Name: Bir İn Vitro Tromboliz Modelinde Kesme Akışı Altında Chandler Döngü Şeklinde Tam Kan Pıhtılarının Fibrinolizinin İzlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Keşfedin Chandler döngüsü ve RT-FluFF kullanarak tromboliz modellerinde fibrinoliz izleme yöntemlerini. Bu teknik, tromboz tedavileri için fizyolojik koşullara daha yakın sonuçlar elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından R01HL167877 Numaralı Ödül altında desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Aşağıda belirtilen tüm yöntemler kurumsal inceleme kurulu (IRB) protokollerine ve kurumsal insan araştırmaları etik kuruluna uygundur. Tüm sağlıklı gönüllüler kan bağışından önce yazılı ve bilgilendirilmiş onam verdiler. Protokolde atıfta bulunulan tüm materyallerin Malzeme Tablosunda bulunabileceğini unutmayın. Bu protokol boyunca insan WB ve plazma tartışılırken, araştırma hayvanı kanı ve faktör tükenmiş kan ürünlerinin kullanımı satın alınabilir ve ikame edilebilir.
1. Tam kan alma
<ol><li>Standart flebotomi tekniklerini kullanarak rıza gösteren sağlıklı gönüllülerden venöz tam kan (WB) toplayın. DİKKAT: Bu protokol boyunca kan veya diğer potansiyel olarak bulaşıcı materyallerle temas riskini azaltmak için evrensel önlemlerin alındığından emin olun. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve yüz siperi kullanımı gereklidir.</li>
	<li>~ 50 mL WB'yi doğrudan% 3.2 sodyum sitrat tüplerine toplayın ve sonraki kullanım için hemen 50 mL tüplere toplayın. NOT: Tüplerin üretici tarafından önerilen hacimlerine kadar doldurulmasını sağlamanın yanı sıra, sitrat tüpüne kan alınmadan önce bir atma tüpü gereklidir. Taze toplanan WB, konakçının pıhtılaşma dinamiklerini en iyi şekilde özetleyecektir. WB'nin oda sıcaklığında (kullanımdan ≤4 saat önce) kısa süreli saklanmasına izin verilir. WB, tromboelastografi15 ile incelendiğinde pıhtılaşma dinamiklerini etkilediği gösterildiğinden gece boyunca saklanmaz.</li>
</ol>2. Pıhtı oluşumu
<ol><li>3 mL sitrat tam kana, floresan (floresein izotiyosiyanat [FITC]) etiketli fibrinojen (FITC-Fg) 60 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin (3 mg / mL'lik bir endojen plazma fibrinojen konsantrasyonu varsayılarak 1:50 floresan etiketli fibrinojen ila modifiye edilmemiş fibrinojen oranı). NOT: Bu oran, pıhtı morfolojisi üzerinde minimum etki ile 1:10'a kadar yükseltilebilir. 13,14 Floresan etiketli fibrinojen, fibrinojenin floresein izotiyosiyanat (FITC) ile reaksiyona sokulmasıyla satın alınabilir veya üretilebilir. Fibrinojen karışımı koşu başlamadan ≤5 dk önce yapılmalıdır.<ol><li>Fibrinojen daha önce aliquoted edilmiş ve dondurulmuşsa, polimerizasyonun erken başlamadığından ve böylece kullanılamaz hale gelmediğinden emin olmak için çözülmüş FITC-Fg'yi inceleyin (çözeltide partikül veya lif olmadığından emin olun).</li>
	</ol></li>
	<li>120 ° C'lik bir su banyosunda 37 mm çapında bir tambur ile Chandler döngü kurulumunu hazırlayın (Şekil 1). Chandler döngü cihazının, tüm pıhtı oluşturma süreci boyunca 0-90 rpm'lik sabit bir dönme hızında dönebildiğinden emin olun. NOT: Ek Chandler döngü kurulumu ve modifikasyonları Zeng ve ark.16.</li>
	<li>Boruları kesin (iç çap 5/32", dış çap 7/32") ve tamburun etrafına sıkıca oturan ancak sıkıca oturmayan halkalar oluşturun. Burada tartışılan önerilen boru boyutu için, kapalı döngüyü oluşturmak üzere borunun uçlarını bağlamak için bir bağlantı parçası olarak kullanmak üzere standart bir 200 μL PCR tüpü kesin. NOT: Farklı boyutlarda pıhtılar16 üretmek için farklı boru boyutları kullanılabilir.</li>
	<li>Tam kana 1:17 kalsiyum çözeltisi oranında 200 mM Kalsiyum Klorür çözeltisi ekleyerek kanın pıhtılaşmasını başlatın. 3 mL'lik bir şırınga kullanarak kanı tüpe yükleyin (tüp hacminin ~% 50'sini doldurun). Halkayı hemen uçları bağlayan Chandler döngü tamburuna yerleştirin ve döndürmeye başlayın.<ol><li>WB bileşenlerinin çökmesinden kaynaklanan herhangi bir sorunu önlemek için yüklemeden önce yumuşak ters çevirme ile uygun şekilde karıştırdığınızdan emin olun.</li>
		<li>Her çalıştırmada her tüpe eşit miktarda kan eklendiğinden emin olun, çünkü bu, tutarlı tutulmazsa pıhtı boyutunu etkileyebilir.</li>
		<li>Kan sütunu içindeki kabarcıklar da kanın pıhtılaşmasını etkileyebileceğinden, kabarcıkların tambura yüklenmeden önce kaçmasını kolaylaştırmak için tüpü "tahterevalli" benzeri bir şekilde hafifçe hareket ettirerek bunları çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>~450 s-1'lik bir hesaplanmış kesme hızı elde etmek için tamburu kısmen su banyosuna batırılmış 40 RPM dönme hızında döndürün. NOT: Boru boyutuna ve dönüş hızına (20 ila 60 RPM) dayalı olarak hesaplanan makaslar hakkında bilgi için Zeng ve ark.16'ya bakın. Tipik venöz ve arteriyel kesme hızları sırasıyla 20-200 s-1 ve 300-1.000 s-1'dir ve ~ 400-500 s-1 pulmoner arteri temsil eder.</li>
	<li>Floresan etiketli fibrinojenin foto-ağartılmasını en aza indirmek için düşük ışık koşullarında 40-60 dakika pıhtıların oluşmasına izin verin.</li>
	<li>İstenilen pıhtılaşma süresine ulaşıldıktan sonra, pıhtıları tüpten çıkarın ve hemen kullanın. Yapıdan ödün vermeden pıhtıların nazikçe çıkarılmasını sağlamak için, pıhtının tüpten yavaşça küçük bir kaba kaymasını sağlamak için boruyu nazikçe ters çevirin. NOT: Oluşan pıhtıların gece boyunca 4 °C'de sitratlı plazma veya PBS'de saklanması, akış döngüsündeki pıhtı sindiriminin sonraki analizini etkileyebilir.</li>
</ol>3. RT-FluFF cihaz kurulumu
<ol><li>Akış döngüsü aparatının Şekil 2'de görüldüğü gibi bağlandığından ve tüm bağlantıların sağlam olduğundan emin olun. Kısacası, akış döngüsü aparatı, akış yönü sırasına göre şunları içerir: Pompa > Sönümleyici > Giriş Basınç Sensörü > Pıhtı > Çıkış Basınç Sensörü > Florometre > Isıtmalı Rezervuar > Pompası. Pompa kapasitesi, deneysel akış hızı, boru çapı ve uzunluğu, sıcaklık, rezervuar hacmi ve pıhtı boyutu/geometrisi seçimini her çalışmaya özgü deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde ayarlayın. NOT: Bu örnek için, RT-FluFF için Chandler döngüsünde kullanılan aynı çaptaki boru kullanılmıştır. Boru aynı gün içinde birden fazla çalışma için kullanılabilir, ancak bozulma veya sızıntı açısından izlenmesi ve gerektiğinde değiştirilmesi/durulanması gerekir. Çalışmalar arasında ılık damıtılmış su ile durulama önerilir. Deneysel tasarıma bağlı olarak, her çalıştırmadan sonra borunun değiştirilmesi gerekebilir.</li>
	<li>Tüm borular sabitlendikten sonra basınç monitörünü açın. Basınç monitörünün hem giriş hem de çıkış sensörleri için 0 mmHg okuduğunu kontrol edin. Olmazsa, basınç sensörlerinin atmosferik basınca açık olduğundan emin olmak için vanaları açın ve sensörleri sıfırlayın.</li>
	<li>Kullanılan ısıtma bloğunu veya su banyosunu açın ve deney boyunca sıcaklığı izleyin. Fizyolojik insan vücudunun sıcaklığını taklit etmek için sıcaklığı 37 ° C'ye yakın tutun.</li>
	<li>Sızıntı olup olmadığını kontrol etmek ve basınç sensörlerinin çalıştığını doğrulamak için pompayı istenen akış hızına getirin. NOT: Bu boru boyutunda ~ 160 mL / dak'lık bir akış hızı, ~ 500 s-1'lik bir kesme hızını temsil edecektir.</li>
	<li>Pıhtı yüklemesini kolaylaştırmak için pompayı kapatın.</li>
</ol>4. Pıhtının akış döngüsüne yüklenmesi
<ol><li>Depolanmış önceden yapılmış bir pıhtı kullanılıyorsa, pıhtıyı akış döngüsü sistemine yüklemeden önce oda sıcaklığına getirdiğinizden emin olun.</li>
	<li>Pıhtı kütle kaybı, tromboliz testleri için önemli bir son nokta ölçümüdür. Önceki ölçümlere güvenmek yerine, pıhtı kütlesini akış döngüsüne yüklemeden hemen önce ölçmek en iyi uygulamadır.<ol><li>Pıhtı kütlesi ölçümleri, pıhtıların içindeki ve üzerindeki sıvı içeriği kütlelerini önemli ölçüde etkileyebileceğinden, numuneler arasında ve test günleri arasında tutarlılığı sağlamak için her seferinde her zaman aynı şekilde yapılmalıdır. En iyi uygulama, ölçüm işlemi boyunca pıhtıyı sıkıştırmamaya dikkat ederek, mendil üzerine önemli miktarda sıvı salmayana kadar laboratuvar mendilleri üzerindeki pıhtıları nazikçe lekelemektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Pıhtıyı plazmaya (otolog veya tip uyumlu) veya akış döngüsünde kullanılan başka bir mobil faz çözeltisine (PBS veya tanımlanmış ortam gibi) tartım kabı gibi sığ bir kaba daldırın. Mobil faz çözümü, toplam sistem hacmini kontrol etmek için doğrudan 50 mL sistem rezervuarından alınmalıdır. Pıhtı yükleme aşamasında herhangi bir trombolitik veya farmasötik test ajanı bulunmamalıdır. Akış döngüsünü çalıştırmak için mobil fazın toplam hacminin ≥50 mL olması önerilir ve tüm numunelerde tutarlı olmalıdır.</li>
	<li>Akış döngüsü borusunun orta bölümünü (giriş ve çıkış sensörleri arasında) çıkarın ve borunun bir ucuna 10 mL'lik bir şırınga takın.</li>
	<li>Borunun serbest ucunu kullanarak, plazmaya (veya mobil faza) yerleştirin ve boruyu astarlamak için çözeltiden küçük bir hacim alın. Ardından, boru girişini pıhtının yanına yerleştirin, başı (tipik olarak pıhtının biraz daha kalın ucu) ve kuyruğu (başın karşısındaki uç) tanımlamak için pıhtıyı dikkatlice inceleyin. Pıhtı başı giriş basınç sensörüne doğru ve çıkıştan uzağa yerleştirilmelidir. Boruyu pıhtının "kuyruk" ucuna yerleştirin ve şırınga ile boruya aspire edin. NOT: pıhtı başı/kuyruk yönlülüğünün görsel olarak belirlenemediği durumlarda, yönlülük en iyi şekilde Chandler döngüsünden dönüş yönünün bilinmesine dayalı olarak atanabilir - pıhtı kafası tambur dönüşünün zıt yönüne bakar.</li>
	<li>Boruyu, pıhtı çıkış basınç sensörüne en yakın olacak şekilde ana aparata geri takın (pıhtı başı çıkış sensöründen uzağa bakmalıdır). Boruyu ve pıhtı kafasını iki adet 30 G'lik iğne ile "X" şeklinde delerek pıhtıyı yerine sabitleyin. Bu iğneleri çalışma süresince bırakın. NOT: Sönümleyici ve pompa ayarlarına bağlı olarak, pıhtının erken parçalanmamasını sağlamak için ek iğneler gerekebilir. Gerekirse, pıhtı parçalarının sistemde dolaşmasını önlemek için pıhtının akış aşağısındaki boruya bir ekran eklenebilir. Pıhtıyı tutmak için belirli sayıda iğne oluşturulduktan sonra, bunu koşullar arasında tutarlı tutun.</li>
	<li>Mobil faz çözeltisinin geri kalanını alın ve rezervuar olarak 50 mL'lik bir tüpe koyun.</li>
	<li>Rezervuarı su banyosuna yerleştirin ve giriş ve çıkış borularına yerleştirin (çıkış florometreden gelir ve giriş pompa kafasına girer).</li>
	<li>Kullanılan florometrenin bağlı olduğunu ve izlendiğini kontrol edin. Başlangıç değerinin, deneyin başlangıcındaki yalnızca mobil faz sistem taban çizgisine kıyasla uygun olup olmadığını kontrol edin. NOT: Bir in-line florometre mevcut değilse, rezervuarın seri periyodik örneklemesi, akış döngüsü analiz periyodu boyunca belirli aralıklarla gerçekleştirilebilir. Toplanan fraksiyonlar, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir spektrofotometrede deneyin tamamlanmasının hemen ardından 96 oyuklu bir plaka kullanılarak okunabilir.</li>
	<li>50 mL'de nihai 1.000 ng / mL tPA konsantrasyonu elde etmek için 500 μL 100.000 ng / mL tPA'yı doğrudan rezervuar hacmine ekleyin. Eklenen hacim, konsantrasyon ve spesifik ilaç, istenen hedef dolaşımdaki konsantrasyona ve sistem rezervuar hacmine bağlı olacaktır.</li>
	<li>Pompayı çalıştırmadan önce aşağıdakileri kontrol edin:<ol><li>Tüm kavşaklar güvenlidir.</li>
		<li>Basınç sensörlerinin üzerindeki iki valf uygun kapalı konumdadır.</li>
		<li>Rezervuarda kalan herhangi bir plazma (veya sıvı) değiştirildi.</li>
		<li>Trombolitik rezervuara eklendi ve uygun şekilde karıştırıldı.</li>
		<li>Giriş borusu rezervuarın dibine yakındır (bu, minimum kabarcık sağlar).</li>
		<li>Çıkış borusu güvenlidir ve istenen basınç için uygun yüksekliktedir (hangi kap konumunun modellendiğine bağlı olarak).</li>
		<li>Pompa dönüş yönü doğru (Akış sırası: Pompa > Sönümleyici > Pıhtı > Florometre > Rezervuar > Pompası).</li>
		<li>Pompa devirleri çok yükseğe ayarlanmışsa (>150 rpm), basınçtaki hızlı değişimin pıhtıyı parçalamamasını veya boru sızıntısına neden olmamasını sağlamak için daha yavaş bir hızda başlayın ve artırın.</li>
		<li>Sistemin florometreden gelen verileri uygun şekilde kaydettiğinden ve/veya deney sonrası zaman noktası okumaları için mobil fazın periyodik örneklemesi için sarf malzemelerinin hazırlandığından emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Pompayı açın ve istenen 160 mL/dk hacimsel akış hızını elde edecek şekilde ayarlayın veya istenen basınç elde edilene kadar akış hızını artırın. Sistem sıvı ve kabarcıklarla dolacaktır. Baloncuklar florometrik okumaları yapay olarak yükseltecektir, bu nedenle baloncukların temizlenmesini izleyin. Bunu yaptıklarında, ışıkları kapatın ve veri toplamaya başlayın.</li>
	<li>Pıhtı önemli ölçüde bozulana veya istenen deney süresi geçene kadar (≥60 dakika) pompayı çalışır durumda bırakın. Çeşitli trombolitik varyasyonları test eden benzersiz deneysel koşullar oluşturmak için rezervuar aracılığıyla deney boyunca sisteme gerektiği gibi reaktifler ekleyin. NOT: Deney süresi, pompa akış hızına (kesme seviyesi) ve trombolitik konsantrasyonuna bağlı olacaktır.</li>
	<li>Test tamamlandıktan sonra, hacimsel akış hızını azaltın ve sistemdeki sıvının çoğunu rezervuara itmek için pompa hala çalışırken giriş borusunu çıkarın (bazı mobil fazlar boruda kalacaktır). Borunun çıkış basınç sensörü tarafındaki pıhtı içeren boru bölümünü ayırın ve bir tartım teknesine indirin.</li>
	<li>Sistemin içinden kalan sıvıyı ve pıhtı/pıhtı parçalarını toplamak için pıhtıyı yerinde tutan iğneleri çıkarın. Gerektiğinde sistemi temizlemeye yardımcı olması için bir şırınga kullanın.</li>
	<li>Kaybedilen kütle yüzdesinin hesaplanması veya histoloji gibi ek analizler için kalan pıhtıyı tartın ve işleyin.</li>
</ol>5. Sistemin temizlenmesi
<ol><li>Numuneler arasında, tüm sistemi yüksek rpm'de (>150 rpm) ılık suyla durulayın. Suyu hazneye doldurun ve en az 2 dakika boyunca sistemden geçirin, boşaltın ve iki tam sistem durulaması için tekrar çalıştırın. Bu durulamalardan sonra, florometre okuması taban çizgisine dönmezse, durulama işlemini ek bir döngü için tekrarlayın. Hala taban çizgisine dönmediyse, bir sonraki numuneyi tahlil etmeden önce boruyu tamamen değiştirin. NOT: Deneyler sırasında, borular numuneler arasında yeniden kullanılabilir; Bununla birlikte, pıhtıyı yerinde tutmak için kullanılan iğnelerle delinme nedeniyle, giriş ve çıkış basınç sensörleri arasındaki boru bölümü her çalıştırmadan sonra değiştirilmelidir. Bazı deneysel koşullar altında, herhangi bir numune çapraz kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için her çalıştırmadan veya kümeleme testlerinden sonra tüm boru setinin değiştirilmesi gerekebilir.</li>
	<li>O günkü deney için tüm numuneler çalıştırıldıktan sonra, tüm boruları çıkarın ve atın. T-bağlantılarını temiz olana kadar sıcak su ve kıllı bir fırça ile ovalayın ve kurumaya bırakın ve şırınga sönümleyicileri sıcak suyla durulayın. Steriliteye yardımcı olmak için% 70 EtOH kullanın.</li>
</ol>

Ex Vivo Pıhtı Lizisi İzleme için Chandler Döngüsü ve RT-FluFF'nin Birleştirilmesi

<ol><li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspect+of+thrombolytic+therapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).</li>
<li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+ischemic+stroke+models%3A+replicating+human+stroke+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li>
<li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684(2014).</li>
<li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+J%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14(2006).</li>
<li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li>
<li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li>
<li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201(2018).</li>
<li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+in+haemostasis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833(2020).</li>
<li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511(2023).</li>
<li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Coagul+Fibrinolysis%22%5BJournal%5D)">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24(2023).</li>
<li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li>
<li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization%2C+fibrinogenolysis%2C+or+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li>
</ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Pıhtı oluşumu ve etiketleme Chandler döngüsünün, in-vivo trombüsleritaklit eden pıhtıları tekrarlanabilir şekilde oluşturmak için kolay ve etkili bir yol sağladığı gösterilmiştir 16. Boru boyutu, dönme hızları, tambur çapı ve pıhtılaşma süresi gibi ince ayar parametreleri, hem arteriyel hem de venöz kaynakları taklit eden bir dizi trombusta takdir edilen mimari özellikleri yakalayabilen farklı kesme koşulları altında hızlı pıhtı oluşumuna izin verir. FITC-Fg gibi belirteçleri tanıtabilmenin ek esnekliği, RT-FluFF sisteminde gösterdiğimiz gibi bu trombüslerin potansiyel kullanımlarını genişletir. Chandler döngüsünün altında yatan ilkeler ne kadar ilkel olsa da, pıhtı oluşumu süreci boyunca aynı anda kan ve kan ürünlerini ele alırken tutarlı pıhtı oluşumu ile ilişkili dik bir başlangıç öğrenme eğrisi vardır. Bu, WB'nin pıhtılaşmasının, pıhtılaşmanın başlamasından önceki ve sonraki anlarda elleçlenmeye karşı son derece hassas olmasından kaynaklanmaktadır. Kan yüzeyi etkileşimleri pıhtı oluşumunun ilerlemesini etkileyebileceğinden, Chandler döngüsündeki pıhtı oluşumu adımı sırasında kullanılan borunun seçimi özellikle önemlidir. Boru, düşük biyo-reaktivite sergileyen tıbbi veya cerrahi kalitede (pirojenik olmayan ve hemolitik olmayan) olmalıdır. Sonuçlarımızda tartışıldığı gibi, deneysel ölçek ve benzersiz tahlil modifikasyonlarına dayalı olarak optimal iş akışını geliştirirken, tekniğin ilk öğrenme aşamalarında oluşan pıhtılarda varyasyon beklenir. Pıhtı mimarisinin fibrinoliz geçirirken pıhtının davranışı üzerindeki etkisi göz önüne alındığında, tekrarlanabilirliğin nihai başarısı çok önemlidir. Son olarak, sağlıklı gönüllüler arasında bile pıhtılaşmadaki çeşitlilik de beklenmelidir ve deneysel tasarım sırasında hesaba katılmalıdır.
RT-FluFF testi Bir belirteç olarak FITC-Fg ile fibrinolizin florometrik/spektrofotometrik miktar tayini, esas olarak son nokta pıhtı kütlesi değerlendirmesine dayanan klasik tekniklere göre çok sayıda fayda sağlar. Fizyolojik akış parametrelerine yaklaşan bir ortamda fibrinoliz dinamiklerini gerçek zamanlı veya neredeyse gerçek zamanlı olarak izleme yeteneği, geleneksel fibrinolitik ilaç tarama testlerinden önemli bir gelişmeyi temsil eder. Bu test, tamamen minyatür bir mikroakışkan yaklaşım benimsemek yerine, klinik olarak ilgili pıhtı boyutlarına, akış alanına, hacimsel akış hızına ve pıhtı kütle yüküne daha yakından benzemek için sunulan ölçekte kasıtlı olarak tasarlanmıştır. RT-FluFF aparatının küçültülmesi, daha küçük çaplı boruların ve/veya daha kısa boru mesafelerinin kullanılması gerektiği anlamına gelir. Sonuç olarak, sistem istenen akış modellerinden ve fizyolojik alaka düzeyinden sapmaya başlayacaktır. Chandler döngüsüne benzer şekilde, RT-FluFF sistemi, sabit akış altında akış basınçlarını modüle ederek kesme hızı gibi parametrelerin kontrolüne ve üzerinde akan ortamın kullanıldığının kontrolüne izin verir. Ek olarak, RT-Fluff sistemi, dönen kapalı çürütme kurulumu nedeniyle bir Chandler döngüsünde mümkün olmayan çürütme işlemi boyunca mobil fazın periyodik olarak örneklenmesine izin verirken, pulsatil akışı ve benzersiz pıhtı çürütme geometrilerini de barındırabilir. Bu parametrelerin pıhtı lizisi üzerindeki etkisi, Zeng ve ark.14'ün bir parçası olarak derinlemesine araştırılmıştır.
Birlikte ele alındığında, Chandler halka biçimli pıhtılar ve RT-FluFF tahlil hortumu, tromboembolizmi taklit etmek için neredeyse tam damar tıkanıklığı boyunca modellenerek, farklı oklüzyon seviyeleri elde etmek için hem pıhtı oluşumu hem de pıhtı sindirim adımlarında aynı çapta olabilir veya değişebilir. Burada açıklanan tüm tahliller, hem Chandler döngüsünde hem de RT-FluFF sisteminde aynı boru çapını kullanmıştır. RT-FluFF sisteminde artan boru çapı ile, sistemi doldurmak için gereken ek hacmi karşılamak için mobil faz rezervuar hacminin artırılması gerekebilir. Rezervuar hacminin arttırılması, sisteme eklenmesi gereken trombolitik/ilaç miktarını da artırabilir ve ayrıca plazma veya mobil faz ihtiyaçlarını da artırabilir. Otolog plazma kullanımı ideal olsa da, tüm bir deneyi tamamlamak için gereken tüm tahliller ve replikasyonlar boyunca Chandler döngü pıhtısı oluşumuna ve RT-FluFF mobil faz hacimlerine uyum sağlamak için bireysel donörlerden son derece büyük miktarlarda kan alınmasını gerektirecektir. Bu nedenle, bir kan bağış merkezinden alınan veya ticari bir satıcıdan satın alınan tip uyumlu havuzlanmış plazma yaygın olarak kullanılmıştır. Genel RT-FluFF tahlil tüpü bir dereceye kadar kısaltılabilirken, tüm bileşenlerin sindirim deneylerini çalıştırmak için döngüde kalmak için yeterli alana sahip olması gibi sınırlamalar vardır. Özellikle önemli olan, pıhtının kendisinin yukarı akışında kullanılan borunun uzun kısmının, boru çapına ve akış hızına göre hesaplanan, laminer akışın asılı pıhtıya ulaşma süresiyle elde edilecek şekilde minimum bir uzunluğu aşması gerektiğidir. Boru boyutu seçiminden bağımsız olarak, Chandler döngü pıhtı oluşumu adımında ayrıntılı olarak açıklanan aynı boru hususları RT-FluFF sistem borularına da uygulanmalıdır. Chandler halkası oluşturan pıhtının, "X" şeklinde yerleştirilmiş iki iğne ile yerine sabitlendiği basınç sensörleri arasındaki borunun, iğne delinme bölgelerinde sızıntıların oluşmasını önlemek için her tahlilden sonra değiştirilmesi gerektiğini tekrarlamak önemlidir. Akış altında sindirim sırasında pıhtıyı yerinde tutmak için iğnelerin kullanılması, pıhtı demetlenmesini sınırlar ve tahlilden tahlile tutarlılığı iyileştirmek için akış yönüne göre pıhtı yönlendirme yetenekleri sağlar. Burada tPA kullanan tek bir temsili pıhtı sindirim denemesi açıklanmış olsa da, Chandler döngüsü ve RT-FluFF testi, yeni fibrinolitikleri test etmek için çok çeşitli pıhtı yapılarına, raportör moleküllere, kesme hızlarına ve sindirim koşullarına uyum sağlamak için yüksek derecede özelleştirilebilirlik sağlar.
Sınırlama Fibrinolitik ilaçları taramak için kullanılan mevcut platformların veya yöntemlerin herhangi birinde olduğu gibi, RT-FluFF testi de kabul edilmesi gereken bazı zayıflıklardan muzdariptir. Birincisi, Chandler döngüsünde oluşan pıhtılar, in-vivo pıhtılarda yaygın olarak bulunan motifler sergilemesine rağmen, pulsatil akışın ve endotel ile etkileşimin mevcut olduğu in-vivo pıhtılardan farklı bir ortamda oluşur17 Ek olarak, FITC-Fg konsantrasyonları pıhtı mimarisi üzerindeki etkileri en aza indirmek için optimize edilmiş olsa da, modifiye fibrinojen ilavesi hala fizyolojik koşullardan bir sapmayı temsil eder. Plazmanın mobil faz ortamı seçimi, donörden donöre değişebilen plazmanın protein ve lipid içeriği ile ilişkili az miktarda arka plan sinyali olacağından, bir florometrenin kullanımını etkileyebilir. RT-FluFF kurulumunun potansiyel olarak önemli bir sınırlaması, RBC'lerin florometrik okumalar üzerindeki olumsuz etkisidir ve bu da FITC'yi floresan pıhtı sindirme belirteci olarak kullanırken WB'nin mobil faz olarak kullanımını kısıtlar. Bunu hafifletmek için uygun bir yöntem, bir spektrofotometrede ayrı zaman noktalarını okumadan önce RBC'leri peletlemek için bir santrifüjleme adımı uygulamak veya RBC'lerin varlığından daha az etkilenen farklı bir pıhtı sindirim raportörü etiketi kullanmaktır18. Önemli değişkenlerin kontrol edildiğinden emin olmak için tahlil tasarımına dayalı olarak dikkatli bir değerlendirme yapılmalıdır. Örneğin, plazma tercih edilen mobil faz ise, donörden donöre pıhtılaşmayı ve fibrinoliz değişkenliğini en aza indirmek için plazmayı birçok donör arasında bir araya getirmek en iyisidir. Son olarak, floresan olarak etiketlenmiş herhangi bir proteinde olduğu gibi, söndürme sorunu, FITC etiketinin fibrinojen19'un yüzeyinde birbirine göreceli olarak yakın olması nedeniyle doğal olarak ortaya çıkar.
Sonuçlar ve gelecekteki yönler Tromboliz gibi dinamik bir süreci incelemek, fizyolojik koşulların tekrarlanabildiği ve birden fazla parametrenin aynı anda kontrol edilebildiği eşit derecede dinamik bir ortam gerektirir. Yüksek kaliteli RT-FluFF sistemi bu boşluğu doldurur ve yeni trombolitiklerin hayvan modellerine çevrilmeden önce gelecekteki geliştirilmesinde ve taranmasında önemli bir araç olarak hizmet edecektir. RT-FluFF, burada tartışılmamış, ancak farmasötik ilaç tasarımının, etki şeklinin veya çeşitli pıhtılaşma hastalığı durumlarının replikasyonunun benzersiz ihtiyaçlarına bağlı olarak protokollere kesinlikle dahil edilebilecek çok yönlü bir platformdur. RT-FluFF sistemi içinde takdir edebildiğimiz faydalar aşağıdaki gibidir: (a) değişken boru geometrileri ve konfigürasyonları, (b) lümen tıkanıklığının derecesi ile ilişkili gerçek zamanlı basınç izleme, (c) kullanıcı müdahalesi gerektirmeyen gerçek zamanlı floresan ölçümleri, (d) tahlil süresi ve numune frekansı esnekliği, (e) in vivo koşulları taklit etmek için bir rezervuar kullanımı, (f) in-vivo benzeri kesme akış modelleri, (g) pulsatil akışı dahil etme seçeneği, (h) farklı hastalık temsilcisi pıhtı analoglarının Chandler döngüsü oluşumunda önemli esneklik, (i) pıhtı oluşumu veya pıhtı sindirimi üzerindeki ilaç etkilerini test etme yeteneği ve (j) şeffaf boru yoluyla toplu pıhtı sindirimini izlemek için doğrudan pıhtı substrat görüntülemesi ayrıca sindirim sonrası sindirime izin verir, Boyuna video analizi.

Temelde tromboembolik etiyolojilerden kaynaklanan hastalıklar günümüz toplumunda önemli bir morbidite ve mortalite kaynağı oluşturmaktadır. Tromboembolik patogenezin belirtileri arasında, bunlarla sınırlı olmamak üzere, miyokard enfarktüsü, iskemik inmeler, derin ven trombozları ve pulmoner emboli1 bulunur. Birden fazla disiplini kapsayan muazzam miktarda devam eden araştırma, patojenik trombozla başa çıkmak için güvenli ve etkili yöntemlerin geliştirilmesi etrafında dönmektedir. Trombozun arteriyel ve venöz bulgularındaki farklılıklar ve değişen anatomik lokalizasyonlar farklı tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, akut tedavi genellikle belirli klinik koşullar altında mekanik trombektomi potansiyeli olan plazminojen aktivatörleri yoluyla farmakolojik tromboliz kullanımına dayanır2.
Yeni farmakolojik tedavi stratejilerinin geliştirilmesi temel olarak hem in-vivo hayvan modellerine hem de klinik öncesi testler için in-vitro sindirim modellerine dayanmaktadır 3,4. İn vivo modeller, farmasötik ajanların temizlenmesinin yanı sıra ilaçlarla hücresel etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik parametrelerin tedavi etkinliği üzerindeki karmaşık etkileşimini yakalama yeteneklerinden doğal olarak yararlanır. Bununla birlikte, bu aynı karmaşıklık genellikle bu tür modelleri oldukça maliyetli hale getirir ve hayvanlarda insan fizyolojisinden önemli ölçüde farklı olan altta yatan farmako-dinamikleri / kinetiği izole etmeye çalışırken ek sorunlar ortaya çıkarır. İn vitro modellerin geliştirilmesi, ilaç geliştirme ve taramanın gerçekleştirilebildiği, ancak genellikle incelenen hastalık durumunu özetlemek için gerekli aslına uygun olmayan damıtılmış bir test ortamının kolaylaştırılmasına yardımcı olmuştur.
Yeni trombolitiklerin test edilmesi için yaygın olarak bulunan in vitro protokoller, statik koşullar altında oluşan ve parçalanan pıhtıların kullanımına dayanır, bu sayede artık pıhtı kütlesi birincil son nokta olarak hizmet eder 5,6. Ne yazık ki, bu tür teknikler, test ilaçlarının farmakodinamiğini önemli ölçüde değiştirebilen türbülanslı akış ve trans-trombüs basınç düşüşleri gibi pıhtı lizizinin mekanik yönlerini hesaba katmamaktadır. Ek olarak, statik koşullar altında oluşan pıhtılar, fizyolojik pıhtılardan farklı mikro mimari içerir. Pıhtı oluşumu sırasında kaymanın varlığının, trombosit aktivasyonu ve fibrin çapraz bağlanması gibi ortaya çıkan pıhtı özelliklerini etkilediği tekrarlanabilir bir şekilde gösterilmiştir. Kesme akışı altında üretilen pıhtılar, statik olarak oluşturulmuş pıhtılarda bulunmayan uçtan kuyruğa karmaşık heterojenlik sergiler 7,8. Fizyolojik pıhtı mimarisinden bu tür sapmalar, bir trombüs içinde ilaç penetrasyonunu ve müteakip lizis etkinliğini içeren önemli ilaç geliştirme karakterizasyonunu etkileyebilir9.
Statik pıhtılaşma/pıhtı parçalama modellerinin kullanımıyla ilişkili bu sınırlamalardan bazılarını ele almak için, kesme varlığında hem pıhtı oluşumu hem de pıhtı lizisi için Chandler döngüsünün benimsenmesi bir canlanma gördü10. Bu tür sistemler, akış dinamiklerinin daha iyi bir temsiline izin vermesine ve nispeten statik tahlillere kıyasla fizyolojik olarak daha ilgili mimariye sahip pıhtılar oluşturmasına rağmen, basitleştirilmiş akış koşulları hala fizyolojik koşullardan bir sapmayı temsil eder. Son olarak, görüntüleme kolaylığı ve tekdüze akış modelleri nedeniyle mikroakışkan yaklaşımlar da gerçekleştirilmiştir; Bununla birlikte, klinik olarak anlamlı tromboembolik bozuklukların çoğunda birincil olarak etkilenen daha büyük damarlarda beklenen fizyolojik koşullardan önemli bir uzaklaştırma olmaya devam etmektedirler11,12.
Yukarıdaki tartışmayı göz önünde bulundurarak, klinik öncesi trombolitik ilaç taraması için yüksek kaliteli, in vitro tromboliz modeli geliştirdik. Model, yeni trombolitik tedavi taraması alanında yukarıda ayrıntıları verilen mevcut tuzaklardan bazılarını ele almayı amaçlamaktadır ve değişen doku plazminojen aktivatörü (tPA) konsantrasyonlarında tekrarlanabilirlik ve duyarlılık açısından doğrulanmıştır. Burada açıklanan sistem, fibrinoliz13'ün gerçek zamanlı takibini kolaylaştırmak için bir peristaltik pompa, bir basınç sönümleyici, ısıtılmış bir rezervuar, iki basınç sensörü, bir hat içi florometre ve floresan etiketli bir Chandler döngü kesme biçimli pıhtı analogu kullanan fizyolojik kesme akışları sunar. Birlikte ele alındığında, genel sistem Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testi (RT-FluFF Testi)14 olarak adlandırılır ve bu el yazması, bu yüksek kaliteli in vitro tromboliz modelinde tahlillerin başarılı bir şekilde kurulması ve yürütülmesinin inceliklerini tartışacaktır.

<table><tbody><tr><td>30 G&nbsp; Tek Kullanımlık Hipodermik İğneler</td><td>Exel International&nbsp;</td><td>26439</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri</td></tr><tr><td>6 mm HSS Torna Çubuğu Stok Aleti 150 mm Uzun</td><td>uxcell</td><td>B07SXGSQ82</td><td>Chandler döngüsü,&nbsp;</td></tr><tr><td>96 Kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı UV Şeffaf Mikroplaka</td><td>Corning</td><td>3635</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri, İşlem görmemiş akrilik kopolimer, steril olmayan</td></tr><tr><td>Air-Tite Luer-lock Steril Olmayan 60 mL Şırıngalar</td><td>Air-Tite</td><td>MLB3</td><td>RT-FluFF Aparatı, sönümleyiciler</td></tr><tr><td>Arium Mini Plus Ultra Saf Su Sistemi</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>DI su kaynağı</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5670</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık BP</td><td>Dönüştürücüler AD Cihazları</td><td>MLT0670</td><td>RT-FluFF Aparatı</td></tr><tr><td>Dräger Siemans HemoMed Pod</td><td>Dräger</td><td>5588822</td><td>RT-FluFF Aparatı</td></tr><tr><td>Dräger Siemans Hasta Monitörü</td><td>Dräger</td><td>SC 7000</td><td>RT-FluFF Aparatı</td></tr><tr><td>Tambur (silindir, çap 120 mm, genişlik 85 mm)</td><td></td><td></td><td>Chandler halkası,</td></tr> <tr><td>Yüz Siperi</td><td>Moxe</td><td>SHIELDS10</td><td>Chandler döngüsü,&nbsp;</td></tr><tr><td>İnsan Plazmasından Fibrinojen, Alexa Fluor 488 Eşlenik</td><td>Thermo Scientific</td><td>F13191</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri</td></tr><tr><td>Bağlantı Elemanı, Polikarbonat, Dört Musluk, Erkek Luer Kilidi, Steril Olmayan Masterflex</td><td></td><td>30600-04</td><td>RT-FluFF Aparatı</td></tr><tr><td>Floresein (FITC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>119245000</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri</td></tr><tr><td>Genel Amaçlı Su Banyosu</td><td>Thermo Scientific</td><td>2839</td><td>Chandler döngüsü,&nbsp;</td></tr><tr><td>Ocak gözü 4 & kez; 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>1152016H</td><td>RT-FluFF Aparatı</td></tr><tr><td>İnsan Kaynaklı Plazma Taze Dondurulmuş</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-SPL</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri, CPDA-1 antikoagülan</td></tr><tr><td>İnsan Tam Kanı&nbsp;</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-WB-SDS&nbsp;</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri, CPDA-1 antikoagülan</td></tr><tr><td>Yüksek Performanslı Hassas Boru için L/S Kolay Yükleme II Pompa Kafası, PPS Muhafazası, SS Rotor</td><td>Masterflex</td><td>77200-62</td><td>RT-FluFF Aparatı, Pompa Kafası</td></tr><tr><td>L/S Uzak G/Ç'li Değişken Hızlı Dijital Tahrikli Pompa, 6 ila 600 rpm; 90 ila 260 VAC</td><td>Masterflex</td><td>7528-10</td><td>RT-FluFF Aparatı, Pompa</td></tr><tr><td>Motoru Hız Kontrol Cihazı</td><td>CoCocina</td><td>ZK-MG</td><td>Chandler döngüsü,&nbsp;</td></tr><tr><td>Nalgene Boru T-Tipi Konnektörler</td><td>Thermo Scientific</td><td>6151-0312</td><td>RT-FluFF Aparatı</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa hortumu&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>06424-15&nbsp;</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3813</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri, Toz, pH 7.4, 1 L çözelti hazırlamak için</td></tr><tr><td>Anahtarlama Güç</td><td>Kaynağı SoulBay</td><td>UC03U</td><td>Chandler döngüsü,&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Ulusal Hedef Tamamen Plastik Tek Kullanımlık Şırıngalar 10 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>S751010</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri</td></tr><tr><td>Doku plazminojen aktivatörü, insan</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0831</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri</td></tr><tr><td>Boru Kimliği 1/4 '', OD 3/8 ''</td><td>Fisher Scientific</td><td>AGL00017</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri, 1,5 cm'lik bölümler halinde kesilmiş boruları T tipi konektörlere</td></tr> <tr><td>bağlamak için kullanınBoru Kimliği 5/32 ", OD 7/32"</td> <td>Tygon</td><td>ND-100-65, ADF 00009 & nbsp;</td><td>Diğer Sarf Malzemeleri</td></tr><tr><td>V3 365 nm Mini - Siyah Işık UV El Feneri</td><td></td><td>uvBeast uvB-V3-365-MINI</td><td>Chandler döngüsü, tamamlanan pıhtıları kontrol etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td><td>Pangyoo</td><td>ZGA37RG</td><td>Chandler döngüsü,&nbsp;</td></tr></tbody></table>

bir İn vitro tromboliz modelinde kesme akışı altında chandler döngü Şeklinde tam kan pıhtılarının fibrinolizinin İzlenmesi

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Tromboembolizm ve ilişkili komplikasyonlar dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen bir nedenidir ve trombolitik ilaç etkinliğini hem in vitro hem de in vivo olarak test etmek için çeşitli testler geliştirilmiştir. Hayvan modelleriyle ilişkili karmaşıklık ve maliyetin yanı sıra genellikle insan fizyolojisine çevrilebilirlik eksikliği nedeniyle, ilaç geliştirme için fizyolojik olarak daha ilgili in vitro pıhtı modellerine yönelik artan bir talep vardır. Akış, basınç ve kayma hızı dolaşım sisteminin önemli özellikleridir ve akış altında oluşan pıhtılar, statik olarak oluşan pıhtılardan farklı morfoloji ve sindirim özellikleri gösterir. Bu faktörler genellikle geleneksel in vitro pıhtı sindirim testlerinde temsil edilmez ve bu da ilaç translasyonel başarı oranlarını etkileyen farmakolojik etkilere sahip olabilir.
Real-T ime Griporometrik Fdüşük Fibrinoliz (RT-FluFF) testi, kesme akışı altında oluşan floresan etiketli pıhtıları kullanan ve daha sonra fibrinolitik farmasötik ajanların varlığında veya yokluğunda dolaşımdaki plazma kullanılarak sindirilen yüksek kaliteli bir tromboliz test platformu olarak geliştirilmiştir. Hem pıhtı oluşumunun hem de pıhtı sindirim adımlarının akış hızlarını değiştirmek, sistemin çok çeşitli deney düzeneklerinde arteriyel, pulmoner ve venöz koşulları taklit etmesine olanak tanır. Ölçümler, bir in-line florometre kullanılarak veya ayrı zaman noktaları alınarak ve ayrıca geleneksel bir son nokta pıhtı kütlesi ölçümü kullanılarak sürekli olarak alınabilir. RT-FluFF testi, bir in vitro test sisteminin kontrolünü ve tekrarlanabilirliğini korurken, in vivo fizyolojik koşulları daha doğru bir şekilde temsil eden akış koşulları altında pıhtı sindiriminin gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin veren esnek bir sistemdir.

Chandler döngü pıhtı oluşumu Pıhtı oluştururken, herhangi bir pıhtı aykırı değeri (brüt morfoloji ve kütleye dayalı) varsa, yine de üçlü tromboliz testleri yapma yeteneğimiz olduğundan emin olmak için genellikle dörtlüleri hedefledik. Optimum yükleme koşulları varsayarsak, pıhtıların tümü uzunluk (~ 3.3 cm), ağırlık (~ 100 mg) ve Şekil 3'te gösterildiği gibi görünüm açısından oldukça eşit olmalıdır. FITC-Fg'yi kullanırken, pıhtı içindeki düzensiz hiper floresan etiketleme alanlarının aksine, floresanın nispeten düzgün dağılımını sağlamak için pıhtıları UV ışığı altında incelemeyi de amaçladık. Tam kandaki FITC-Fg derecesinin değiştirilmesi, araştırılan konsantrasyonlarımızdaki pıhtı ağırlıklarını veya görünümlerini değiştirmemelidir; bununla birlikte, mikro pıhtı mimarisi en yüksek FITC-Fg konsantrasyonlarında (1: 5 FITC-Fg ila değiştirilmemiş Fg) etkilenmiştir. Zeng ve ark. tarafından yapılan önceki çalışmalar, seçilen kesme seviyesine bağlı olarak Chandler döngüsünde beklenen çok çeşitli pıhtı fenotiplerini yakalar16.
Bazen anormal pıhtılaşma meydana gelebilir. En yaygın pıhtı oluşumu sorunları iki kategoriden birine girer: (i) erken pıhtılaşma ve (ii) bozulmuş pıhtılaşma. Erken pıhtılaşmada, tüm kan hacmi Chandler döngü borusu içinde katılaşacaktır. Bu, tambur dönüşü açıldığında belirginleşecektir, çünkü kan "akmayacak", bunun yerine borunun duvarlarına yapışacak ve birlikte dönecektir. Bu gibi durumlarda, bu pıhtılar kullanılamaz ve atılmalıdır. Bunu önlemek için, kalsiyum klorür ilavesiyle pıhtılaşma aktive edildiğinde, döngünün hemen kapatıldığından ve pıhtılaşmanın gerçekleşmesi için dönen tamburun üzerine yerleştirildiğinden emin olun. İkinci durum veya bozulmuş pıhtılaşma, numuneler yeterince karıştırılmadığında veya kan rotasyon başlamadan önce pıhtılaşmaya başladığında ortaya çıkar, ancak durum (i)'deki kadar önemli değildir. Yukarıdaki sorunlara sahip pıhtılar, ele alındığında lifli ve dayanıksız görünme eğiliminde olacaktır ve genellikle önemli ölçüde yüksek pıhtı kütlelerine sahiptir. Fenotipik olarak, çok düşük venöz makaslarda görülen pıhtılara yaklaşırlar, çünkü bu esasen staz ortamında pıhtılaşmayı temsil eder. Düzensiz pıhtılar zaman zaman beklenmeli ve atılmalıdır.
RT-FluFF florometre kalibrasyonu RT-FluFF sisteminin önemli bir özelliği, geçen pıhtı sindirim süresi boyunca trombolizi izlemek için kullanılan florometre veya spektrofotometredir. Herhangi bir deney yapılmadan önce, florometrenin veya spektrofotometrenin düzgün çalıştığından emin olmak çok önemlidir. Amaçlarımız doğrultusunda, florometremizi RT-FluFF aparatı için özel olarak tasarladığımızdan, statik bir çözelti içinde bilinen miktarlarda FITC-Fg seyreltmelerinin varlığında spektrofotometre ile iyi bir şekilde korelasyon göstermesini sağlamamız gerekiyordu (Şekil 4A). Florometremizin doğrusal aralığını güvenle belirleyebildiğimizde, florometrenin akış varlığında nasıl davranacağını görmeyi amaçladık. Florometre okuma tekrarlanabilirliğini daha iyi anlamak ve floresanın akan sistem içinde ne kadar hızlı dengelendiğini belirlemek için floresansta kademeli bir artışı izlemek için akan çözeltiye aşamalı olarak floresan enjekte ederek işlevselliği doğruladık (Şekil 4B). Fibrinoliz deneylerinden beklenen sürekli floresan salınımını daha iyi taklit etmek için hem floresein hem de FITC-Fg'nin çözeltiye sürekli olarak enjekte edilmesiyle takip deneyleri gerçekleştirildi (Şekil 4C). FITC-Fg ve FITC arasında gösterilen eğim farklılıklarının, birçok FITC molekülünün tek bir proteine konjuge edilmesi gibi (bu durumda fibrinojen) gibi, FITC kendisine yakın bir şekilde konjuge edildiğinde meydana gelen su vermenin etkilerinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Doğal olarak, kademeli artışlar ve eğimler sadece kullanılan FITC/FITC-Fg konsantrasyonlarına değil, aynı zamanda fibrinojen başına FITC moleküllerinin sayısına bağlı olarak da farklılık gösterecektir. Ek olarak, çok sayıda pıhtı partisindeki verileri karşılaştırmak umuduyla, RT-FluFF kullanarak deneyler yaparken FITC'den fibrinojen konjugasyonuna derecesini kontrol etmek çok önemli hale gelir. Kapsamlı deneyler sayesinde, fibrinojen başına ~ 14 FITC konjugasyonunun, çözelti içinde stabil kalırken (sınırlı erken agregasyon) ve ortaya çıkan pıhtı mikro yapısı üzerinde minimum etki ile pıhtı sindirimini izlemek için iyi bir floresan sinyali sağladığını bulduk. Saf, pıhtılaşmamış FITC-Fg'nin RT-FluFF aparatından geçirildiği her zaman, FITC-Fg'nin yüksek kesmeye maruz kalmasının agregasyonunu teşvik edebileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu fenomen çoğunlukla boru bağlantılarının birleşim yerlerinde ve pompa kafası borusu içinde gözlenir ve zamanla mevcut çözelti içi floresansı etkileyebilir.
Bir spektrofotometrede floresan okumak için ayrı zaman noktalarında akış döngüsünden numune toplarken, florometre kalibrasyonu ile ilgili bu hususların çoğu gerekli değildir. Bununla birlikte, FITC-Fg etiketlemesini, Chandler döngüsü oluşturan pıhtıdaki FITC-Fg miktarını ve pıhtı boyutunun sisteminizde optimize edilmesini sağlamak için kullanılan spesifik spektrofotometrenin dinamik aralığını keşfetmek hala gereklidir. Numunelerin sistemden izolasyondan hemen sonra okunması veya deneyin tamamlanmasını takiben multipleks okumalar için 96 oyuklu bir plakaya yerleştirilmesi önerilir. Gerekirse, analiz edilmeden önce daha fazla enzimatik aktiviteyi ortadan kaldırmak için numuneler toplandıktan hemen sonra asitleştirilebilir.
RT-FluFF pıhtı lizisi Chandler döngüsünde arteriyel makaslar altında oluşan pıhtıları kullanan RT-FluFF sistemini doğrulamak için, fibrinolitik bir ajan olarak tPA (Alteplaz) ile aparatta mobil faz olarak insan plazması kullandık. Keşfedilen tPA konsantrasyonları 0 ila 1.000 ng / mL arasında değişmektedir. İnsan pulmoner akış koşullarını taklit etmek için, plazma rezervuarının sıcaklığı 37 ° C'de tutuldu ve pıhtı yokluğunda ~ 500 s-1 kesme akışı oluşturacak şekilde pompa hızı ile ortalama 12 mmHg'lik bir akış basıncı vermek üzere fiziksel olarak pıhtı seviyesinin 8 cm üzerine yükseltildi. Neredeyse sabit bir kesme hızı elde etmek için peristaltik pompadan gelen tepe ve oluk basınçları arasında minimum değişiklik sağlamak için sisteme pulsatil akış sönümleyiciler eklendi (Şekil 4D). Basınç sönümleyicinin yokluğunda, peristaltik pompanın çıkış basıncı, pompa kafası dönerken sistemden küçük sıvı paketleri çıkararak akış üretme şeklinin doğası gereği önemli ölçüde dalgalanır. 60 dakika boyunca pıhtı lizisi gözlendi. Beklendiği gibi, artan tPA konsantrasyonları, tPA'nın daha az olduğu veya hiç olmadığı koşullara kıyasla artan pıhtı lizizi oranlarına (RFU / dakika) ve daha yüksek kütle kaybına neden oldu. 1.000 ng / mL'lik bir tPA konsantrasyonunda, 60 dakikalık bir sindirim periyodu boyunca ~% 85 pıhtı lizisi elde edildi. Lizis geçiren pıhtıların brüt görüntüleri incelendiğinde, hem pıhtı mimarisinin fiziksel bozulması hem de yüzey floresan kaybı ile görüldüğü gibi, lizisin öncelikle pıhtının kuyruk bölgelerinde meydana geleceği anlaşılabilir. Pıhtıların beklenen gerilmesi, kesme hızına bağlı bir şekilde zaman içinde mekanik bütünlük kaybına bağlı olarak da meydana gelecektir.
Pıhtı lizis oranlarındaki önemli farklılıklar, brüt olarak ve floresan salınımına dayalı olarak takdir edilebilse de, floresan salınımı ile mevcut fibrinolitik miktarı arasında mükemmel doğrusal bir korelasyon yoktur. Bu en iyi Şekil 5'te takdir edilmektedir. WB bazlı pıhtılardaki fibrinoliz, doğal olarak sadece FITC-Fg fragmanlarının değil, aynı zamanda pıhtı oluşumu sırasında fibrin ağları içinde sıkışıp kalan kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) salınmasına da yol açar. Bu RBC'lerin RT-FluFF aparatı içinde dolaşıma salınması, sonuç olarak dolaşımdaki plazmayı belirgin şekilde kırmızıya boyamaya başlayacaktır. Dolaşımdaki plazmadaki bu kolorimetrik değişiklik, florometre sensörü tarafından okunan dolaşımdaki FITC-Fg'den kaynaklanan floresan emisyonunu olumsuz etkileyebilir. Fibrinolitik konsantrasyonlar üst sınırlara ulaştıkça, FITC-Fg'nin çözeltiye salınma derecesi, floresan emisyonları üzerindeki RBC etkilerini bastırır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig01.jpg"> Şekil 1: Chandler Döngü kurulumunun şematik gösterimi. Chandler döngü tamburuna yüklenen kan dolu tüpler, pıhtı oluşturma süreci boyunca ışıklar karartılarak 37 °C'lik bir su banyosuna daldırılır. Tambur, bir DC motor, tahrik mili ve kontrol panosu aracılığıyla sabit bir dönme hızında döndürülür. Bu rakam Zeng ve ark.14'ten değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig02.jpg"> Şekil 2: RT-FluFF sisteminin şematik gösterimi. Sistemin önemli bileşenleri görüntü üzerinde tanımlanmıştır. Peristaltik pompa kullanımıyla ilişkili akıştaki titreşimleri en aza indirmek için görüntüde tek bir büyük hacimli sönümleyici resmedilmiştir. Hat içi florometrenin yokluğunda, periyodik numune alma için iki ek seçenek şunları içerir: 1) doğrudan rezervuardan numune alma; veya 2) mobil fazı çıkarmak için bir hat içi örnekleme portu dahil etmek. Bu rakam Zeng ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Kısaltma: RT-FluFF = Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig03.jpg"> Şekil 3: Ortam ve UV ışığı altında kütle ve fiziksel görünüm dahil olmak üzere brüt Chandler döngüsü FITC-Fg etiketli WB pıhtı özellikleri. (A) Farklı pıhtılaşma koşulları altında tutarlı pıhtı oluşumu, Chandler döngü pıhtı oluşumu protokolünün ince ayarıyla elde edilebilir. Pıhtı kütlelerinin ve görünümlerinin boru çapına, dönüş hızına ve pıhtı oluşturma süresinin uzunluğuna bağlı olarak önemli ölçüde değişeceğini unutmamak önemlidir. Resimdeki pıhtılar 37 ° C'de 1 saat boyunca 506 s-1'lik bir kesme hızında oluşmuştur. Ölçek çubukları = 20 mm. (B) İlgili FITC-Fg oranları kullanılarak Chandler döngüsünde oluşan pıhtı kütleleri. Veriler, üç kata eşit veya daha büyük veri noktaları için ortalama ± standart sapmayı temsil eder. Bu rakam Zeng ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: FITC-Fg = floresein izotiyosiyanat etiketli fibrinojen; WB = tam kan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig04.jpg"> Şekil 4: Florometre karakterizasyonu. (A) Bilinen miktarlarda FITC-Fg seyreltmeleri bağlamında bir spektrofotometre ile RT-FluFF hat içi florometre karşılaştırması. (B) Akan insan plazmasında florometre tekrarlanabilirliğini ve floresan dengeleme süresini belirlemek için floreseinin RT-FluFF sistemine kademeli olarak sokulması. (C) RT-FluFF platformunda floresein ve FITC-Fg'yi karşılaştıran sürekli infüzyonlar. Eğimdeki farklılıklar muhtemelen FITC-Fg grubundaki floresan söndürmeden kaynaklanmaktadır. (D) Aynı hacimsel akış hızı koşulları altında farklı boyutta sönümleyicilerin kullanımıyla ilişkili çıkış basınç sensörü (pıhtı sonrası) dalga biçimleri. Bu rakam Zeng ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: FITC-Fg = floresein izotiyosiyanat etiketli fibrinojen; RT-FluFF = Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig05.jpg"> Şekil 5: RT-FluFF platformunda tromboliz. (A) Dolaşımdaki tPA varlığında 60 dakikalık pıhtı sindirimi boyunca floresan temsili eğimleri yükselir. Plazminojen ve pıhtı sindiriminin tPA aktivasyonu anlık olmadığı için ilk tromboliz gecikme süresine dikkat edin. (B) Çeşitli tPa konsantrasyonlarında ve aşağıdakileri içeren çeşitli tromboliz modalitelerinde kaybedilen pıhtı kütlesi yüzdesi: RT-FluFF sistemi, sürekli kesme altında Chandler döngü pıhtısı sindirimi ve statik (kayma yok) pıhtı sindirimi. Veriler, 0,01'&lt; bir p değerini ve 0,001'&lt; bir p değerini gösteren üçlü yıldız işaretleriyle üçlü veri noktalarından büyük veya bunlara eşit ± için ortalama standart sapmayı temsil eder. (C) 200 ng / mL tPA'da trombolizin brüt özellikleri. Bu rakam Zeng ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RT-FluFF = Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testi; tPA = doku plazminojen aktivatörü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

İn vitro tromboliz deneyleri, ister model trombüsün sindirildiği ortamda ister trombolizin meydana geldiği ortamda olsun, in vivo koşulları tekrarlamak için sıklıkla mücadele etmiştir. Burada, Chandler döngüsü ve Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testinin (RT-FluFF) birleştirilmesinin yüksek kaliteli, ex-vivo, pıhtı lizisi izleme için nasıl kullanıldığını keşfediyoruz.

Bir İn Vitro Tromboliz Modelinde Kesme Akışı Altında Chandler Döngü Şeklinde Tam Kan Pıhtılarının Fibrinolizinin İzlenmesi

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

Tromboz çok sayıda tıbbi durumla ilişkilidir ve mevcut tedaviler ciddi kanama riski taşır. Dolaşım sistemi akışı kan pıhtı yapısını önemli ölçüde etkiler. Akışı in vitro modellere dahil etmek, fizyolojik alaka düzeylerini artırabilir ve in vivo testler için daha iyi adayların seçimini artırabilir.Fibrinolitiklerin incelenmesi için yapılan tahliller, lizis süresi, pıhtı yapısı veya viskoelastisite gibi özellikleri değerlendirmek için ağırlıklı olarak statik pıhtı veya mikroakışkan sistemleri kullanır. Statik pıhtı lizisi deneyleri, fibrinoliz verimliliğini değerlendirmek için tipik olarak spektrofotometrik ölçümlere veya pıhtı kütlesi tayinine dayanır. Mevcut trombolitik test, akış koşulları altında oluşanlardan yapısal olarak farklı olan statik olarak oluşturulmuş pıhtıları kullanır.Mikroakışkan sistemler akış dinamiklerini dikkate alır, ancak daha küçük ölçekleri benzersiz hemodinamik ve pıhtı yapıları oluşturur. Halihazırda geliştirilen RT-FluFF testi, fizyolojik akış koşulları altında fibrinolizin gerçek zamanlı olarak izlenmesinde kolaylık sağlar. Bu, artık yeni trombolitikleri tararken daha iyi çeviri için in-vivo çalışma modellerine daha yakın koşulları taklit etmek için birden fazla parametre üzerinde kontrole izin veren bir platforma sahip olduğumuz anlamına geliyor.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Farelerde FeCl3 ile indüklenen tromboz modeli burada açıklanmıştır. Mezenterik bir damarda intravital mikroskopi gözlemi ve karotis arterde kan akışı ölçümü ile trombüs büyümesini izlemek için bir yöntem sunulmaktadır.

Ferric Klorür kaynaklı Karotis Arter ve Mezenter Gemi Tromboz Fare Modeli

Biz trombüsler oluşumunu tıkayıcı zaman izlemek için intravital mikroskopi kullanılarak etkin bir şekilde karakterize bir rafine demir klorür (FeCl3) karotis ve mezenterik arter üzerinde indüklenen trombozu modelleri prosedürü yanı sıra damar, rapor.

Ferrik klorit indüklenen fare tromboz modellerinde

Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Fibrin hemostaz ve tromboz sırasında pıhtı oluşumundan sorumludur. Bulanıklık tahlilleri ve tromboelastograhy (TEG) bir pıhtı tamamlayıcı değerlendirme sağlayan sinerjik araçlar olarak kullanılabilir. Bu iki teknik birlikte pıhtılaşma koşulları fibrin pıhtı oluşumunu nasıl etkilediği hakkında daha fazla fikir verebilir.

Tamamlayıcı Pıhtı Karakterizasyonu için Bulanıklık ve Tromboelastografiden Yararlanma

Burada sunulan bir standart in vitro hemodinamik döngü modeli için bir protokoldür. Bu model perfüzyon tüpleri veya vasküler stentlerin hemouyumluluğunun ISO (International Organization for Standardization) standardı 10993-4'e uygun olarak test edilmesine olanak sağlar.

Vasküler Tıbbi Cihazların Hemositokomisyonla uyumluluğunu ve Konak Hücre Aktivasyonunu Araştırmak için Bir In Vitro Hemodinamik Döngü Modeli

Geleneksel fototrombotik inme (PTS) modelleri esas olarak doku plazminojen aktivatörü (tPA) litik tedavisine karşı yüksek dirençli yoğun trombosit agregatlarını indükler. Burada, fotoaktivasyon için trombin ve ışığa duyarlı boyanın birlikte enjekte edilmesiyle modifiye edilmiş bir murin PTS modeli tanıtıldı. Trombin ile zenginleştirilmiş PTS modeli, karışık trombosit:fibrin pıhtıları üretir ve tPA-trombolizine karşı oldukça hassastır.

Fibrin ile zenginleştirilmiş ve tPA'ya duyarlı fototrombotik inme modeli

Histotripsi destekli litik doğum veya lizotripsi derin ven trombozu tedavisi için geliştirilme aşamasındadır. Bu kombinasyon tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için burada bir in vitro prosedür sunulmaktadır. Pıhtı modeli için temel protokoller, görüntü rehberliği ve tedavi etkinliğinin değerlendirilmesi tartışılır.

Histotripsi ve Litik İlacın Trombolitik Etkinliğini Ölçmek için Bir In vitro Sistem

Bu protokol, arteriyel trombozu indüklemek için FeCl3 aracılı bir yaralanmanın nasıl kullanılacağını ve elektron mikroskobu analizi için trombozun çeşitli aşamalarında arteriyel yaralanma örneklerinin nasıl toplanacağını ve hazırlanacağını açıklamaktadır.

Ferrik Klorür Kaynaklı Arteriyel Tromboz ve 3D Elektron Mikroskobu Analizi için Numune Toplama

Bu çalışma, kanda trombus oluşumunu tetiklemek için kesme stresi kullanan ve trombü birden fazla boyutlu okuma ile karakterize eden bir mikrofluidik testi tanımlar. Bu test, kan örneklerinin protrombotik eğilimini ölçebilir ve bu nedenle hastalık teşhisi, ilaç keşfi ve trombozla ilgili temel mekanik çalışmalarda faydalıdır.

Trombus Profilleme Testi: Biyomekanik Trombogenezin Kapsamlı Karakterizasyonu İçin Mikrofluidik Tabanlı Bir Platform

Keşfedin Chandler döngüsü ve RT-FluFF kullanarak tromboliz modellerinde fibrinoliz izleme yöntemlerini. Bu teknik, tromboz tedavileri için fizyolojik koşullara daha yakın sonuçlar elde edilmesini sağlar.

Bir İn Vitro Tromboliz Modelinde Kesme Akışı Altında Chandler Döngü Şeklinde Tam Kan Pıhtılarının Fibrinolizinin İzlenmesi

Daha fazla video keşfet