreleri, bakterilerin hücre içi replikasyonuna izin vermek için 18 saat inkübe edildiğinde (Şekil 2B), safra tuzlarının ön tedavisinin etkisi hem WT hem de ΔVF suşları için azalmıştır. Bununla birlikte, hücre içi replikasyon sırasında safra tuzlarının ön tedavisinin azaltılmış etkisi, ΔVF mutantı için daha dramatikti. Safra tuzlarına önceden maruz kaldıklarında her iki suşun hücre içi replikasyonundaki artış, aynı koşullarda invazyon oranlarındaki artıştan daha küçük olduğundan, safra tuzlarının S. flexneri patogenezindeki erken adımlar üzerinde daha büyük bir etkiye sahip olduğunu varsayıyoruz. ΔVF mutantı, her iki alt kültür koşulunu takiben WT'ye (Şekil 2B) kıyasla HT-29 hücreleri içindeki gece replikasyonundan elde edilen geri kazanım yüzdesinde bir artış gösterdi. Bununla birlikte, ΔVF mutantının geri kazanım yüzdesi, maruziyet öncesi safra tuzlarından bağımsız olarak benzerdi. Bu veri eğilimleri, ΔVF mutantının WT'ye kıyasla HT-29 hücreleri içinde daha verimli bir şekilde çoğaldığını ve safra tuzlarının ön maruziyetinin, WT için gözlemlendiği gibi ΔVF mutantının hücre içi olarak çoğalma yeteneğini etkilemediğini göstermektedir (Şekil 2B). 90 dakikalık invazyon testi sırasında safra tuzlarının maruziyet öncesi koşulundaki mutant ve WT suşları arasındaki fark gözlenmediğinden, silinen VF geni tarafından kodlanan ürünün, HT-29 hücreleri içinde S. flexneri replikasyonunu da düzenleyebileceğini varsayıyoruz. Kombine olarak, her iki analiz de ΔVF mutantının WT'ye göre daha öldürücü olduğunu göstermektedir, bu da VF gen ürününün S. flexneri virülansının negatif bir düzenleyicisi olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg"> Şekil 1: Safra tuzları, S. flexneri'nin HT-29 hücrelerine maruziyet öncesi indüklenmiş yapışmasını indükledi. S. flexneri 2457T WT ve ΔVF mutant hücreleri, %0.4 (a/h) safra tuzları (TSB+BS) ortamı ile desteklenmiş TSB veya TSB'de alt kültürlendi. Bakteriler daha sonra HT-29 hücrelerine 100 enfeksiyon çokluğunda (MOI) uygulandı ve yapışmayı incelemek için 3 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, enfekte olmuş HT-29 hücreleri yıkandı ve parçalandı ve geri kazanılan bakterilerin seri seyreltmeleri, mL başına koloni oluşturan birimleri (CFU / mL) numaralandırmak için kaplandı. Yapışma yüzdesini belirlemek için yapışan bakteri sayısı, giriş bakteri titrelerine göre çizilir. Veriler, üç teknik kopya (tek tek noktalar) ile bir biyolojik kopyayı temsil eder. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını gösterir. İstatistiksel anlamlılık Student t-testi ile belirlendi (*p &lt; 0.05; ***p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg"> Şekil 2: Safra tuzları maruziyet öncesi WT S. flexneri invazyonunu ve hücre içi replikasyonu arttırdı. S. flexneri 2457T WT ve ΔVF mutant hücreleri, safra tuzları (TSB+BS) ortamı ile takviye edilmiş TSB veya TSB'de alt kültürlendi. Bakteriler daha sonra 100'lük bir MOI'de HT-29 hücrelerine uygulandı, hücrelere santrifüjlendi ve 37 ° C'de% 5 CO2 ile 45 dakika inkübe edildi. Hücreler PBS ile yıkandı ve hücre içi bakterileri sadece geri kazanmak için DMEM'e gentamisin ilavesiyle hücre dışı bakteriler parçalandı. 90 dakika (A, bakteri istilası) veya 18 saat (B, hücre içi replikasyon) inkübasyonlarından sonra, enfekte olmuş HT-29 hücreleri yıkandı ve parçalandı ve geri kazanılan bakterilerin seri dilüsyonları, mL başına koloni oluşturan birimleri (CFU / mL) numaralandırmak için kaplandı. Hücre içi bakteri sayısı, iyileşme yüzdesini belirlemek için giriş bakteri titrelerine göre çizilir. Veriler, her biri üç teknik kopyaya (tek tek noktalar) sahip bir biyolojik kopyayı temsil eder. Hata çubukları SEM'i gösterir. İstatistiksel anlamlılık Student t-testi ile belirlendi (*p &lt; 0.05). Lütfen (A) ve (B) panelleri arasındaki y ekseni ölçeklerindeki farklılıklara dikkat edin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Mevcut protokol, in vitro epitel hücre dizileri kullanılarak Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu sorgulamak için enfeksiyon testlerini açıklamaktadır.

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Shigella, her yıl yıkıcı enfeksiyon oranlarına neden olan önemli bir küresel patojendir. Shigella, ishal veya dizanteriye neden olmak için gastrointestinal sistemi enfekte eder. Araştırmamız, aşılar ve diğer antimikrobiyal ürünler gibi daha etkili terapötikler geliştirmeye yardımcı olmak için enfeksiyon anlayışımızı geliştirmeyi amaçlamaktadır.İlk olarak, hayvan modelleri ve ortaya çıkan doku kültürü teknikleri, Shigella enfeksiyonunun fizyolojisini daha iyi anlamamıza ve insan GI yolunun karmaşıklığını aslına uygun olarak yeniden üretmemize olanak tanır. İkincisi, klinik Shigella izolatlarının karakterizasyonu, bu cinsin çeşitliliğini yakalamaya, önemli virülans genlerini tanımlamaya ve enfeksiyon anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olmuştur. Shigella'nın ince bağırsakta geçişten nasıl kurtulduğunu ve kalın bağırsakta enfeksiyon için virülans gen ekspresyonunu nasıl düzenlediğini anlamak için safra tuzları ve glikoz gibi gastrointestinal sinyalleri kullandık.Shigella'nın safra tuzlarına nasıl direndiğini gösterdik ve Shigella'nın enfeksiyonu başlatmak için epitel hücreleriyle teması başlatmaya yardımcı olmak için yapışma proteinleri ürettiğini gösterdik. Bu protokoller, Shigella'nın aderansı, invazyonu ve hücre içi sağkalımı gibi epitelyal enfeksiyonun temel yönlerine bakmak için tasarlanmıştır. Bu protokolleri standart bir epitel hücre hattı kullanarak gerçekleştiriyoruz, ancak şu anda mevcut olan karmaşık insan GI modelleri için yöntemleri de uyarladık.Bu protokoller, enfeksiyonun her aşamasını bağımsız olarak ele alır, bu da Shigella enfeksiyonundaki temel adımları anlamak için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, kombine analizlerin Shigella enfeksiyonunun bütünsel düzeyde daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabileceğini vurgulamaktadırlar.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Vonaesch, P. ve ark., Memeli Hücrelerinin Bakteriyel Meydan Okumasından Sonra Stres Gralüleri Oluşumunun İmmünofloresan Analizi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, epitel hücrelerinin patojenik bakteri Shigella flexneri ile enfekte edilmesini ve bunun sonucunda oluşan konak hücresel yanıtını göstermektedir. Bakteriyel efektör proteinler, konak translasyonunu bozarak stres granülleri adı verilen zarsız organellerin oluşumunu tetikler; bu organeller hücrenin enfeksiyona adaptif yanıtını...

Kanserli epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonu sırasında stres granülleri oluşumu

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

Bu video, insan epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonu üzerine lokal ve küresel kalsiyum iyonu tepkisini tespit etmek için bir tekniği göstermektedir. Shigella, konakçı hücreleri istila eder ve hücre içi kalsiyum seviyelerini etkileyen istila efektörlerini serbest bırakır. Lokal ve global sitozolik kalsiyumun genliği ve frekansı bir floresan indikatör kullanılarak incelenir.

Bakterilerle enfekte olmuş hücrelerde kalsiyum tepkisini incelemek için bir görüntüleme tekniği

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Patojen yayılmasını karşı koymak için, konakçı hücreler bakteriler ve bölümlere Otofaji uyarabilme iskeletinin yeniden. Doku kültürü hücreleri, ev sahibi ve bu işlem altında patojen belirleyicileri kullanılarak Shigella enfeksiyonu tespit ve karakterize edilir. Shigella enfeksiyonu Zebra balığı modellerini kullanarak, keşfedilen moleküllerin ve mekanizmaların rolü in vivo incelenmiştir.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Burada, kalsiyum (Ca2 +) yanıt Shigellatarafından enfekte HeLa hücreleri tarafından elde edildi görselleştirmek için protokolleri mevcut. Bakteriyel enfeksiyon parametrelerini optimize ve Ca2 + floresan problar ile görüntüleme, enfeksiyon kinetik büyük bir aralığı içinde bakteriler tarafından indüklenen atipik küresel ve yerel Ca2 + sinyalleri karakterize edilmektedir.

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme

M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme...

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Entamoeba histolytica insan enfeksiyon amebiazisli, tropikal ülkelerde ishal önemli bir nedeni yol açar. Enfeksiyon, hücre-hücre kontaktların açılmasına ve dolayısıyla ishal, bazen karaciğer enfeksiyonu tarafından takip edilen tahrik, intestinal epitel hücreleri ile patojenik etkileşimleri ile başlatılır. Bu makale Amebiazis patogenezinde anlayışımızı geliştirmek için erken konak-patojen değerlendirmek için bir model sunar.

Yapımcı Epitel Hasar Analizi<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Enfeksiyon

Keşfedin Shigella ile epitel hücre enfeksiyonu analizlerini in vitro hücre hatları kullanarak. Bu yöntem, patojenin yapışma, istila ve hücre içi çoğalma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Daha fazla video keşfet