Name: Yumurtalık Kanseri Organoidlerinin Biyobankacılığı Stratejisi: Histolojik Alt Tipler ve Hastalık Evrelerinde Hastalar Arası Heterojenliğin Ele Alınması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Keşfedin, yumurtalık kanseri organoidlerinin biyobankacılığı için güvenilir bir yöntem. Hasta özgü değişkenliği ele alarak uzun vadeli genişleme ve kişiselleştirilmiş tedavi potansiyelini artırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, DKFZ ve Münih Üniversite Hastanesi arasındaki bir ortaklık olan Alman Kanser Araştırma Merkezi DKTK, Ortak site Münih tarafından finanse edilmektedir. Çalışma aynı zamanda Alman Kanser Yardımı hibesi (#70113426 ve #70113433) tarafından da desteklenmektedir. Doku ve organoidlerin parafin gömülmesi, LMU Münih, Münih Tıp Fakültesi Anatomi Enstitüsü'nün Çekirdek tesisinde gerçekleştirilmiştir. Konfokal Görüntüleme, Biyomedikal Merkezi'ndeki (BMC) Biyogörüntüleme Çekirdek tesisinde gerçekleştirilmiştir. Yazarlar teknik yardım için Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink ve Martina Rahmeh'e teşekkür etmek istiyor.

Yumurtalık Kanserinin Standardize Edilmesi Organoid Biyobankacılık

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).</li>
<li>Berger, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+pan-cancer+molecular+study+of+gynecologic+and+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers.</a> Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).</li>
<li>Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biobanks%3A+addressing+the+practical+and+ethical+issues+to+deliver+a+valuable+tool+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).</li>
<li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanking+in+health+care%3A+evolution+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Biobanking in health care: evolution and future directions.</a> J Transl Med. 17 (1), 172(2019).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Larsen, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-cancer+organoid+platform+for+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A pan-cancer organoid platform for precision medicine.</a> Cell Rep. 36 (4), 109429(2021).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+drug+screening+of+patient-derived+tumor+organoids+using+high-content+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101407(2022).</li>
<li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+efficient+establishment+and+drug-response+profiling+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids.</a> Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).</li>
<li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Next-generation cancer organoids.</a> Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expansion+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids+requires+a+low-Wnt+environment%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment.</a> EMBO J. 39 (6), e104013(2020).</li>
<li>Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+and+Wnt+pathways+regulate+stemness+and+differentiation+in+human+fallopian+tube+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids.</a> Nat Commun. 6, 8989(2015).</li>
<li>Trillsch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+optimize+the+biobanking+of+ovarian+cancer+organoids+by+accommodating+patient-specific+differences+in+stemness+potential%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102484(2023).</li>
<li>Maenhoudt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+organoids+from+ovarian+cancer+as+experimental+and+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models.</a> Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).</li>
<li>Fuerer, C., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+to+probe+and+manipulate+the+Wnt+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway.</a> PLoS One. 5 (2), e9370(2010).</li>
<li>Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf">https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf</a> (2021).</li>
<li>Thermo Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microm+EC350+Modular+tissue+embedding+center+Instruction+manual%22">Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual</a>. , (2009).</li>
<li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Sci Rep. 10 (1), 12581(2020).</li>
</ol>

M.K., yumurtalık kanseri organoidleri için bir besiyeri ile ilgili bir patentte mucit olarak listelenmiştir. F.T., AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics ve Tesaro/GSK'dan araştırma fonu, danışma kurulu, onur ve seyahat masrafları aldı. S.M. araştırma fonu, danışma kurulu, onursal veya seyahat masrafları aldı: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

Tasarlanan protokol, organoid oluşumu ve uzun vadeli geçiş potansiyeli ile ilgili olarak yumurtalık kanseri organoid biyobankacılığının önceki zorluklarını ele alır ve katı tümör birikintilerinin çoğundan tamamen genişletilebilir hatların oluşturulmasını sağlar. Organoid üretimi için kullanılacak tümör örneklerinin cerrahi olarak toplanması süreci, verimi ve genişleme potansiyelini önemli ölçüde etkiler. Tümör dokusu örnekleri, çoklu viseral cerrahi, tanısal laparoskopi veya biyopsi dahil olmak üzere çeşitli prosedürler sırasında elde edilebilir. Deneyimli jineko-onkolojik cerrah, peritoneal lokalizasyonlardan temiz tümör örnekleri almaya öncelik vermelidir. Özellikle, büyük tümör birikintileri içindeki makroskopik olarak nekrotik alanların, organoid kültürlerin başarılı bir şekilde üretilmesi için daha az uygun olduğu gözlenmiştir. Numune saflığı, sonraki uygulamalar için moleküler ve fenotipik özellikleri yansıtmak için çok önemli olduğundan, hatların tümörün en ilgili bölgelerinden oluşturulmasını sağlamak için optimal biyobankacılık için hem klinik hem de laboratuvar ekiplerinin senkronize çabaları gereklidir.
Bu protokol, 2 yıllık biyobankacılık sırasında gözlemlediğimiz büyüme faktörü bağımlılıklarındaki varyasyonları kapsasa da, vakaların %20'sinde hala herhangi bir organoid büyümesi gözlemlemediğimiz ve sınırlı genişleme potansiyeli gösteren hatların sayısı, saplılığın optimal olmayan bakımını önerdiğinden, etkinliği daha da artırmak için ek iyileştirmenin garanti edildiği açıktır. Organoid biyobankamız şu anda sadece seröz histolojinin yumurtalık kanseri örneklerini (HGSOC ve LGSOC) içermesine rağmen, yapılandırılmış biyobankacılık programından önce farklı epitelyal yumurtalık kanseri histolojilerinden alınan örneklerle ilgili deneyimlerimiz, belirli farklılıklar olmaksızın karşılaştırılabilir başarı oranları sergilemiştir. Özellikle, epitelyal yumurtalık kanseri alt tiplerinin çoğu, Müllerian sistemden (fallop tüpü, uterus, serviks) gelişen dokularla benzer bir kolumnar psödostratifiye morfolojiyi paylaşırken, bunun aksine, yumurtalık epitelinin kendisi gelişimsel olarak genital sırt ve mezonefrözlerden kaynaklanır ve tek bir küboidal epitel tabakası ile kaplıdır. Epitelyal homeostazı düzenleyen gelişimsel yolaklar, erişkin kök hücre potansiyelinin kontrolünde merkezi bir role sahip olduğundan, organoidlerin biyo-bankacılığı için protokoller geliştirilirken embriyonik orijindeki farklılıklar dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, yumurtalık yüzeyindeki progenitörlerin, uzun vadeli istikrarlı büyümeyi sürdürmek için muhtemelen organa özgü kültür koşullarına ihtiyaç duyduğuna inanıyoruz.
Özellikle, laboratuvarımızda, neoadjuvan kemoterapinin hücre canlılığını ve doku fenotipini etkilemesine rağmen, protokolün post-neoadjuvan yumurtalık kanseri örnekleri için de başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Bu örnekler, organoid oluşum potansiyelini etkileyebilecek primer hacim giderme ameliyatlarının kemoterapi-naif dokusundan türetilen örneklere kıyasla daha fazla enkaz ve hücre dışı doku agregatı sergiler. Bu vakalarda, post-neoadjuvan numuneler daha hassas olabileceğinden, başarılı organoid üretimi için uygun miktarda cerrahi doku ve önerilen taşıma koşullarına sıkı sıkıya bağlı kalmanın çok önemli olduğunu deneyimledik.
Tekrar tekrar gözlemlediğimiz ve bu nedenle standartlaştırılmış deneysel prosedüre dahil ettiğimiz, yeni izole edilmiş progenitörlerin 2D'de plastik üzerindeki kısa genişlemesinin müteakip organoid büyümesi üzerindeki yararlı etkisinin çok ilginç bir fenomeni, büyük ölçüde doğrudan tohumlama stratejilerine dayanan kanser organoidleri araştırma alanı metodolojisine önemli bir katkıdır. Enzimatik sindirimden sonra progenitörlerin duyarlılığının ve büyüme faktörlerinin bunları yeterince hazırlama yeteneğinin, bu farkın altında yatan mekanizmalar olabileceğini tahmin etmek caziptir, bu da bazı durumlarda çizgi oluşturulabilirse belirleyici bir faktördür. Bununla birlikte, net bağımlılıklar oluşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sindirimi zor olan 3D yumurtalık kanseri organoidlerinde yüksek hücre yapışması ve fonksiyonel bağlantıların yarattığı zorlukların üstesinden gelmede, iğne ve şırınga ile mekanik ve enzimatik ayrışmanın bir kombinasyonu, tripsinizasyondan sonra büyük kümeler kaldığında yardımcı olabilir. Farklı enzimatik koşullarla denemeler yapmak daha fazla iyileştirmeye yol açabilir.
Uzun süreli depolamadan sonra, organoid hatları çözülebilir ve deneysel tasarıma göre kültüre getirilebilir ve sonraki uygulamalar için kullanılabilir. Bu, belirli araştırma amaçları için önceden oluşturulmuş organoid hatlarına herhangi bir zamanda erişim sağlar ve hastanın hastalık ilerlemesi ışığında belirli hatların uzun vadeli davranışını araştırmak için özellikle ilgi çekicidir. Bununla birlikte, yumurtalık kanseri organoidlerinin dondurularak saklanması bir zorluk olmaya devam etmektedir. Donma ve çözülme döngüleri sırasındaki sıcaklık değişimleri, organoid canlılığını, işlevselliğini ve genişleme potansiyelini olumsuz etkileyebilir. Uzun süreli depolama, organoidlerin bütünlüğünün korunabilmesi için çok düşük sıcaklıkların bozulma riskini en aza indirdiği sıvı nitrojende daha kararlıdır. Bununla birlikte, bu süreçleri daha da iyileştirmek için dondurma, depolama ve çözdürme için tutarlı prosedürler oluşturmak için sürekli optimizasyon garanti edilir.
Bahsedilen olağanüstü sorunlara rağmen, bu protokol, yumurtalık kanserli hastaların katı tümör örneklerinden tutarlı bir şekilde stabil organoid hatları üretme kapasitesini göstermektedir. Laboratuvarımızda bugüne kadar 120 primer yumurtalık kanseri doku örneğini işledik ve primer debulking, rekürren hastalık ve postneoadjuvan cerrahi örneklerle çok çeşitli histolojik alt tipler ve hastalığın evreleri dahil olmak üzere vakaların yaklaşık %50'sinde başarı elde ettik. Bu protokol, çeşitli hasta örneklerinden elde edilen organoidlerin üretilmesi, farklı ortamlarda paralel tohumlama ve farklı tohumlama stratejilerinin uygulanması için yapılandırılmış bir çerçeve sağlayarak, kök potansiyelindeki bireysel farklılıkları değerlendirme fırsatı sunar, böylece tümör biyolojisi hakkında ek bilgi sağlar. Bildiğimiz kadarıyla, çalışmaların büyük çoğunluğu genellikle ortam bileşenlerini az sayıda numune üzerinde test etme ve basitlik için çoğunlukla bir optimum ortam seçme yaklaşımını takip eder. HER1ß'nin etkisini, RSPO1 ve FGF10 takviyesinin etkisini ve 2D/3D tohumlamayı sistematik olarak test etmemiz, yumurtalık kanseri dokusunun kök özelliklerinde bir dereceye kadar hastalar arası değişkenliğe sahip olduğunu ve optimal ortamın gerçekten hastaya özgü olduğunu kesin olarak göstermektedir. Bu nedenle, farklı eksojen parakrin sinyal ortamları sağlayan farklı ortam bileşimlerinin sistematik paralel testi esastır.
Çeşitli yumurtalık kanseri hastalarından elde edilen geniş bir organoid paneline ve bunların prospektif olarak toplanan klinik bilgilerine sahip canlı bir biyobanka oluşturmak, çok çeşitli araştırma uygulamaları için değerli bir kaynak görevi görür ve daha geniş bir hasta popülasyonu için potansiyel olarak geçerli olan heterojen klinik manzarayı yansıtır17. Uzun süreli yetiştirme ve kriyoprezervasyon, deneysel tutarlılığı ve aynı organoid çizginin zaman içinde tekrar tekrar erişilebilirliğini sağlayarak, değiştirilmemiş tümör hattı hücresel özelliklerine sahip uzunlamasına deneysel tasarımlar için temel görevi görür.
Epitel mimarisini ve polarizasyonu koruyarak, organoid çizgiler, hücre-hücre iletişimini ve parakrin sinyal yollarının aracılık ettiği bağlama bağlı hücre kaderi karar vermeyi incelemek için yeterli bir modeldir. Organoidlerin histolojik jele gömülmesi, fiksasyon sonrası malzeme kaybını önlemek için pratik ve etkili bir ara adımdır ve sonraki işlemlerin (parafine gömme ve kesit alma) doku örnekleriyle paralel olarak gerçekleştirilebilmesini sağlar. Fiksasyon prosedürü sırasında organoidlerin kaybı, organoidlerin sayısı çok sınırlı olduğunda kritik bir konudur. Bununla birlikte, bu kayıp, organoidlerin hücre dışı matristen soğuk bir bazal kültür ortamında yıkanarak ve fiksasyondan önce 24 oyuklu bir formatta en az iki tam yetişkin kuyucuğun bir araya getirilmesiyle önlenebilir. İmmünofloresan boyama protokolü, yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemenin, yumurtalık kanseri organoidlerinin moleküler ve fenotipik özelliklerine ebeveyn tümör dokusu ile karşılık gelmesine izin verir, ancak aynı zamanda kimyasal bileşiklere hücresel yanıtı veya genetiği değiştirilmiş hatların karakterizasyonunu incelemek için değerli bir araçtır. Yöntem ayrıca herhangi bir spesifik değişiklik olmaksızın histoloji boyama için de uygundur. Çalışmanın amacına bağlı olarak, mikrotom (2-3 μm) ile kesilen daha ince kesitler düşünülmelidir.
Daha da önemlisi, stabil uzun vadeli kültür, gen düzenleme deneyleri ve ilaç yanıtı ve yeni ve standart tedavilere direnç hakkında fonksiyonel testler için bir ön koşuldur17,21. Özellikle, hastalığın ilerlemesi ve nüksü sırasında yapılan yeniden biyopsilerden üretilen organoidler, tedavi görmemiş orijinal tümör ile nüks sırasında gözlenen yeni edinilmiş özellikler arasında doğrudan karşılaştırmalı analizler yapma imkanı sunar. Hastaya özgü tedavi yanıtlarının belirlenmesi ve in vitro tedavi direncinin oluşturulması, yumurtalık kanseri araştırmalarında hassas tıp alanını ilerletmektedir21.

Epitelyal over kanserli hastaların ileri evrelerde heterojen klinik prezentasyonu ve yüksek nüks oranları nedeniyle klinik yönetimi zor olmaya devam etmektedir1. Yumurtalık kanseri gelişimi ve biyolojik davranışı hakkındaki anlayışımızı geliştirmek, hastalığın seyri sırasında hastaya özgü değişkenliği, tedavi yanıtını ve histopatolojik ve moleküler özellikleri ele alan araştırma yaklaşımlarını gerektirir2.
Yumurtalık kanseri hastalarından elde edilen tümör örneklerinin klinik bilgileriyle birlikte sistematik olarak toplanması ve uzun süreli korunması ile karakterize edilen biyobankacılık, primer debulking ameliyatlarından elde edilen tümör örnekleri, neoadjuvan kemoterapi sonrası ve tekrarlayan hastalıktan elde edilen tümör örnekleri de dahil olmak üzere farklı hastalık evrelerinde geniş bir hasta kohortunun korunmasını sağlar. Umut verici prognostik biyobelirteçler ve terapötik hedefler için bir kaynak olarak hizmet veren kanser araştırmalarını ilerletmek için değerli bir potansiyele sahiptir3. Bununla birlikte, formalin fiksasyonu ve dondurma gibi geleneksel biyobankacılık yöntemleri, canlılık kaybı ve doğal üç boyutlu doku mimarisinin bozulması nedeniyle orijinal tümör örnekleri üzerinde fonksiyonel çalışmalar yapmaya uygun değildir 4,5.
Onkoloji ve ötesinde moleküler mekanizmaların incelenmesi, hastalığın biyolojisini aslına uygun olarak yansıtan ve in vivo olarak gözlemlenen dokunun in vitro özelliklerini koruyan uygun deneysel modellerin kullanımına bağlıdır. Yenilenme potansiyelinin korunmasına dayanan hasta kaynaklı organoidler, laboratuvarda epitelin orijinal yapısını ve işlevini yeniden üretir ve hastaya özgü bir bağlamda test yapılmasına izin verir. Bu nedenle, kanser araştırmaları ve kişiselleştirilmiş tıp için son derece umut verici araçlar olarak ortaya çıkmışlar ve klinik çeşitlilik ile laboratuvar araştırmaları arasındaki boşluğu doldurmuşlardır 6,7,8,9. Organoid hatların bireysel ilaç yanıtlarına ve moleküler profillerin fonksiyonel uygunluğunun test edilmesine dayanan özel terapötik stratejiler, potansiyel olarak doğrudan hasta bakımına uygulanabilir10,11. Hastaya özgü özellikler de dahil olmak üzere uzun vadeli yetiştirme olasılığı ve zaman içinde ilgili prospektif klinik verilerin toplanması, hastalığın ilerlemesi ve direnç mekanizmalarında rol oynayan yeni prognostik ve öngörücü faktörlerin tanımlanması için büyük umut vaat etmektedir 3,9.
Bununla birlikte, farklı tümör örneklerinden organoidleri içeren bir biyobanka oluşturmak, karmaşık metodolojiye sıkı sıkıya bağlı kalmanın ve kolay bakım için protokoller oluşturmanın bir kombinasyonunu gerektirir12. Proses standardizasyonu, biyobankanın yüksek ciroda bile eğitimli personel tarafından verimli bir şekilde kurulmasını ve sürdürülebilmesini sağlarken aynı zamanda en yüksek kalite standartlarına bağlı kalınmasını sağlar13. Birkaç çalışma, orijinal tümörün mutasyonel ve fenotipik profiline karşılık gelen stabil yumurtalık kanseri organoid hatlarının değişen verimlilik oranlarıyla başarılı bir şekilde oluşturulduğunu bildirmiştir. Yine de, rutin biyo bankacılık, özellikle büyük ölçekli genişleme veya başarılı genomik düzenleme için bir ön koşul olan hatların uzun vadeli istikrarlı büyümesi için pratikte zorlu olmaya devam etmektedir.
Özellikle, yavaş ve sınırlı büyüme potansiyeli gösteren organoidler zaman zaman yerleşik hatlar olarak sayıldığından, genişletilebilirlik konusu sahada belirsiz bir şekilde tanımlanmaktadır. Başlangıçta Hoffmann ve ark. tarafından gösterildiği gibi, temel bulguları bu daha da geliştirilmiş protokolün temelini oluşturan bir çalışma, yumurtalık kanseri dokusunun optimal kullanımı, heterojenliği barındırmak için benzersiz bir strateji gerektirir14. Bu yöntemle elde edilen organoidlerin fenotipik karakterizasyonu ve ebeveyn tümör dokusu ile yakın benzerliği, panel DNA dizilemesi ve olgun kültürlerin transkriptomik analizi (4-10 aylık kültivasyon) ile doğrulandı ve model 8,9,12,14'ün stabilitesini gösterdi.
Sağlıklı fallop tüplerinde homeostazı düzenleyen parakrin ortamın aksine, muhtemelen yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri (HGSOC), kanser rejenerasyon potansiyeli ve organoid oluşum kapasitesi veren epitel tabakası, eksojen Wnt takviyesine daha az bağımlıdır. Ayrıca, organoid ortamda Noggin yokluğu ile karakterize edilen aktif Kemik Morfogenetik Proteini (BMP) sinyalinin, yumurtalık kanseri katı doku birikintilerinden uzun süreli kültürlerin kurulması için faydalı olduğu kanıtlanmıştır14,15. Yumurtalık kanserinin katı birikintilerinin sistematik biyobankacılığı sırasında, bu bulguları doğruladık ve vakaların çoğunda sürekli uzun vadeli genişleme sağlayan bu protokolde özetlenen ayrıntılarla boru hattını kurduk. Birincil izolatlarla çalışırken farklı ortam bileşimlerinin ve tohumlama modalitelerinin paralel testinin, uzun vadeli kararlı organoid hatlarının kurulmasını iyileştirmek ve verimi artırmak, aşağı akış deneyleri için gerekli olan çok kuyulu formatlara sağlam yayılma ve genişleme sağlamak için gerekli olduğunu bulduk16.
Ayrıca, ameliyat sırasında toplanan örneklerin saflığı ve kalitesi, temel araştırma ve moleküler tanıda yumurtalık kanseri organoidlerinin translasyon potansiyeli için çok önemlidir. HGSOC'nin klinik sunumunun karmaşıklığı, ilgili materyalin doğru bir şekilde tanımlanmasını, taşıma koşullarının sabit tutulmasını ve organoid hatlarının yüksek verimlilikle üretilmesini sağlamak için cerrahlar, onkologlar ve laboratuvardaki bilim adamları arasında yakın işbirliği gerektirir. Bu protokol, yumurtalık kanserini karakterize eden heterojenliği göz önünde bulundurarak, yumurtalık kanseri organoidlerinin tam potansiyelini yakalamak için standartlaştırılmış ancak uyarlanabilir bir çerçeve sağlar16,17. Özellikle, bu protokol, farklı histolojik tipler (yüksek dereceli ve düşük dereceli yumurtalık kanseri, LGSOC), kök regülasyonunda farklılıklar sergileyen aynı hastalardan farklı tortular, neoadjuvan sonrası ortamda ameliyatlardan alınan dokular, biyopsi materyali ve hastalık ilerlemesinin tekrarlayan fazındaki ameliyatlardan alınan örnekler dahil olmak üzere geniş yumurtalık kanseri klinik sunumunun geniş spektrumunun güvenilir biyobankacılığını sağlar.

<table><tbody><tr><td>100 Sterican 26 G</td><td>Braun, Melsungen, Almanya</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>100 Sterican 27 G</td><td>Braun, Melsungen, Almanya</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>293T HA Rspo1-Fc</td><td>R& D sistemleri, Minneapolis, ABD</td><td>3710-001-01</td><td>Alternatif: Hücre hattını ifade eden R-Spondin1, Sigma-Aldrich, SC111</td></tr><tr><td>A-83-01 (TGF-b RI Kinaz inhibitörü IV)</td> <td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>616454</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM / F-12 Medium&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 antikoru (DO1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Texas, ABD</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX8 antikoru</td><td>Proteintech, Manchester, İngiltere&nbsp;</td><td>10336-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Şişe üstü vakum filtresi 0.2 ve mikro; m</td><td>Corning, Berlin, Almanya&nbsp;</td><td></td><td></td>430049</tr><tr><td>CELLSTAR hücre kültürü şişesi, 175 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Avusturya</td><td>661175</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR hücre kültürü şişesi, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Avusturya</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR hücre kültürü şişesi, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Avusturya</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td>Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48 kuyulu Clear TC ile tedavi edilmiş&nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Almanya&nbsp;</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SFM</td><td>PromoCell &ndash; İnsan Merkezli Bilim, Heidelberg, Almanya</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Özü, Tip 2, Pathclear</td><td>R& D sistemleri, Minneapolis, ABD</td><td>3533-005-02</td><td>Alternatif: Matrigel, Büyüme Faktörü Azaltılmış Bazal membran matrisi ve nbsp; Corning, 356231&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Eşek Anti-Fare IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAKO&nbsp; Sitrat Tamponu, pH 6.0, 10x Antijen Retriever</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti tavşan Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-Keçi IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>A32814</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&akut; s Fosfat Tamponlu Tuzlu Sağ&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel</td><td>Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>Epredia HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 kuyulu Polistiren&nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Almanya&nbsp;</td><td></td><td></td>351447</tr><tr><td>Tüy neşter&nbsp;</td><td>Pfm medikal, Köln, Almanya</td><td>200130010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Formalin% 37 asit içermez, stabilize</td><td>Morphisto, Offenbach Main, Almanya</td><td>1019205000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td></td><td></td>156630080</tr><tr><td>İnsan EpCAM/TROP-1 Antikoru</td><td>R& D sistemleri, Minneapolis, ABD</td><td>AF960</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FGF10</td><td>Peprotech, NJ, ABD</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>İnsan rekombinant BMP2</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>PHC7146</td><td></td></tr><tr><td>İnsan rekombinant EGF</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>İnsan rekombinantı Heregulin beta-1</td><td>Peprotech, NJ, ABD</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>LAS X çekirdek Yazılım</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/</td></tr> <tr><td>Leica TCS SP8 X&nbsp; Beyaz Işık Lazer Konfokal Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi (100x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Melsungen, Almanya</td><td>3570519</td><td></td></tr><tr><td>Parafin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Omnilab, Münih, Almanya</td><td>5170002</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehid&nbsp;</td><td>Morphisto, Offenbach Main, Almanya</td><td>1176201000</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td> <td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>P4333-100</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 400 & mikro; m</td><td>PluriSelect, Leipzig, Almanya</td><td>43-50400-01</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Toulouse, Fransa</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücresi Parçalama Tamponu</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Roticlear</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>A538.5</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica, Wetzlar, Almanya</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cryovials</td><td>Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>375418PK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TripLE Ekspres Enzim &nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>PanReac AppliChem, Darmstadt, Almanya</td><td>A4974-0100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Almanya</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, ABD</td><td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

yumurtalık kanseri organoidlerinin biyobankacılığı stratejisi: histolojik alt tipler ve hastalık evrelerinde hastalar arası heterojenliğin ele alınması

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Klinik arka plan bilgileriyle birlikte hasta kaynaklı organoidlerden bir yumurtalık kanseri biyobankasının kurulması, araştırma ve hasta bakımında ilerlemeler vaat ederken, organoid teknolojisinin doğal karmaşıklığı ile birlikte bu ölümcül malignitenin heterojenliği nedeniyle standardizasyon bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu uyarlanabilir protokol, progenitörlerin hastaya özgü değişkenliğini göz önünde bulundurarak yumurtalık kanseri organoidlerinin tam potansiyelini gerçekleştirmek için sistematik bir çerçeve sağlar. Optimum kültür koşullarını ve tohumlama yöntemlerini seçmek için yapılandırılmış bir deneysel iş akışı uygulayarak, 2D/3D rotaya karşı doğrudan 3D tohumlamanın paralel testini yaparak, çoğu durumda, çok çeşitli aşağı akış uygulamaları için uygun, sağlam, uzun vadeli genişleyen hatlar elde ediyoruz. 
Özellikle, protokol, yüksek dereceli ve düşük dereceli yumurtalık kanseri ve primer debulking, tekrarlayan hastalık ve neoadjuvan sonrası cerrahi örnekler ile hastalığın evreleri dahil olmak üzere çok sayıda heterojen başlangıç materyali vakasında (N = 120) test edilmiş ve etkili olduğu kanıtlanmıştır. Düşük Wnt, yüksek BMP'li ekzojen sinyal ortamında, progenitörlerin Heregulin 1 ß (HERß-1) yolunun aktivasyonuna farklı şekilde duyarlı olduklarını, HERß-1'in bazılarında organoid oluşumunu teşvik ederken diğerlerinde inhibe ettiğini gözlemledik. Hastanın örneklerinin bir alt kümesi için, optimal organoid oluşumu ve uzun süreli büyüme, ortama fibroblast büyüme faktörü 10 ve R-Spondin 1'in eklenmesini gerektirir. 
Ayrıca, doku sindirimi ve progenitör izolasyonunun kritik adımlarını vurguluyoruz ve plastik üzerinde 2D'de kısa ekilimin Bazal Membran Ekstraktı tip 2 matrisinde sonraki organoid oluşumu için faydalı olduğu örneklere işaret ediyoruz. Genel olarak, optimal biyobankacılık, bireysel hatlar için yeterli bir büyüme ortamını belirlemek için tüm ana koşulların paralel olarak sistematik olarak test edilmesini gerektirir. Protokol ayrıca, kapsamlı fenotipleme için gerekli olan organoidlerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için verimli gömme, kesitleme ve boyama için işleme prosedürünü de açıklar.

İlk doku ayrışması, filtrasyonu ve sayımından sonra, hücreler, yukarıda açıklandığı gibi, doğrudan 3D formatında paralel olarak ekilir ve ayrıca kısa 2D genişleme için şişedeki süspansiyon yapılır. Bazı durumlarda, geçici 2D genişleme organoid oluşumunu olumlu yönde etkiler ve uzun vadeli çizgi bu rota üzerinden başarılı bir şekilde kurulurken, karşılaştırmalı paralel 3D tohumlama büyümenin durmasına neden olabilir (Şekil 1). İşlenen her donör dokusu için, hücreler ortam matrisine göre test edilir. Bu stratejiyi takiben, biyobankamız artık Şekil 2'de gösterildiği gibi her bir standart büyüme koşulunu temsil eden çizgiler içermektedir. Farklı ortamları ve tohumlama modlarını test eden bu mini tarama platformunun sıkı bir şekilde uygulanmasıyla, yumurtalık kanserinin farklı histolojik tiplerinden ve hastalık gelişiminin aşamalarından (Şekil 3) primer yüksek dereceli seröz, post-neoadjuvan aralıklı ameliyatlardan ve tekrarlayan hastalıktan organoid hatlarını başarıyla oluşturduk. Ana belirteçlerin ebeveyn dokusuna kıyasla immünofloresan boyanması ile organoid hatların fenotipik karakterizasyonu, epitelyal tümör kompartmanının ayırt edici özelliklerinin organoid modelde korunduğunu ikna edici bir şekilde göstermektedir: epitel mimarisi ve adezyon (EpCAM), soy kimliği (PAX8) ve HGSOC'nin çekirdekte birikime yol açan tipik TP53 nokta mutasyonu karakteristiği (Şekil 4).
Organoid biyo-bankacılık sırasında verimli karar verme için bazı önemli metodolojik noktalar da dikkate alınmalıdır. Organoid büyüme potansiyeli sadece organoid çapındaki artışla belirlenmez. Ek olarak, fenotipik özellikler renk, koyuluk ve kontur bütünlüğü gibi genişleme potansiyellerini belirler. Sitoplazmik stres vakuollerinin oluşumu, optimal olmayan koşulları gösterir. Büyüme ve organoid oluşturma potansiyeli ile ilgili ilk sorunlar, uygun olmayan taşıma koşulları ve doku aleksiyonunun gecikmesi nedeniyle ortaya çıkabilir. Tümör hatlarında genişleme potansiyelinde yüksek bir bireyler arası değişkenlik gözlendiğinden, büyüme potansiyeli hakkında nihai bir karar vermeden önce en az 14 gün beklemenizi öneririz. Başlangıçta farklı ortamlarda benzer büyüme paternleri gözlenirse, birden fazla koşul genişletilmelidir. Deneyimlerimize göre, uzun vadeli istikrarlı büyüme potansiyelinin net bir ayrımı genellikle ancak birkaç hafta veya ay süren ekimden sonra mümkündür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig01.jpg"> Şekil 1: Sonraki organoid üretimi için birincil izolatların 2B'sinde kısa tohumlamanın faydaları. (A) İki yönlü, paralel tohumlama stratejisini gösteren deney düzeninin şeması: 2D/3D ve dört farklı ortamda doğrudan 3D tohumlama. (B) Tripsinizasyon ve 3D transferden önce yapışık primer izolatların görüntüsü. (C) Paralel tohumlamanın 2D/3D rotasının açık avantajını ortaya çıkardığı birincil çökeltinin bir örneği, çünkü uzun vadeli organoid genişlemesi yalnızca başlangıçta plastik üzerinde izole edilen progenitörlerden mümkündü. Sol üstteki resim, sol alttaki resimde ilk geçişten (P1 olarak anılır) sonra yetersiz organoid oluşumu ile 0 numaralı pasajda (P0 olarak anılır) izolasyondan 7 gün sonra bir 3D kültürü göstermektedir. Plastik üzerinde 2D tohumlamadan sonra (bkz. Şekil 1B) ve ardından bir 3D kültüre transferden sonra, P0'da daha iyi bir organoid oluşumu zaten belirgindir, uzun vadeli genişleme potansiyeli ise pasaj 4'te (P4) doğrulanır. Ölçek çubuğu = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig02.jpg"> Şekil 2: Hastaya özel ortam gereksinimi. Her biri farklı bir ortamda büyüyen dört farklı uzun vadeli istikrarlı genişletilmiş hat örneği. Ölçek çubuğu = 500 μm. Kısaltmalar: OCM = yumurtalık kanseri ortamı; o = heregulin 1β; HGSO = yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig03.jpg"> Şekil 3: Hastalığın tüm aşamalarından organoid üretimi. Primer hastalık sunumunda yüksek dereceli seröz ve düşük dereceli seröz yumurtalık kanserinden, aralıklı cerrahiden (neoadjuvan kemoterapi sonrası) ve tekrarlayan kanser dokusundan uzun süreli stabil genişleyen hatların görüntüleri. Ölçek çubuğu = 500 μm. Kısaltmalar: HGSOC = yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri; LGSOC = düşük dereceli seröz yumurtalık kanseri; NACT = neoadjuvan kemoterapi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig04.jpg"> Şekil 4: Organoidlerin fenotipinin ve ebeveyn kanser dokusunun yakın eşleşmesi. (A) kanser dokusunun ve (B) eşleştirilmiş organoid çizginin immünofloresan boyanmasının konfokal görüntüleri, EpCAM (yeşil), PAX8 (kırmızı), TP53 (macenta) olmak üzere tüm belirteçlerin boyama paterni ve ekspresyon düzeyinde çok yüksek benzerlik gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan besiyeri ve sindirim karışımının bileşimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467_Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, farklı hastalık evrelerinden yumurtalık kanseri organoidlerinin oluşturulması için sistematik bir çerçeve sunar ve verimi artırmak ve sonraki uygulamalar için sağlam uzun vadeli genişleme sağlamak için hastaya özgü değişkenliğin zorluklarını ele alır. Doku işleme, tohumlama, ortam gereksinimlerini ayarlama ve immünofloresan boyama için ayrıntılı adımlar içerir.

Yumurtalık Kanseri Organoidlerinin Biyobankacılığı Stratejisi: Histolojik Alt Tipler ve Hastalık Evrelerinde Hastalar Arası Heterojenliğin Ele Alınması

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...

İlerlemiş yumurtalık kanseri olan hastalar için en son translasyonel araştırmalarda en iyi klinik yönetim kurumumuzda en yüksek önceliğe sahiptir. Hasta kaynaklı organoidlerin biyo-bankacılığı ile kişiye özel yönetime doğru büyük ilerleme kaydettik. Bu, hastaya özgü özellikleri değerlendirmemizi ve öngörücü biyobelirteçleri tanımlamamızı sağlar.Son yıllarda ileri evre over kanserli hastalarda radikal multiviseral cerrahi, kemoterapi, anti-anjiyojenik tedavi ve ayrıca PARP inhibitörü tedavisinin iyileştirilmesinde önemli ilerlemeler kaydettik ve bununla bile sağkalım oranlarını iyileştirdik. Şimdi, bir sonraki büyük adım, hangi hastanın hangi spesifik tedaviden fayda göreceğini daha iyi tahmin etmek olacaktır. Günümüzde klinik tedavi kararları, genel histopatolojik özelliklere ve homolog öneri eksikliği hakkındaki bilgilere dayanmaktadır veya parafine gömülü tümör dokusunda test edilmektedir.Kemoterapiye ve hedefe yönelik tedavilere spesifik yanıtları değerlendiren biyolojik modeller henüz klinik rutinde uygulanmamıştır. Yumurtalık kanseri dokusunun temel özelliklerini, özellikle in vitro olarak yenilenme potansiyelini sürdürmek için gerekli kültür gereksinimlerini belirledik ve bu bilgiyi, organoid hatlarının uzun vadeli sağlam büyümesini sağlamak ve hastalığın çeşitli aşamalarındaki örneklerden biyobanka oluşturmak için kullandık. Yumurtalık kanseri organoidlerinin biyobankacılığındaki günlük deneyimimiz, bu malignitenin biyolojisinde dikkate değer bir heterojenlik olduğunu etkili bir şekilde göstermektedir, bu da yeni sınıflandırmaya yol açabilir veya STEMI'nin potansiyelini hedefleyen yeni terapötik çözümlerin temelini oluşturabilir.

strategy-for-biobanking-ovarian-cancer-organoids-addressing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), translasyonel kanser araştırmalarında, hastalığın hem genetik hem de fenotipik heterojenliğini ve kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavilerine yanıtı yansıtan güçlü bir araçtır. Burada, fenotipik analizlerin ve ilaç yanıtlarının değerlendirilmesine hazırlık olarak insan primer mesane kanseri PDO'ları üretmek için konsolide bir protokol detaylandırılmıştır.

Hassas Tıp Araçları Olarak Mesane Kanseri Organoidleri Kültürü

Biyobankalar biyomedikal araştırmalar için çok önemli kaynaklardır ve Avrupa Onkoloji Enstitüsü'ndeki Translasyonel ve Dijital Tıp Birimi için Biyobanka bu alanda bir modeldir. Burada, biyobankaların farklı insan biyolojik numunelerinin yönetimi için standart çalışma prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.

Translasyonel Tıp için Biyobanka: Optimal Numune Yönetimi için Standart Çalışma Prosedürleri

Hasta kaynaklı organoidler (PDO), tümör ortamını in vitro olarak taklit edebilen üç boyutlu (3D) bir kültürdür. Yüksek dereceli seröz over kanserinde, PDO'lar yeni biyobelirteçleri ve terapötikleri incelemek için bir model oluşturur.

Yüksek Dereceli Seröz Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoidlerin Üretimi ve Kültürlenmesi

Bu protokol, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde DNA hasarı onarım proteinlerini değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Burada kapsamlı kaplama ve boyama yöntemlerinin yanı sıra ayrıntılı, objektif niceleme prosedürleri de bulunmaktadır.

İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Burada, hasta kaynaklı meme tümörü rezeksiyonlarından veya normal meme dokusundan insan meme organoidlerinin oluşturulması için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Protokol, insan hasta kaynaklı meme organoidlerinin kültürlenmesi, dondurulması ve çözülmesi için kapsamlı adım adım talimatlar sağlar.

Hasta kaynaklı meme organoidlerinin kurulması ve kültürü

Hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri ile terapötik ilaç testi yapmak için kullanılabilecek bir protokol sunuyoruz.

Klinik Öncesi İlaç Testi için Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoid Modeller

Tümör organoidleri, kanser araştırmalarında ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımında devrim yarattı. Araştırmacıların klinikte tümörden bir adım önde olmalarını sağlayan klinik olarak ilgili bir tümör modelini temsil ederler. Bu protokol, taze pankreas tümör dokusu örneklerinden ve pankreas adenokarsinomu kökenli hasta kaynaklı ksenogreftlerden tümör organoidlerini oluşturur.

Taze dokudan pankreas kanseri kaynaklı tümör organoidlerinin ve fibroblastların oluşturulması

Bu protokol, radikal prostatektomi örneklerinden örneklerin toplanmasını kolaylaştırmak için bir yöntemi tanımlar. Amaç, örneklerden alınan doku örneklerini bir Biyobankada saklamadan önce anatomopatolojik kriterlere dayalı olarak haritalamak, karakterize etmek ve mikro-makro diseksiyon yapmaktır.

Geliştirilmiş Örnekleme Tekniği ve Histolojik Karakterizasyon ile Prostat Tümörü Biyobankacılık Güvenilirliğinin Artırılması

Bu protokol, birincil insan yumurtalık yüzey epitel (hOSE) hücrelerinden üç boyutlu (3D) doku organoidlerinin oluşturulmasını açıklar. Protokol, yeni toplanan yumurtalıklardan hOSE'nin izolasyonunu, hOSE'nin hücresel genişlemesini, kriyoprezervasyon-çözme prosedürlerini ve organoid türevini içerir. İmmünofloresan, kantitatif analiz ve bir tarama platformu olarak sergileme yardımcı programı dahildir.

Doku Rejenerasyonunu İncelemek İçin Bir Platform Olarak İnsan Yumurtalık Yüzeyi Epitel Organoidleri

Bu protokol, in vitro ve in vivo olarak yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomu (HGSOC) fare modellerinin geliştirilmesini detaylandırır. Murin fallop tüpü organoidlerinin türetilmesinden, insan HGSOC genetiğini özetlemek için genetik modifikasyonlarından ve in vivo tümörlerin gelişimi için sinjeneik farelerin yumurtalık bursasına sokulmasından.

Yüksek Dereceli Seröz Over Karsinomu Modellemesi için Fallop Tüpü Epitel Hücrelerinden Fare Kaynaklı Organoid Hatların Geliştirilmesi

Keşfedin, yumurtalık kanseri organoidlerinin biyobankacılığı için güvenilir bir yöntem. Hasta özgü değişkenliği ele alarak uzun vadeli genişleme ve kişiselleştirilmiş tedavi potansiyelini artırın.

Yumurtalık Kanseri Organoidlerinin Biyobankacılığı Stratejisi: Histolojik Alt Tipler ve Hastalık Evrelerinde Hastalar Arası Heterojenliğin Ele Alınması (Video) | JoVE Journal

Yumurtalık Kanseri Organoidlerinin Biyobankacılığı Stratejisi: Histolojik Alt Tipler ve Hastalık Evrelerinde Hastalar Arası Heterojenliğin Ele Alınması

Daha fazla video keşfet