Name: HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Öğrenin, HEK-293T hücrelerinde GFP tabanlı raporlayıcı sistemler kullanarak homolog olmayan uç birleştirme ve homolog rekombinasyon etkinliğini akış sitometrisi ile nasıl analiz edeceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Çin'in Heilongjiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (YQ2022C036) ve Qiqihar Tıp Üniversitesi Lisansüstü İnovasyon Vakfı (QYYCX2022-06) tarafından finanse edilmiştir. Şekil 1, MedPeer kullanılarak üretilmiştir.

1. Plazmit izolasyonu
<ol><li>Yetkin E. coli'yi EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plazmidi eksprese eden I-SceI) ve PCI2-HA-mCherry (mCherry eksprese eden plazmit) ile dönüştürün (bkz. Malzeme Tablosu) standart dönüşüm protokolünü takiben20. NOT: PCI2-HA-mCherry, diğer mCherry veya DsRed eksprese eden plazmitlerle ikame edilebilir.</li>
	<li>Dönüştürülmüş E. coli'yi , 100 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 500 mL sıvı LB ortamında, gece boyunca 37 ° C'de çalkalayarak yetiştirin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen endotoksin içermeyen bir plazmid maksi izolasyon kiti kullanarak plazmitleri izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Nanodrop mikrohacim spektrofotometreleri kullanarak plazmit konsantrasyonlarını ölçün. Plazmit konsantrasyonunu 1 μg/μL'ye ayarlayın.</li>
</ol>2. Hücre hazırlığı ve transfeksiyonu
<ol><li>Kültür HEK-293T hücreleri% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM ortamında. HEK-293T hücrelerinin veya kurulu HEK-293T kararlı hücrelerinin iyi büyüme durumunda olduğundan emin olun. NOT: Donmuş hücreler, transfeksiyondan önce en az iki tur bölünmeye tabi tutulmalıdır.</li>
	<li>Transfeksiyondan bir gün önce, HEK-293T hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 2 × 105 hücre / kuyuda tohumlayın ve ertesi gün yaklaşık% 60 birleşme elde edin.</li>
	<li>Transfeksiyon gününde, yaklaşık% 60'ı hedefleyerek hücre birleşmesini onaylayın. NHEJ testi için, deneysel numune hücrelerini, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 1 μg EJ5-GFP, 1 μg pCBASceI ve 1 μg PCI2-HA-mCherry plazmidleri içeren 6 oyuklu bir plakada transfekte edin (bkz. HR testi için EJ5-GFP plazmidini DR-GFP plazmidi ile değiştirin.</li>
	<li>FACS kalibrasyon kontrolleri için, negatif kontrol olarak transfekte edilmemiş bir hücre kuyusu bırakın. Hücreleri 6 oyuklu bir plakada (1) 1 μg EJ5-GFP (NHEJ testi için) veya 1 μg DR-GFP (HR testi için), GFP tek renkli kontrol olarak 1 μg pCBASceI ile birlikte transfekte edin veya (2) mCherry tek renkli kontrol olarak 1 μg PCI2-HA-mCherry.</li>
</ol>3. GFP-pozitif ve mCherry-pozitif hücrelerin akış sitometrisi ile analizi
<ol><li>Transfeksiyondan iki gün sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak GFP ve mCherry proteinlerinin ekspresyonunu doğrulayın.</li>
	<li>Transfeksiyondan üç gün sonra, ortamı kuyucuklardan çıkarın, bir kez PBS ile yıkayın ve her oyuğa 500 μL tripsin ekleyin. Tüm hücreleri plakadan ayırmak için 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Bu ve sonraki adımlar boyunca, hücreleri doğrudan ışıktan koruyun.</li>
	<li>Her oyuğa 500 μL tam DMEM ortamı ekleyin, hücreleri yeniden süspanse edin ve hiçbir topaklanmanın görünmemesini sağlayın.</li>
	<li>Tüm hücreleri her bir kuyucuktan 1.5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın, ardından hücreleri oda sıcaklığında 1000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı pipetleyerek dikkatlice çıkarın ve bir kez 1.0 mL PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Yine, süpernatanı pipetleme ile dikkatlice çıkarın, hücreleri 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri FACS tüplerine aktarın (bkz. NOT: En iyi sonuçlar için, hücre hasadından hemen sonra akış sitometrisi analizine başlayın. Alternatif olarak, hücreler birkaç saat buz üzerinde saklanabilir.</li>
	<li>FACS'yi transfekte edilmemiş hücreler (negatif kontrol), EJ5-GFP/DR-GFP ve pCBASceI-transfekte edilmiş hücreler (GFP tek renk kontrolü) ve mCherry transfekte edilmiş hücreler (mCherry tek renk kontrolü) ile kalibre edin. GFP ve mCherry arasındaki floresan yayılmasını en aza indirmek için voltajı ve kompanzasyonunu ayarlayın.</li>
	<li>Her tüpten en az 10.000 sağlam hücre alın ve kaydedin.</li>
</ol>4. Veri analizi
NOT: Aşağıdaki adımlar, FACS Verilerini analiz etmek için FlowJo yazılımı ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanılarak gerçekleştirilir. Alternatif analiz yazılımında benzer prosedürler yürütülebilir.
<ol><li>Tüm FACS dosyalarını kontrol paneline sürükleyin. FSC/SSC grafiğini görüntülemek için dosyalardan birine çift tıklayın.</li>
	<li>Sol alt köşedeki kalıntıları hariç tutarak bozulmamış hücreleri seçmek için bir çokgen kapısı oluşturun. Bu alt popülasyonu "Bozulmamış Hücreler" olarak adlandırın ve bu geçidi "Tüm Örnekler" çubuğuna sürükleyin. Her numune için uygun geçitlemeyi sağlamak için Sonraki Sample düğmesini kullanarak her numunede ilerleyin (Şekil 2A).</li>
	<li>Yeni bir çizim oluşturmak için negatif kontrol örneğinin (transfekte edilmemiş hücreler) Bozulmamış Hücreler alt popülasyonuna çift tıklayın. Eksenleri FL1-H (x ekseni, GFP) ve FL2-H (y ekseni, mCherry) olarak değiştirin.</li>
	<li>Dörtlü Geçit aracını seçin ve negatif hücre popülasyonunun sağ üst ucuna tıklayın (Şekil 2B). Dört dikdörtgen kapıyı "Sağlam Hücreler" çubuğuna sürükleyin. GFP pozitif veya mCherry pozitifi negatif kontrol hücrelerinden ayırt etmek için uygun geçitlemeyi sağlamak için Sonraki Örnek düğmesini kullanarak GFP tek renk kontrolü veya mCherry tek renk kontrolü örnekleri arasında gezinin (Şekil 2C, D). Gerekirse kadran kapısına ince ayar yapın ve bu geçitlemeyi tüm "Sağlam Hücreler" popülasyonlarına uygulayın.</li>
	<li>Düzen düzenleyicisine tıklayın. Temsili grafiklere sağ tıklayın ve Düzen Düzenleyicisine Kopyala'yı seçin. Tüm temsili grafikleri seçin, ardından Grafik Tanımı'nı açmak için çift tıklayın. Eksen etiketini, açıklama eklemeyi ve göstergeyi istediğiniz gibi ayarlayın.</li>
	<li>Deneysel örneklerdeki mCherry pozitif hücrelerin yüzdesi, transfeksiyon verimliliği kontrolü olarak işlev görür. Aynı grafikteki GFP pozitif hücrelerin sayısını mCherry pozitif hücrelerin sayısıyla karşılaştırarak bağıl DNA onarım verimliliğini hesaplayın.</li>
</ol>

NHEJ ve İK Verimliliğini Değerlendirmek için GFP ve mCherry Raportör Hücrelerinin FACS Analizi

<ol><li>Huang, R., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair%3A+historical+perspectives%2C+mechanistic+pathways+and+clinical+translation+for+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomologous+DNA+end-joining+for+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).</li>
<li>Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+the+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+Is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).</li>
<li>Zuo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+end-joining+in+HNSC+cell+lines+using+DNA+Double-strand+break+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays.</a> Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).</li>
<li>Schrank, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ARP2%2F3+drives+DNA+break+clustering+for+homology-directed+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair.</a> Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).</li>
<li>Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+promotes+chromatin+decondensation+to+facilitate+initiation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response.</a> Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCINAP+regulates+the+DNA-damage+response+and+mediates+the+resistance+of+acute+myelocytic+leukemia+cells+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy.</a> Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WASH+interacts+with+Ku+to+regulate+DNA+double-stranded+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair.</a> iScience. 25 (1), 103676(2022).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+RIG-I+and+XRCC4+connects+DNA+repair+with+RIG-I+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling.</a> Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).</li>
<li>Watkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+profiling+reveals+that+HORMAD1+overexpression+contributes+to+homologous+recombination+deficiency+in+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers.</a> Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP44+regulates+irradiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+and+suppresses+tumorigenesis+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma.</a> Nat Commun. 13 (1), 501(2022).</li>
<li>Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+double-strand+break+%28DSB%29+repair+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells.</a> JoVE. (43), e2002(2010).</li>
<li>Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakanishi%2C+K+%22DNA+recombination%3A+Methods+and+Protocols%22">DNA recombination: Methods and Protocols</a>. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).</li>
<li>Cavallo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+proficiency+in+homologous+recombination+underlies+the+high+sensitivity+of+embryonal+carcinoma+testicular+germ+cell+tumors+to+cisplatin+and+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition.</a> PLoS One. 7 (12), e51563(2012).</li>
<li>Unfried, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+NIHCOLE+promotes+ligation+efficiency+of+DNA+double-strand+breaks+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).</li>
<li>Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCavallo%2C+F+%22Testicular+Germ+Cell+Tumors%3A+Methods+and+Protocols%22">Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols</a>. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hanahan+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+Escherichia+coli%3A+high-efficiency+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).</li>
<li>Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+steps+of+mammalian+homologous+repair+with+distinct+mutagenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences.</a> Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).</li>
</ol>

İfşa edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada açıklanan yöntem, NHEJ verimliliğini ve İK verimliliğini değerlendirmek için çeşitli makalelerde kullanılmıştır 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Bu yöntem, DNA DSB onarımının altında yatan mekanizmaları aydınlatmak ve NHEJ ve HR ile ilişkili yeni faktörleri tanımlamak için uygundur. Örneğin, DNA'ya bağımlı protein kinaz katalitik alt biriminin (DNA-PKcs) işlevi (DNA-PKcs)9, Coilin etkileşimli nükleer ATPaz proteini (hCINAP)10, WASH11, retinoik asitle indüklenebilir gen I (RIG-I)12, X-ışını onarımı çapraz tamamlayıcı protein 4 (XRCC4)12, HORMA alanı içeren protein 1 (HORMAD1)13, ubikitine özgü proteaz 44 (USP44)14ve NHEJ veya HR'deki lncRNA NIHCOLE (ligasyon etkinliğinde onkojenik rolü olan hepatosellüler karsinomda indüklenen kodlamayan RNA), ekstrakromozomal yöntemlerin uygulanmasıyla ortaya çıkarılmış veya doğrulanmıştır. Kromozomal olarak entegre yaklaşımın aksine, bu ekstrakromozomal yaklaşım, yerleşik stabil hücre hatlarının kullanılması yoluyla NHEJ veya HR verimliliğinin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar.
Daha önce HEK-293T hücrelerinde biz ve diğerleritarafından 10,11,12 kullanılmış olan ekstrakromozomal NHEJ ve HR testleri, U2OS hücreleri16,17, embriyonal karsinom hücreleri17,19, HCT116 hücreleri9, SUM159 hücreleri13, HCC1143 hücreleri13, MDA-MB-436 hücreleri13, SUNE1 hücreleri14, Huh7 hücreleri18 ve JHH6 hücreleri18. Buradaki protokol, HEK-293T hücrelerinde gerçekleştirilen NHEJ ve HR testlerinin ayrıntılı bir tanımını sağlar. HEK-293 hücrelerinin kayda değer transfeksiyon verimliliği göz önüne alındığında, 1 μg EJ5-GFP veya 1 μg DR-GFP ile birlikte 1 μg pCBASceI kombinasyonunun, 6 oyuklu bir plakada kültürlenen HEK-293T hücreleri için yeterli olduğu kabul edilir. Bununla birlikte, transfeksiyon koşulları, HEK-293T 9,16,17 dışındaki hücre hatlarında farklılık gösterebilir ve bu da araştırmacının başarılı transfeksiyon için kesin koşulları titizlikle belirlemesini gerektirir.
Transfeksiyondan önce gerekli hücre birleşmesini elde etmek, protokolde çok önemli bir prosedürdür. Yetersiz veya aşırı sayıda hücre, transfeksiyonun etkinliğini önemli ölçüde engelleyebilir. Yetersiz sayıda hücre, transfeksiyon sonrası toksisiteyi şiddetlendirir ve böylece DSB onarımının kesin değerlendirmesini engeller. Ayrıca, EJ5-GFP/DR-GFP, pCBASceI, PCI2-HA-mCherry ve transfeksiyon reaktifi karışımındaki sapmalar sonucu potansiyel olarak etkileyebileceğinden, tek bir deneyde aynı plazmit ve transfeksiyon reaktifi karışımının kullanılması önemlidir.
NHEJ ve HR'ye ek olarak, alternatif uç birleştirme (a-EJ) ve tek iplikli tavlama (SSA), DSB'leri onarmak için ek mekanizmalar olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, vahşi tip hücrelerde, NHEJ ve HR, DSB onarımı için birincil yollar iken, a-EJ ve SSA bu konuda sadece küçük bir katkı sağlar. EJ5-GFP plazmidini kullanan NHEJ testinin hem NHEJ hem de a-EJ olaylarını tespit ettiğini ve bu nedenle hem NHEJ hem de a-EJ5 dahil olmak üzere toplam NHEJ için bir test olarak düşünülebileceğini belirtmekte fayda var. a-EJ'nin bireysel bir analizi, EJ5-GFP'nin EJ2-GFP18 ile değiştirilmesiyle basitçe elde edilebilir. Benzer tahliller, bozulmuş GFP raporlayıcısını hprtSAGFP21 ile değiştirerek SSA'nın onarım verimliliğini analiz etmek için de yapılabilir.

DNA çift sarmallı kırılma (DSB), DNA hasarının en zararlı şeklidir ve derhal onarılmazsa potansiyel olarak genom kararsızlığına, kromozomal yeniden düzenlemelere, hücresel yaşlanmaya ve hücre ölümüne yol açar1. İki iyi bilinen yol, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR), DNA DSB'lerini 2,3 adreslemedeki etkinlikleri ile tanınmaktadır. HR, yaralı DNA molekülü3'ün orijinal konfigürasyonunu eski haline getirmek için bir şablon olarak kardeş kromatitteki homolog dizileri kullanan DSB onarımı için hatasız bir mekanizma olarak kabul edilir. Öte yandan NHEJ, herhangi bir şablon2'ye güvenmeden kırık DNA uçlarını birleştiren hataya açık bir DSB onarım yoludur.
NHEJ testi ve HR testi, orijinal olarak Jasin'in Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi'ndeki laboratuvarında geliştirilen ve sırasıyla NHEJ ve HR'nin etkinliğini ölçmek için kullanılan klasik yöntemlerdir 4,5,6,7. Bu tahliller, NHEJ ve HR 8,9,10,11,12,13,14 ile ilişkili ilgili mekanizmaların ve faktörlerin araştırılmasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Her iki test de, I-SceI endonükleaz tarafından indüklenen DSB'lerin onarımını izlemek için iki bozulmuş GFP raportörünün, EJ5-GFP ve DR-GFP'nin uygulanmasına dayanır. EJ5-GFP raportörü NHEJ tahlilinde kullanılırken, DR-GFP muhabiri İK tahlilinde kullanılır. Her raporlayıcı, I-SceI ile indüklenen DSB'lerin yalnızca bir GFP ekspresyon kasetini 4,5 geri yüklemek için belirli bir onarım yolu ile onarılabilmesi için ince bir şekilde tasarlanmıştır.
NHEJ testi ve HR testi, kromozomal olarak entegre veya ekstrakromozomal yaklaşım kullanılarak gerçekleştirilebilir15,16. Kromozomal olarak entegre yaklaşım, bozulmuş GFP raportörlerinin genoma entegrasyonunu gerektirir ve DSB onarımının kromozomal bir bağlam içinde analizine izin verir 6,15. Bununla birlikte, bu yaklaşım uzun süreli hücre geçişi gerektirir ve keyfi kromozomal entegrasyon nedeniyle birden fazla hücre dizisini içeren karşılaştırmalı çalışmalar için uygun değildir, bu da doğal farklılıklardan ayrı olarak ek bir karıştırıcı faktör sunar. Bu protokolde, bozulmuş GFP ve I-SceI plazmitlerinin HEK-293T hücrelerine geçici transfeksiyonunu ve ardından akış sitometrisi analizini içeren ekstrakromozomal NHEJ testi ve HR testlerini açıklıyoruz (deney iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir). Bu entegre olmayan raportör tahlilleri ilk olarak Jasin'in laboratuvarı tarafından DNA iplikçikler arası çapraz bağ onarımını16 incelemek için rapor edildi ve bizimki de dahil olmak üzere çeşitli laboratuvarlar 9,10,11,12,13,14,17,18,19 tarafından NHEJ verimliliğini ve HR verimliliğini değerlendirmek için kullanıldı11. Bu ekstrakromozomal yaklaşımlar, birden fazla yerleşik stabil hücre hattını içeren karşılaştırmalı çalışmalarda DSB onarımının analizini kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>6 cm tabaklar&nbsp;</td><td>BBI</td><td>F611202-9001</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plakalar</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Beyotime</td><td>ST007</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 100 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>DH5 ve alfa; Yetkili Hücreler</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DR-GFP</td><td>Addgene</td><td>26475</td><td></td></tr><tr><td>EJ5-GFP</td><td>Addgene</td><td>44026</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plazmid ve nbsp kiti</td><td>TIANGEN</td><td>DP117</td><td>alternatif endotoksin içermeyen plazmit ekstraksiyon kiti kullanılabilir</td></tr><tr><td>FACS tüpleri</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>CLARK</td><td>FB25015</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V.10.1</td><td>Treestar</td><td></td><td>alternatif analiz yazılımı kullanılabilir</td></tr><tr><td>HEK-293T hücreleri</td><td>Ulusal Hücre Hattı Altyapısı Kaynak</td><td>1101HUM-PUMC000091</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td>alternatif transfeksiyon vekilleri kullanılabilir</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>pCBASceI</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td>I-SceI eksprese eden plazmid</td></tr><tr><td>PCI2-HA-mDsRed</td><td></td><td></td><td>içeren alternatif plazmitler kullanılabilir</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

hek-293t hücrelerinde homolog olmayan uç birleştirme ve homolog rekombinasyon etkinliğinin gfp tabanlı raporlayıcı sistemler kullanılarak analizi

Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

DNA çift sarmallı kırılmalar (DSB'ler), önemli genetik bilgi kaybına ve hücresel ölüme neden olabilen en tehlikeli DNA lezyonlarını temsil eder. Yanıt olarak, hücreler DSB onarımı için iki ana mekanizma kullanır: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR). NHEJ ve İK'nın verimliliğini ayrı ayrı ölçmek, her biriyle ilişkili ilgili mekanizmaları ve faktörleri keşfetmek için çok önemlidir. NHEJ testi ve HR testi, ilgili onarım yollarının verimliliğini ölçmek için kullanılan yerleşik yöntemlerdir. Bu yöntemler, DSB'leri indükleyen endonükleaz I-SceI için tanıma bölgelerine sahip bozulmuş bir yeşil floresan protein (GFP) geni içeren titizlikle tasarlanmış plazmitlere dayanır. Burada, HEK-293T hücrelerinin EJ5-GFP/DR-GFP plazmitleri, plazmid eksprese eden bir I-SceI ve plazmid eksprese eden bir mCherry ile birlikte transfekte edilmesini içeren ekstrakromozomal NHEJ testini ve HR testini açıklıyoruz. NHEJ ve HR verimliliğinin kantitatif sonuçları, akış sitometrisi ile sayıldığı gibi, GFP pozitif hücrelerin mCherry pozitif hücrelere oranının hesaplanmasıyla elde edilir. Kromozomal olarak entegre tahlillerin aksine, bu ekstrakromozomal tahliller, birden fazla yerleşik stabil hücre hattını içeren karşılaştırmalı araştırmalar yürütmek için daha uygundur.

NHEJ ve İK analizinin doğruluğunu sağlamak için, uygun bir tazminat ayarlaması ve geçit stratejisinin uygulanması gereklidir. Tipik olarak, mCherry floresansı, 530 nm'lik bir filtre kullanıldığında GFP dedektöründe ortaya çıkmaz. Bununla birlikte, son derece yüksek GFP ekspresyonu sergileyen hücrelerin örneklerinde, GFP floresansı, 575 nm'lik bir filtre kullanıldığında mCherry dedektörünü kirletebilir. Bu endişeleri gidermek için, kompanzasyon ve geçit stratejisini düzenlemek için negatif kontrol, GFP tek renk kontrolü ve mCherry tek renk kontrol numuneleri kullanıldı. Kontrol hücrelerinin tipik FACS sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir. Kompanzasyon ayarlaması ve geçit stratejisi, GFP pozitif hücrelerin çoğunluğunu sağ alt kadranda (Şekil 2C) ve mCherry pozitif hücrelerin çoğunu sol üst kadranda (Şekil 2D) konumlandırmalıdır.
Nihai temsili çizimler Şekil 3A,B'de gösterilmiştir. DSB'lerin I-SceI ile indüksiyonunu takiben, başarılı onarım olayları GFP genini yeniden oluşturacaktır. Bu nedenle, GFP pozitif hücrelerin yüzdesi, DNA DSB onarım ve transfeksiyon verimliliğinin verimliliğine karşılık gelir. mCherry pozitif hücrelerin yüzdesi sadece transfeksiyon verimliliğine karşılık gelir. DNA DSB onarımının nispi etkinliği, GFP-pozitif hücrelerin mCherry-pozitif hücrelere oranı olarak hesaplanabilir (Şekil 3C).
DNA onarımında Wiskott-Aldrich sendromu proteininin ve SCAR homologunun (WASH) rolünü karakterize etmek için NHEJ testinin somut bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir. Bu örnekte, shControl hücrelerinin ve shWASH hücrelerinin NHEJ verimliliğini değerlendirmek için NHEJ testini gerçekleştirdik (Şekil 4). Açıkçası, WASH kaybı, NHEJ verimliliğinde bir azalmaya neden oldu ve WASH'ın NHEJ testi tarafından belirlenen NHEJ verimliliğini arttırmadaki rolünü doğruladı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig01.jpg"> Şekil 1: NHEJ/HR testi için iş akışına genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig02.jpg"> Şekil 2: Akış sitometrisi analizi için geçit stratejisi. (A) Sağlam hücreler üzerinde FSC-H/SSC-H geçiti. (B) Transfekte edilmemiş HEK-293T hücreleri, otofloresan hücrelerin dışlanması için negatif bir kontrol olarak kullanıldı. (C) EJ5-GFP ve pCBASceI plazmitleri ile transfekte edilen HEK-293T hücreleri, GFP pozitif hücreler için geçitin ayarlanması için kullanıldı. (D) mCherry plazmitleri ile transfekte edilen HEK-293T hücreleri, mCherry pozitif hücreler için geçitin ayarlanması için kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig03.jpg"> Şekil 3: Tipik sonuçlar. (A) NHEJ'nin analizini gösteren temsili grafikler. (B) İK analizini gösteren temsili çizimler. (C) Hesaplama yönteminin model diyagramı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig04.jpg"> Şekil 4: WASH, NHEJ verimliliğini arttırır. (A) shControl hücrelerinde ve shWASH hücrelerinde NHEJ verimliliğinin analizini gösteren temsili grafikler. (B) shControl ve shWASH hücreleri arasındaki NHEJ verimliliğini karşılaştıran temsili istatistiksel sonuçlar. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, HEK-293T hücrelerinde NHEJ ve HR'nin etkinliğini ölçmek için bir ekstrakromozomal homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) testi ve homolog rekombinasyon (HR) testini tanımlar.

HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the most perilous DNA lesions, capable of inducing substantial genetic information loss and cellular demise. In ...

DNA çift sarmallı kırılmaları en tehlikeli DNA lezyonlarını temsil eder. Buna karşılık, hücreler DNA çift sarmallı kopma onarımı için iki ana mekanizma kullanır: NHEJ ve HR. NHEJ ve İK'nın verimliliğini ayrı ayrı ölçmek, bunlarla ilişkili ilgili mekanizmaları ve faktörleri keşfetmek için çok önemlidir. NHEJ testi ve HR testi, NHEJ ve HR'nin verimliliğini ölçmek için kullanılan yerleşik yöntemlerdir. Bu yöntemler, DSB'lerin indüksiyonu için endonükleaz I-SceI için tanıma bölgelerine sahip bozulmuş bir yeşil floresan protein geni içeren titizlikle tasarlanmış plazmitlere dayanır.NHEJ testi ve HR testi, kromozomal olarak entegre veya ekstrakromozomal bir yaklaşım kullanılarak gerçekleştirilebilir. Kromozomal olarak entegre yaklaşım, kromozomal olarak bir yarışma içinde DSB onarımının analizini sağlar. Bununla birlikte, kromozomal olarak entegre yaklaşım, uzun süreli hücre gerektirir ve çoklu hücre hatlarını içeren karşılaştırmalı çalışmalar için uygun değildir.Bu protokolde, bozulmuş GFP ve I-SceI plazmitlerinin HEK-293T hücrelerine geçici transfeksiyonunu ve ardından akış sitometrisi analizini içeren ekstrakromozomal NHEJ ve HR testlerini tarif ediyoruz. Bu entegre olmayan raportör tahlilleri, bizimki de dahil olmak üzere çeşitli laboratuvarlar tarafından NHEJ verimliliğini ve İK verimliliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Kromozomal olarak entegre yaklaşımın aksine, bu ekstrakromozomal yaklaşım, yerleşik, kararlı hücre hatlarının kullanılması yoluyla NHEJ veya HR verimliliğinin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar.

analysis-nonhomologous-end-joining-homologous-recombination

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

Biz RNAi kullanarak bir hücrenin endojen BRCA1 protein tüketen ve bir kodlama değişiklik içeren bir BRCA1 noktası mutant yerine homolog rekombinasyon DNA hasarı tamir için bir doku kültürü bazlı analiz BRCA1 varyantları test etmek için bir yöntem sağlar.

Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

HO-uyarılmış translokasyon tahlil tek iplikli DNA, çift iplikli tatili diploid birden fazla lokusların kurulmasından sonra tavlama...

HO-Endonuclease Oluşum kantitasyonu ve Analiz Tavlama Tek-Strand kromozomal Translokasyonlar Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Burada sunulan sgRNA / CAS9 endonükleaz ve CD4 promotörünün yakınındaki çift iplikçik kopması onarımı ile ilişkili mutasyonları tanımlamak için kullanılabilecek yeni nesil dizileme protokolüdür.

CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması

Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

Bir dizi lüminesans tabanlı ekstrakromozomal raportör substrat kullanarak hücrelerde çift iplikli kopma onarım yolu yeterliliğinin değerlendirilmesi için protokoller sunuyoruz.

Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Burada, sabit memeli hücrelerinde hücre tabanlı görselleştirme, hücre altı lokalizasyonu ve poli(ADP-riboz) (PAR) zenginleştirilmiş odakların nicel analizini tanımlıyoruz. Bu test, genotoksine maruz kalan hücrelerin çekirdeklerinde, baz eksizyon onarımı veya tek zincirli kırılma onarımı ile ilişkili DNA hasarı kaynaklı PARP aktivasyonunun noktalarının nicelendirilmesini sağlar.

Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi

Öğrenin, HEK-293T hücrelerinde GFP tabanlı raporlayıcı sistemler kullanarak homolog olmayan uç birleştirme ve homolog rekombinasyon etkinliğini akış sitometrisi ile nasıl analiz edeceğinizi.

HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi (Video) | JoVE Journal

HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi

Daha fazla video keşfet