Name: Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Keşfedin, seri iki foton tomografi kullanarak Salmonella'nın dalakta antibiyotik tedavisi sırasında nasıl sürdüğünü. Bu yöntem, bakteri ve bağışıklık hücreleri arasındaki uzamsal ilişkileri analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı 310030_156818, 310030_182315 ve NCCR_ 180541 AntiResist (DB'ye) tarafından desteklenmiştir.

Floresan Reporter miktar tayini ile tüm organ patojen takibi

<ol><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+understanding+the+infectious+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The importance of understanding the infectious microenvironment.</a> Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).</li>
<li>Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+infection+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of infection revisited.</a> Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).</li>
<li>Bumann, D., Cunrath, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Salmonella-host+interactions+in+infected+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues.</a> Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).</li>
<li>Hofmann, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+-+putting+immune+cells+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context.</a> J Cell Sci. 134 (15), jcs258494(2021).</li>
<li>Blain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tridimensional+atlas+of+the+developing+human+head%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tridimensional atlas of the developing human head.</a> Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+maps+reveal+stereotyped+cell-type-based+cortical+architecture+and+subcortical+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism.</a> Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).</li>
<li>Matho, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+glutamatergic+neuron+system+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex.</a> Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).</li>
<li>Muñoz-Castañeda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+anatomy+of+the+mouse+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+compartmentalization+enables+Salmonella+persistence+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118(2021).</li>
<li>Dogga, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aspartyl+protease+5+in+the+establishment+of+the+intracellular+niche+during+acute+and+chronic+infection+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).</li>
<li>Claudi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Salmonella+in+host+tissues+delays+eradication+by+antimicrobial+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy.</a> Cell. 158 (4), 722-733 (2014).</li>
<li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein%3A+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6, 13(2008).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Burton, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparate+impact+of+oxidative+host+defenses+determines+the+fate+of+Salmonella+during+systemic+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host%26Microbe%22%5BJournal%5D)">Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice.</a> Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+connections+of+the+main+and+the+accessory+olfactory+bulb+formations+in+the+rat%3A+an+experimental+HRP-study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study.</a> J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Wendland, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+GFP+levels+for+analyzing+Salmonella+gene+expression+during+an+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection.</a> FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).</li>
<li>Barat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+intracellular+Salmonella+depends+on+surface-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens.</a> PLoS Pathog. 8 (10), e1002966(2012).</li>
<li>Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+selection+based+on+expression+levels+during+infection+facilitates+vaccine+development+for+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).</li>
<li>Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27UTR+sequences+influence+protein+levels+in+Escherichia+coli+by+regulating+translation+initiation+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability.</a> Front Microbiol. 13, 1088941(2022).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Salmonella+gene+expression+in+an+infected+mammalian+host+using+the+green+fluorescent+protein+and+two-colour+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry.</a> Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).</li>
<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bakteriyel patojenlerin lokal doku bağlamı, lokal konak saldırılarını, bakteriyel adaptasyonları, konak patojen etkileşimlerinin ve antimikrobiyal kemoterapinin lokal sonuçlarını ve genel hastalık sonucuna bireysel katkıları belirlemek için çok önemlidir. Santimetre boyutundaki organlarda mikrometre boyutundaki bakterilerin görüntülenmesi zor olmuştur. Seri iki fotonlu (STP) tomografi, tüm organlardaki tek tek bakteri hücrelerini tespit etmek için yeterli uzamsal çözünürlük, otomatik kesit alma ve görüntüleme ve yeterli verim (günde ~ 1 organ) sağlar11. Konak antijenleri in vivo olarak boyanabilirken, patojen hücreler, hücre içi patojen hücrelerinin kapsamlı tespitini sağlamak için uygun floresan proteinleri eksprese etmelidir. Ortaya çıkan veri kümeleri (organ başına 0,5-1,5 TeraBayt), veri analizi ve depolaması için BT altyapıları için önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır.
Bu yöntemde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, floresan protein GFP veya YFP'nin saptanabilir ve homojen ekspresyonuna sahip bir patojen suşu gereklidir. İdeal olarak, plazmit kopya sayısı varyasyonuna bağlı floresan heterojenliğini en aza indirmek için bir kromozomal ekspresyon kaseti25 kullanılır. Yeterli floresan yoğunluğu gereklidir, ancak patojenin23 uygunluk bozukluklarını önlemek için aşırı floresan protein seviyelerinden kaçınılmalıdır. Uygun ekspresyon seviyeleri, uygun bir promotörün seçilmesi ve ribozomal bağlanma bölgesinin25 veya tüm 5' çevrilmemiş bölgenin (UTR)26 ince ayarıyla elde edilebilir. İkinci olarak, perfüzyon fiksasyonu, kan dolaşımından mümkün olduğunca çok eritrositi uzaklaştırmak için tampon ile bir ilk yıkamayı içermelidir. Bu özellikle dalak ve karaciğer için kritiktir (bu organlardan eritrositin tamamen çıkarılması zor olsa da). Kalan eritrositler, spektrumun görünür kısmındaki ışığı emerek görüntüleme kalitesini tehlikeye atar27. Üçüncüsü, sabit dokuların kriyoprotektan içinde depolanması, özellikle iltihaplı dokularda yüksek olan ve patojen hücrelerin nispeten zayıf floresansını gölgede bırakabilen doku otofloresansını azaltmak için kritik öneme sahiptir11. Dördüncüsü, dokunun çevredeki agaroz bloğuna etkili bir şekilde çapraz bağlanması, doku agaroz bloğundan dışarı atlamadan düzgün vibratom kesimi için kritik öneme sahiptir. Beşincisi, floresan sinyaller ve bunların patojen hücreler olarak tanımlanması, patojen bileşenlerine karşı antikorlarla boyama (Gram-negatif bakteriler için lipopolisakkarit gibi) ve tomografi11'den alınan kesitlerin konfokal mikroskobu gibi ortogonal yaklaşımlar kullanılarak bağımsız olarak doğrulanmalıdır. Bazı enfekte dokular, patojen hücreler olarak kolayca yanlış yorumlanabilen benzer şekle ve örtüşen floresan spektrumlarına sahip oto-floresan parçacıklar içerir. Altıncısı, mikrokolonilerdeki patojen hücrelerin miktarı, doğruluğu değerlendirmek için konfokal mikroskopi gibi ortogonal yaklaşımlarla karşılaştırılmalıdır. Bu hesaplamalara dayanan genel bakteri yükleri, akış sitometrisi ve kaplama gibi ortogonal yaklaşımlarla karşılaştırılarak doğrulanmalıdır.
Yaygın olarak kullanılan STP protokolünün önemli modifikasyonları arasında, enfekte ve iltihaplı karaciğer, dalak ve Peyer yamalarında özellikle güçlü olan yeşil-sarı otofloresan girişimini azaltmak için fotoçoğaltıcı 211'in önüne 510/20 nm'lik dar bir bant geçiren filtre yerleştirilmesi yer alır. Bu tür organların beyne kıyasla (STP'nin diğer uygulamalarına hakim olan) güçlü otofloresan ve artan ışık saçılımı da düzensiz aydınlatma için daha etkili bir düzeltme ihtiyacı yaratır. Başka bir değişiklik olarak, bu protokol bu amaç için CIDRE yaklaşımı22'yi (Şekil 3) ve bakterilerin yapay zeka tabanlı segmentasyonunu kullanır. Son olarak, doku ön işlemesi, doku otofloresansını azaltan ve böylece nispeten zayıf floresan11 ile küçük patojen hücrelerinin saptanmasını kolaylaştıran -20 ° C'de kriyoprotektan içinde bir inkübasyon aşaması dahil edilerek değiştirildi.
Hiçbir patojen sinyali tespit edilemezse veya segmentasyon yetersiz hassasiyet (çok fazla patojen hücresi kaçırılır) veya yetersiz hassasiyet (çok fazla arka plan partikülü patojen hücresi olarak segmentlere ayrılır) verirse sorun giderme gerekli olabilir. Arka plan dokusu otofloresansı tespit edilebiliyorsa ancak çok az patojen sinyali varsa, patojenler yetersiz miktarda floresan proteini içerebilir. Bu, aynı enfekte dokudan alınan doku kesitlerinin konfokal mikroskobu veya doku homojenatlarının akış sitometrisi kullanılarak test edilebilir19,28. Altta yatan nedenler yetersiz ifade seviyeleri veya ifade kasetinin kararsızlığı olabilir. Azaltma stratejileri, ekspresyonu yönlendirmek için alternatif promotörleri, patojen türleri için floresan proteini kodlayan genlerin kodon adaptasyonunu, daha yüksek kopya sayısına sahip epizomal yapıların kullanılmasını veya kromozomal entegrasyon veya dengeli-ölümcül tamamlama ile ekspresyon kasetlerinin stabilizasyonunu içerebilir29. Floresan protein seçimi de önemlidir, ancak GFP.mut2, mWasabi, YPet ve TIMERbac ile tespit mümkündür. Segmentasyon yanlışsa, bunun nedeni yukarıda açıklandığı gibi ele alınabilecek çok zayıf patojen floresansı veya çok yüksek doku otofloresan arka planı olabilir. Agaroz bloğuna ve tomografiye gömülmeden hemen önce geniş kapsamlı yıkama solüsyonu perfüzyonu veya depolama tamponunda uzun süreli inkübasyon bu sorunları çözebilir. Son olarak, hassas sınıflandırma için sinir ağının yeterli eğitimi gereklidir, ancak aşırı eğitim, yeni örnekler için performansı bozan aşırı öğrenmeye yol açabilir.
Şu anda, başka hiçbir yöntem, tek tek bakterileri tespit etmek için tüm organları 3D olarak yeterli uzamsal çözünürlükte görüntüleyemez. Doku temizleme ve ışık tabakası mikroskobundaki gelecekteki gelişmeler benzer bir çözünürlük elde edebilir. Bu, daha yüksek hızda ve daha fazla floresan kanalıyla görüntülemeyi mümkün kılabilir.
STP'nin önemli bir sınırlaması, ~ 0.5 μm'lik düzlem içi piksel çözünürlüğü ve 5 ila 10 μm'lik dikey çözünürlüktür, bu da örneğin yoğun bir şekilde paketlenmiş bir mikrokoloni içinde yakın yerleşimli bakterileri çözmek için yetersizdir. Bununla birlikte, seçilen doku parçalarının sekonder yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskobu için tomografi sonrası doku kesitleri almak mümkündür. STP'nin bir başka sınırlaması, aynı anda görüntülenebilen florofor sayısını kısıtlayan yalnızca üç floresan kanalının bulunmasıdır. Yine alınan doku kesitlerinin çoğullama yöntemleri ile sekonder analizi, seçilen doku parçaları için çok daha fazla markörün yerini ve yoğunluğunu ortaya koyabilmektedir. Bu bilgi, STP ile belirlendiği gibi çevredeki dokunun genel 3D yapısına entegre edilebilir.
Sonuç olarak, bu protokol konak-patojen etkileşimlerinin lokal ve tüm organ düzeyinde ayrıntılı olarak araştırılmasını sağlar. Protokol, diğer patojenlere (floresan suşlar olarak elde edilebilmeleri şartıyla), diğer organlara ve farklı konakçı türlere kolayca uyarlanabilir olmalıdır.

Enfeksiyonlar, karmaşık anatomiye ve bölümlere ayrılmış fizyolojiye sahip dokularda meydana gelir. Enfekte dokuda bir arada bulunan çeşitli mikro ortamlar, yerel patojen alt kümelerinin kaderini ve bunların genel hastalık sonucuna katkılarını belirleyebilir 1,2,3. Bununla birlikte, cm boyutundaki dokulardaki mikrobiyal patojenlerin kapsamlı 3D haritalaması zorlu olmaya devam etmektedir4. Beynin ve diğer organların görüntülenmesi, sürekli gelişen deneysel stratejilere sahip oldukça aktif bir araştırma alanıdır5, ancak birçok yöntem hala μm boyutundaki bakteriyel patojenleri güvenle tanımlamak için gerekli olan μm altı çözünürlükten yoksundur. Buna karşılık, seri iki foton (STP) tomografi6, tüm dokuların μm altı düzlem içi çözünürlükle otomatik çok renkli, deformasyonsuz görüntülemesini sağlayarak tam hacimsel veri kümeleri verir. Bu yöntem, bir vibratom kullanılarak dokunun tekrarlanan fiziksel kesitini, ortaya çıkan blok yüzlerinin kızılötesi ışıkla aralıklı iki fotonlu görüntülemesi ile birleştirir. STP tomografisi, bağlantı haritaları oluşturmak için beyindeki ince aksonları haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır 7,8,9,10.
STP tomografisi ayrıca bir tomografi kullanarak tüm enfekte dokulardaki11,12 bireysel mikrobiyal patojen hücrelerinin (Salmonella, Toxoplasma) 3D haritalanmasını sağlar. İkinci harmonik jenerasyon, arterlerin etrafında ve dalak trabekülleri gibi fibröz bantlarda kollajen kılıfları ortaya çıkarır ve böylece anatomik bağlam sağlar. İn vivo enjekte edilen floresan antikorlar, tek tek patojen hücreleri ile nötrofiller gibi sızan bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri ortaya çıkarmak için konakçı hücreleri boyamak için kullanılabilir. Burada, dokunun işlenmesini, görüntülenmesini, aydınlatma düzeltmesi ile görüntüleme karolarının dikilmesini, görüntülerin üç boyutlu olarak istiflenmesini ve makine öğrenimi araçlarını kullanarak segmentasyonu içeren boru hattı açıklanmaktadır. Bu boru hattı, konakçı bağlamları içinde tek tek patojenlerin, hücrelerin ve mikro kolonilerin 3B konumlarını verir. Mikrokoloniler içindeki tek tek hücrelerin sayısını saymak, çözünürlük sınırları nedeniyle zor olmaya devam etmektedir, ancak bu sayılar, mikrokoloninin entegre parlaklığına dayalı olarak tahmin edilebilir. Rekombinant GFP veya YFP eksprese eden patojenler mevcutsa, boru hattı diğer enfeksiyon modellerine kolayca uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Kimyasallar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agaroz Düşük Eriyik</td><td>Roth</td><td>Art. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Anında yapıştırıcı Loctite 435</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilen glikol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum borhidrit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71321-25g</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum periodat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum tetraborat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris-tamponlu salin (TBS)</td> <td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Vakum filtrasyon 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI Lazer</td><td>Spektrumları-Fizik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik kalıbı soyun</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000 tomografi</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Antikor / boyalar < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr> < <tr><td>güçlü > Birincil antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-LPS Salmonella, tavşan</td><td>Sifin</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169-PE, klon 3D6.112</td><td>Biolegend & nbsp;</td><td></td><td></td>142403</tr><tr><td>anti-Ly-6G-PE, klon 1A8</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > ikincil antikorlar< / güçlü ></td> <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tavuk anti-tavşan Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Yazılım </td><td>Şirket</td><td>Sürümü</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g veya üstü</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b veya üstü</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrator (tomografi)</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görselleştirme yazılımı Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 veya üstü</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Enfeksiyonların çoğu, karmaşık anatomiye ve lokal olarak değişen konak fizyolojisine sahip üç boyutlu konak dokularında gerçekleşir. Patojen hücrelerin bu farklı ortamdaki konumu, stres seviyelerini, tepkilerini, kaderlerini ve hastalığın genel ilerlemesine ve tedavi başarısızlığına katkılarını önemli ölçüde etkiler. Bununla birlikte, μm boyutundaki patojen hücrelerin cm boyutundaki konakçı organlar içinde bulunmasındaki teknik zorluklar nedeniyle, bu araştırma alanı nispeten keşfedilmemiştir. Burada, bu zorluğun üstesinden gelmek için bir yöntem sunuyoruz. Enfekte farelerin tüm dalak, karaciğer lobları ve tüm lenf düğümleri boyunca tek tek Salmonella hücrelerini bulmak için seri iki fotonlu tomografi ve yapay zeka ile geliştirilmiş görüntü analizi kullanıyoruz. Floresan raportörler ve in vivo antikor uygulaması kullanılarak, tek Salmonella hücrelerinin replikasyon hızı, spesifik bağışıklık hücreleri ile lokal etkileşimleri ve antibiyotiklere bakteriyel yanıtlar belirlenebilir. Bu metodolojiler, üç boyutlu doku bağlamında enfeksiyonların kapsamlı bir şekilde incelenmesi, önlenmesi ve tedavisi için yollar açar.

Açıklanan prosedür, dalak, karaciğer, mezenterik lenf düğümleri ve Peyer yamaları11 gibi tüm fare organlarında bireysel Salmonella hücrelerinin tespit edilmesini sağlar (Şekil 5 ve Şekil 6). Ayrıca fare beynindeki Toxoplasma gondii parazitlerini de tespit eder12. Karaciğer, Peyer yamaları ve dalak dahil olmak üzere bazı enfekte dokular yeşil-sarı aralıkta önemli miktarda otofloresan yayar. Otofloresan, doku yapısını korumak için gerekli olan paraformaldehit ile fiksasyon ile daha da arttırılır. Bu otofloresan arka plana karşı GFP, mWasabi ve TIMERbac'ın yeşil bileşeninden yeşil floresansın algılanması, fotoçoğaltıcı 2'nin (yeşil emisyonları toplayan) önüne 510/20 nm'lik dar bir bant geçiren filtre (çoğu GFP emisyonunu iletir ancak otofloresan spektrumunun büyük bir bölümünü bloke eder) ve sabit dokuları kriyoprotektan11'de 3 veya daha fazla gün depolayarak doku otofloresansını azaltarak iyileştirilir. Bununla birlikte, bakteriler yine de GFP veya diğer floresan proteinlerin hücre başına en az birkaç bin kopyasını ifade etmelidir. Öte yandan, zayıflatılmış virülansa yol açabilecek fitness maliyetlerini en aza indirmek için aşırı floresan protein seviyelerinden kaçınılmalıdır23.
Dokulardaki floresan bakterilerin doğru segmentasyonu, görüntüleme sonrası elde edilen doku kesitlerinin immünohistokimyası ile doğrulanabilir. Spesifik olarak, lipopolisakkarit gibi bakteriyel yüzey bileşenlerine karşı bir antikorla boyanan nesneler, STP tomografisi ile elde edilen floresan görüntüsü ile hizalanabilir (Şekil 5). Bazı lekeli Salmonella hücrelerinin floresan proteinlerden yoksun olduğunu ve bu nedenle hem konfokal mikroskopide hem de STP tomografisinde saptanabilir floresan olduğunu not etmek önemlidir. Bu hücreler, tek sıralanmış hücrelerden akış sitometrik sıralama ve büyüme kültürlerinin yanı sıra agar plakalarındaki koloni oluşturan birimlerin sayısı ile akış sitometrisi24 ile belirlenen floresan Salmonella hücrelerinin sayısı arasındaki yakın korelasyon ile gösterildiği gibi, konakçı bağışıklık sistemi tarafından öldürülen Salmonella'dır. Ek olarak, plazmit kaybı, floresan olmayan canlı hücrelere neden olabilir ve bunun, plazmit üzerindeki seçim markörüne karşılık gelen uygun antibiyotikli ve uygun antibiyotikler olmadan ortam üzerine kaplanarak test edilmesi gerekir. pSC101'den türetilen plazmitler için in vivo plazmit kaybı nadirdir19. 11'de kullanılan sifB::gfp gibi kromozomal olarak entegre ekspresyon kasetlerinin çoğu için, ekspresyon kaybı in vivo olarak tespit edilemez. Segmentasyon immünohistokimya verileriyle tutarsızsa, segmentasyon hattının değiştirilmesi gerekir.
STP tomografinin çözünürlüğü, yoğun paketlenmiş mikrokoloniler içindeki tek tek bakteri hücrelerini çözmek için yetersizdir. Bununla birlikte, mikrokoloninin toplam floresan yoğunluğu, Salmonella hücrelerinin sayısının tahmin edilmesini sağlar. Bu, Salmonella sifB::gfp11 gibi oldukça homojen floresan seviyelerine sahip bir floresan suşu gerektirir. Tüm mikrokoloniler ve tek hücreler için tahmini Salmonella hücre sayısını birleştirmek, doku homojenatlarının kaplanması veya akış sitometrisi gibi alternatif yöntemlerle tutarlı olan toplam bakteri doku yüklerini verir11. STP tomografi için perfüzyonla fikse edilmesi gerektiğinden plak ve akım sitometrisi doğrudan aynı dokulardan yapılamaz. Bunun yerine, sabit olmayan ek hayvanlarla yapılması gerekir. Çeşitli yaklaşımlarla belirlenen medyan bakteri yükleri 3 kattan fazla farklılık gösteriyorsa, floresan bakterilerin canlılığı tehlikeye girebilir (daha düşük koloni oluşturan birimler durumunda) veya bazı bakteriler floresan raportör yapısını kaybetmiş olabilir (daha yüksek koloni oluşturan birimler durumunda). Bu tür tutarsızlıkların kaynağını belirlemek için kontrol deneyi gerekecektir.
STP tomografi, enfekte dokuların 3 boyutlu yapısı içinde bakteri hücrelerinin lokalizasyonunu sağlar. Kollajenin ikinci harmonik sinyalleri, arterler ve trabeküller gibi anatomik işaretler sağlar. Ek olarak, konak hücreler, perfüzyondan önce yüzey belirteçlerine bir antikor enjekte edilerek in vivo olarak boyanabilir (Şekil 5 ve Şekil 6). Bu boyama, doku bölmeleri ve iltihap odakları dahil olmak üzere belirli mikro ortamlar için ek işaretler sağlar (hücre içi belirteçler ve dalak beyaz pulpa veya beyin gibi difüzyon bariyerlerine sahip bazı bölmelere kolayca erişilemez, bunun için uygun in vivo boyama). Bu yaklaşım, antimikrobiyal kemoterapi sırasında Salmonella'nın uzun süreli sağkalımını sağlayan bir doku kompartmanı olarak splenik beyaz pulpayı ortaya çıkardı11.
Son olarak, orta veya yavaş oranlarda çoğalan Salmonella, replikasyon hızı11,15 için tek hücreli bir raportör olan timerbac'ı eksprese eden suşlar kullanılarak dokuların 3D yapısı içinde tanımlanabilir ve lokalize edilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> Şekil 1: Seri iki foton (STP) tomografi kullanılarak tüm organ görüntüleme prosedürü. (A-B) Organ, transkardiyal perfüzyondan sonra toplanır ve gece boyunca 4 °C'de% 4 paraformaldehit (PFA) içinde saklanır. (C-E) Organ oksitlenmiş agaroz içine gömülür ve çapraz bağlanır, daha sonra doku taranır ve STP tomografisi kullanılarak dilimlenir. Dilimler daha sonraki immünohistokimya için toplanır. (F-J) Bakteri sayılarının ölçülmesi, floresan bakterilerin doğrulanması ve bakteri konumlarının 3D rekonstrüksiyonu için hesaplamalı analiz boru hatları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> Şekil 2: Seri iki foton (STP) tomografi kurulumu. (A) (B) 2 fotonlu görüntüleme ile (C) otomatik seri doku kesitini içeren tomografi. (D) Takip araştırmaları için toplanan doku dilimleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> Şekil 3: Fayans dikişi ve aydınlatma düzeltmesi. Fayanslar dikilir ve düzensiz aydınlatma, düzenli enerji minimizasyonu (CIDRE) kullanılarak düzeltilmiş yoğunluk dağılımları kullanılarak düzeltilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> Şekil 4: Bir Destek Vektör Makinesi (SVM) ve bir Evrişimli Sinir Ağı (CNN) kullanarak yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden Salmonella'nın segmentasyonu. (A) SVM tarafından bölümlere ayrılmış GFP nesnelerinin temsili görüntüleri (solda) ve SVM tarafından bölümlere ayrılmış bölgelere sahip karşılık gelen görüntüler (sağda) (Ölçek çubuğu: 10 μm). (B) Segmentlere ayrılmış bölgeler için kümelenmiş kırmızı-yeşil-mavi (RGB) değerler dağılımı. (C) SVM tarafından yanlış bir şekilde bakteri olarak tanımlanan GFP olmayan nesnelerin temsili görüntüleri (solda). CNN bunları doğru bir şekilde arka plan olarak reddeder (sağda, ölçek çubuğu: 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> Şekil 5: Yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden Salmonella'nın tomografi ile tespiti ve immünohistokimya ile doğrulanması. Salmonella lipopolisakkarit (sağda) antikoru ile boyandıktan sonra tomografi (solda) veya konfokal mikroskopi ile elde edilen aynı bölümün görüntüleri. Nötrofiller (kırmızı), perfüzyondan önce PE etiketli bir anti-Ly-6G antikorunun in vivo enjeksiyonu ile boyandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> Şekil 6: Enfekte fare dalağında Salmonella'nın 3D rekonstrüksiyonu ve lokalizasyonu. (A) 5 mm kalınlığında bir dalak diliminin üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu ve anti-CD169 antikoru (kırmızı) ile perfüzyondan önce in vivo boyanması. Mavi sinyal, ikinci harmonikler tarafından tespit edilen kolajeni temsil eder. (B) (A)'da gösterilen 3B yığının bir optik düzlemi. Salmonella hücrelerinin veya mikro kolonilerin konumları yıldızlarla gösterilir. (C) Enfekte karaciğerdeki Salmonella pozisyonlarının (yıldızların) 3D rekonstrüksiyonu. Arterler, kollajen kılıflarına (mavi) göre görülebilir. Ölçek çubuğu: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, enfeksiyon sırasında patojenik bakterilerin organ çapında tespit edilmesini ve floresan raportör aktivitelerinin miktarını belirlemeyi sağlayan bir prosedürü açıklıyoruz.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Bakteri enfeksiyonları insan sağlığı için büyük bir tehdittir. Antimikrobiyal direnç artmaktadır ve bazı ana patojenler için aşılar hala eksiktir. Kontrol stratejileri için yeni yollar belirlemek için, patojenlerin konakçı bağışıklık sistemine ve enfekte olmuş dokularda in vivo antibiyotiklere nasıl tepki verdiği hakkında daha fazla bilgi sahibi olmamız gerekir.Hayatta kalan bakteriler, antimikrobiyaller bir enfeksiyonu ortadan kaldıramazsa nükslere neden olabilir. Seri tomografi kullanarak, salmonellaya neden olan tifo ateşinin dalağın belirli bir bölümünde tedavi sırasında devam edebileceğini gösterdik. Enflamasyon bu bölgede zayıftır, bu da etkili temizleme için antibiyotikler ve inflamasyon arasındaki kritik sinerjiyi bozar.Bakteriler mikrometre büyüklüğünde nesnelerdir. Bu kadar küçük nesneleri doku bağlamlarında lokalize etmek zordur. Seri iki foton tomografisi, santimetre büyüklüğündeki organlarda tek bir bakteriyi tespit edebilir ve replikasyon hızını belirleyebilir.Ayrıca nötrofiller gibi bağışıklık hücrelerini tespit edebilir ve bakterilerle mekansal ilişkilerini belirleyebiliriz. Bakteriyostatik antibiyotiklerin aktivitelerini inceliyoruz. Bu antibiyotikler enfeksiyonları tedavi edebilir, ancak patojeni öldürmeden sadece bakteri üremesini engelleyebilirler.Ayrıca, belirli virülans faktörlerinden yoksun bakteriyel mutantların yayılmasını ve bağışıklık kusurlarının enfeksiyon ve tedavi üzerindeki etkisini de belirleriz.

high-resolution-three-dimensional-whole-organ-tomography-microbial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Lensfree optik tomografi &lt;1 um arasındaki konumsal bir çözünürlüğe sahip bir üç-boyutlu mikroskopi tekniktir x &lt;1 um x 15-100 mm arasında geniş bir görüntüleme-hacmi içinde, sırasıyla, x, y ve z, boyutları, içinde &lt;3...

Çok açılı Aydınlatma ve Pixel Super çözünürlüklü istihdam Lensfree On-chip Tomografik Mikroskopi

Staphylococcus aureus bir biyolojik olarak ışık veren mühendislik suşu kullanılarak, ortopedik protez enfeksiyonun bir fare modelinde, optik ve uCT görüntüleme birlikte, invaziv olmayan uzunlamasına ve bakteriyel enfeksiyonun dinamikleri, hem de karşılık gelen enflamatuar yanıtı ve anatomik değişiklikleri izlemek için bir kapasite sağlamadığı Kemik.

Kombine<em&gt; In vivo</em&gt; Optik ve uCT Görüntüleme Farelerde bir Ortopedik İmplant Enfeksiyon Enfeksiyon, Enflamasyon ve Kemik Anatomisi Monitör

Biz protokolleri geliştirilen ve milimetre-ölçek örnekleri katıştırma etkinleştirmek için özel bir aparat tasarlanmış. Biz örnek hazırlama yordamları akrilik reçine ve katı immobilizasyon ve uzun süreli depolama örneklerin doku mimarisi ve hücre morfolojisi sorgulama için mikro-CT tarafından elde etmek için boru polimid gömme bir vurgu ile...

Katı, sabit ve lekeli, genel olarak, milimetre ölçekli örnekler için bölüm ücretsiz 3D Histoloji mikro bilgisayarlı tomografi tarafından katıştırma

Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve monte edilebildiğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini açıklar.

Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Burada, kriyo yumuşak X-ışını tomografisinde (SXT) kriyo-korunmuş hücrelerin ultrayapısını 25 nm yarım perde çözünürlükte görüntülemek için gerekli numune hazırlama ve veri toplama adımlarını açıklayan bir protokol sunulmaktadır.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Düşük tutarlı holotomografi kullanarak organoidlerin yüksek çözünürlüklü, etiketsiz ve üç boyutlu görüntülenmesi için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, canlı organoidlerde yapısal dinamiklerin ve ilaç yanıtlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan organoid kültür hazırlama, görüntüleme elde etme ve hesaplamalı görüntü analizini detaylandırır.

Düşük Tutarlı Holotomografi ile Bağırsak Organoidlerinin Etiketsiz, Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme ve Makine Öğrenmesi Analizi

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Keşfedin, seri iki foton tomografi kullanarak Salmonella'nın dalakta antibiyotik tedavisi sırasında nasıl sürdüğünü. Bu yöntem, bakteri ve bağışıklık hücreleri arasındaki uzamsal ilişkileri analiz eder.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Daha fazla video keşfet