Name: İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Keşfedin, insan iPS hücrelerinden osteoklast farklılaşması ve karakterizasyonu için güvenilir bir protokol. Bu yöntem, kemik hastalıkları ve doku mühendisliği araştırmalarında osteoklast biyolojisini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, teknik yardım ve destekleri için Giachelli laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. W. M. Keck Mikroskopi Merkezi'ne ve Keck Merkezi yöneticisi Dr. Nathanial Peters'a konfokal mikroskopi ve geniş alan mikroskobu görüntülerinin elde edilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca teknik destek ve yardım için UW Akış Çekirdeği Tesisi ve Akış Çekirdeği Tesisi yöneticisi Aurelio Silvestroni'ye teşekkür ederiz. Son olarak, illüstrasyon ve grafik tasarım konusundaki desteği için Hannah Blümke'ye teşekkür ederiz.
Finansman, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R35 HL139602-01 aracılığıyla sağlandı. Ayrıca, WM Keck Center'daki enstrüman finansmanı için NIH S10 hibesi S10 OD016240'ı ve UW Flow Core Facility'deki enstrüman finansmanı için NIH hibesi 1S10OD024979-01A1'i de kabul ediyoruz.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosunda bulunabilir. Aksi belirtilmedikçe, tüm ortamlar kullanımdan önce 37 °C'ye önceden dengelenmiştir. Tüm santrifüj adımları 37 °C'de ve en yavaş hızlanma/yavaşlama modu kullanılarak gerçekleştirilir. Aksi belirtilmedikçe, süpernatan her zaman tek kullanımlık Pasteur cam pipetler kullanılarak çıkarılır.
1. İnsan iPSC'lerinin çözülmesi ve yayılması
<ol><li>iPSC'lerin çözülmesinden bir gün önce, 200-300 μg/mL konsantrasyonda 1 mL bazal membran ekstresi ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusunu kaplayın. Kuyu plakasını gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Ertesi gün, hücreleri çözün ve bir P1000 pipeti kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Damla damla, 15 mM HEPES ile 5-7 mL DMEM / F-12 ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri santrifüjden nazikçe çıkarın ve hücre peletini rahatsız etmediğinizden emin olun.</li>
	<li>Süpernatanı bir Pasteur cam pipetle dikkatlice çıkarın ve hücreleri geniş delikli P1000 kullanarak 1 mL hiPSC-serum içermeyen ortamda (10 μM Rho kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 içeren hiPSC-SFM) yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bazal membran ekstraktını önceki gün kaplanmış kuyudan aspire edin (adım 1.1) ve 10 μM Y-27632 ile 1 mL hiPSC-SFM'yi kuyuya aktarın. Kuyucuk başına 2 mL'lik bir nihai hacme ulaşmak için kuyuya yeniden askıya alınmış iPSC'ler ekleyin.</li>
	<li>37 °C ve %5CO2'de bir inkübatöre yerleştirmeden önce iPSC agregalarını eşit olarak dağıtmak için plakayı döndürün.</li>
	<li>hiPSC-SFM kullanarak (ROCK inhibitörü Y-27632 eklemeden) her gün tam ortam değişiklikleri gerçekleştirin. iPSC'ler genellikle 3-4 günlük yayılmadan sonra %70-80 birleşmeye ulaşır.</li>
</ol>2. iPSC'leri geçirme
<ol><li>iPSC'leri geçirmeden bir gün önce, 6 oyuklu bir plakanın kuyularını 200-300 μg / mL konsantrasyonda bir bazal membran özü ile kaplayın. Kuyu plakasını gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin. NOT: Hücrelerin yaklaşık% 70-80 birleşmeye ulaştığını onaylayın. iPSC'lerin aşırı birleşmediğinden (%80'den fazla birleşme) emin olun, çünkü bu kendiliğinden farklılaşmayı teşvik edecektir.</li>
	<li>10 μL veya 20 μL pipet uçları veya bir hücre kazıyıcı kullanarak stereomikroskop altında birçok ölü iPSC agregasına sahip farklılaşmış bölgeleri veya bölgeleri çıkararak iPSC'leri geçirmeye başlayın. Farklılaşmış bölgeler daha yoğun veya daha beyaz renkli görünecektir. NOT: Kazınmış hücre agregaları hala kısmen kuyu tabanına yapışabilir.</li>
	<li>Kuyu tabanına kısmen yapışmış olabilecek agregaları çıkarmak için kuyu tabanını geniş çaplı bir P1000 pipetle birkaç kez yıkayın.</li>
	<li>Ayrılmış iPSC agregalarını içeren iPSC'lerin işlendiği harcanan ortamı atın. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Daha sonra, oyuk başına 1 mL 5 U / mL Dispase ekleyin. iPSC kolonilerinin kenarları, oda sıcaklığında 3-5 dakikalık inkübasyondan sonra stereomikroskop altında gözlemlenebilen kuyu plakasından kalkacaktır.</li>
	<li>Hafifçe ayrılmış agregaların yerinden çıkmasını önlemek için Dispase'i dikkatlice çıkarın ve 15 mM HEPES ile 1 mL DMEM/F-12 ekleyin. Agregaları küçük boyutlarda dilimlemek için tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı kullanın. iPSC agrega boyutlarının tutarlılığı, bir kök hücre paslama aracı ile geliştirilebilir.</li>
	<li>Dilimlenmiş iPSC agregalarını kuyudaki besiyeri ile yıkayın ve agregalı besiyerini 5 mL'lik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu P1000 kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.</li>
	<li>İyiliği DMEM / F-12 ile durulayın ve ortamı iPSC agregaları ile 15 mL'lik tüpe aktarın.</li>
	<li>Dilimlenmiş iPSC agregalarını 200 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir Pasteur cam pipetle çıkarın ve 5 mL'lik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlara sahip P1000 kullanarak iPSC'leri yerinden çıkarmak ve yeniden süspanse etmek için 2 mL hiPSC-SFM ekleyin.</li>
	<li>Önceden kaplanmış kuyucuk plakasından/plakalarından kalan bazal membran ekstraktını aspire edin ve 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1 mL hiPSC-SFM ekleyin.</li>
	<li>iPSC'leri, geniş delikli uçlara sahip bir P1000 kullanarak nihai hacim kuyu başına 2 mL hiPSC-SFM olacak şekilde 6 oyuklu bir plakanın yeni kuyucuklarına aktarın. iPSC hattına bağlı olarak, bölme oranlarının optimize edilmesi gerekir. Burada 1:6 bölme oranı kullanılmıştır.</li>
	<li>Stereomikroskop altında yüzen agregalar ve agrega boyutu için kuyuyu kontrol edin. İdeal olarak, agrega boyutu 50-200 μm arasında olmalıdır.</li>
	<li>Agregalar aktarıldıktan sonra hücreleri plaka boyunca eşit olarak dağıtmak için kuyu plakasını döndürün ve 37 ° C'de% 5 CO2'de % 70-80 birleşmeye kadar inkübe edin.</li>
</ol>3. iPSC'lerin dondurulması
<ol><li>iPSC hücrelerini dondurmak için, hücreleri yukarıda açıklandığı gibi pasaj yapın (bkz. protokol adımı "2. iPSC'lerin geçişi"). Hücreler koloniler halinde dilimlendikten ve kuyu dibinden yıkandıktan sonra (adım 2.10), dilimlenmiş agregaları 3 dakika boyunca 200 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>15 mL'lik tüpe 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1 mL serumsuz kriyoprezervasyon ortamı ekleyin ve geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak dilimlenmiş agregaları yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri önceden etiketlenmiş kriyotüplere aktarın. Tüpleri kapatın ve tüpleri 4 °C'de önceden soğutulmuş bir kriyoprezervasyon kabına aktarın. Hücreleri -80 °C'de 24-48 saat saklayın.</li>
	<li>Cryovials'ı uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın. NOT: OC farklılaşma sürecinin şematik bir özeti Şekil 1'de gösterilmektedir.</li>
</ol>4. Embriyoid vücut indüksiyonu
<ol><li>EB indüksiyonu için yukarıda açıklandığı gibi yeterli iPSC'leri geliştirin ve genişletin. NOT: OC üretimi, embriyoid cisimlerin sayısı artırılarak yükseltilebilir ve bu da genel olarak daha yüksek hematopoietik hücre verimi üretir. %70-80 birleşik iPSC'lerden oluşan bir kuyu, 6 oyuklu bir plaka kuyusunun kuyusu başına yaklaşık 8,4 x 105 hücre verir. Bir embriyoid gövdesi oluşturmak için 12.500 tek hücreli iPSC'ye ihtiyaç vardır.</li>
	<li>Harcanan besiyerini iPSC kültürlerinden aspire edin ve iPSC kolonilerini D-PBS ile durulayın.</li>
	<li>6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0,5 mL önceden ısıtılmış oda sıcaklığında tek hücreli ayrışma reaktifi ekleyin ve tüm kuyu yüzeyini kaplamak için kültür kabını döndürün. Kültür kabını 37 °C'de 5-8 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Damarı inkübatörden çıkarın, tek hücreli ayrışma reaktifini aspire edin ve 50 ng/mL insan kemiği morfogenetik proteini 4 (hBMP4), 50 ng/mL insan vasküler endotelyal büyüme faktörü-165 (hVEGF), 20 ng/mL insan kök hücre faktörü (hSCF) içeren hiPSC-serum serbest besiyerinden oluşan kuyucuklara 1 mL Aşama 1 farklılaşma ortamı ekleyin, ve 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Kuyuyu Aşama 1 ortamı ile durulayarak hücreleri nazikçe ayırın. Havuz, iPSC'leri 15 mL'lik konik bir tüpe ayrıştırır.</li>
	<li>Kuyucuklara 1 mL Aşama 1 farklılaşma ortamı ekleyin ve kalan hücreleri yıkayın veya kolayca yıkanmayan koloniler için bir hücre kazıyıcı kullanın.</li>
	<li>Tüm hücreleri tüpe aktardıktan sonra, bir hücre peleti oluşturmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. 5 mL'lik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak toplam 2 mL önceden dengelenmiş Aşama 1 farklılaşma ortamında hücreleri aspire edin ve yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak hücreleri sayın. Ortamı, Aşama 1 farklılaşma ortamının 100 μL'sinde yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu plakada oyuk başına 12.500 hücreye tek hücreli süspansiyonu içeren 15 mL tüpe ekleyin. NOT: Mikroskop altında, hücreler kuyu boyunca dağılmış hücrelerle tek hücreli bir süspansiyon olarak görünecektir.</li>
	<li>96 oyuklu plakaları 100 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreler mikroskop altında bakıldığında sferoidlere benzemeye başlamalıdır. Plakayı 24 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Aşama 1 farklılaşma ortamı ile Gün 1 ve Gün 2'de ortamın yarısını değiştirin. Verimliliği artırmak için, çok kanallı bir pipet kullanarak 50 μL harcanan Aşama 1 farklılaştırma ortamını bir Petri kabına atın.</li>
	<li>Ortamı 96 oyuklu plakadan attıktan sonra, stereomikroskop altında yanlışlıkla çıkarılmış olabilecek EB'leri kontrol edin. Yanlışlıkla çıkarılan EB'leri, geniş delikli uçlara sahip bir P1000 pipet kullanarak 96 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 μL taze Aşama 1 farklılaştırma ortamı ekleyin.</li>
</ol>5. Hematopoetik farklılaşma
<ol><li>Hematopoietik farklılaşmaya başlamadan bir gün önce, 200-300 μg / mL konsantrasyonda 1 mL bazal membran ekstresi ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusunu kaplayın. Kuyu plakasını gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin. NOT: Her kuyu, bu protokolün daha sonraki bir noktasında 8 EB alacaktır. Hazırlanan EB'lerin sayısına bağlı olarak, kuyuları uygun şekilde kaplayın.</li>
	<li>Fazla bazal membran ekstraktını aspire edin ve 6 oyuklu plakanın kuyularını, 2 mM Ultraglutamin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 25 ng / mL insan interlökin 3 (hIL-3) ve 100 ng / mL insan makrofaj koloni uyarıcı faktörün (hM-CSF) eklendiği bir hematopoietik bazal ortamdan oluşan 3 mL Aşama 2 farklılaşma ortamı ile önceden doldurun.</li>
	<li>Geniş delikli uçlara sahip bir P1000 kullanarak, 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 8 EB aktarın. Transferden sonra, gözle veya stereomikroskop altında her kuyucukta 8 EB olduğunu onaylayın. NOT: 1 gün sonra, yüzen EB'ler kuyu dibine yapışacaktır. Takip eden 5-7 gün içinde, hematopoetik hücrelerden oluşan yüzen bir hücre popülasyonu görünür hale gelmelidir. Hematopoetik farklılaşma süresi 7 günden başlayarak değişebilir. 10 gün boyunca farklılaşma, büyük CD45+, CD14+ ve CD11b+ alt popülasyonlarından oluşan hematopoietik bir popülasyon gösterdi.</li>
	<li>Aşama 2 farklılaşma ortamı ile 5 günlük tedaviden sonra, harcanan ortamı çıkararak ve 50 mL'lik konik bir tüpe dağıtarak bir ortam değişikliği gerçekleştirin. Mümkün olduğunca az yüzen hücreyi çıkarmaya çalışmak ve kayma gerilimini mümkün olduğunca düşük tutmak için yavaşça pipetleyin. Stereomikroskop altında pipetleme, hücrelerin yanlışlıkla çıkarılmasını önlemeye yardımcı olabilir.</li>
	<li>Hemen kuyucuklara 1 mL taze Aşama 2 farklılaşma ortamı ekleyin. Farklılaşma sürecinde bu noktada zaten mevcut olabilecek yüzen hematopoietik hücreleri kurtarmak için, dağıtılan ortamı atmayın. Bunun yerine, tüpü harcanan ortam ile 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>Tüpe taze Aşama 2 farklılaşma ortamı ekleyin ve harcanan ortamla aktarılmış olabilecek hücreleri ayırmak için yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Daha önce 1 mL Aşama 2 farklılaşma ortamı ile doldurulmuş olan her bir oyuğa geri kazanılan hücrelerle birlikte 2 mL taze Aşama 2 farklılaşma ortamı ekleyin.</li>
	<li>Hematopoetik farklılaşmanın 10. gününde, çok sayıda yüzen hematopoietik hücrenin varlığını kontrol edin. 50 mL'lik bir tüpte toplayarak hasat edin. % 10 DMSO,% 50 FBS ve% 40 besiyerinde dondurulabilirler veya hücreleri OC'lere ayırmak için hemen kullanılabilirler.</li>
</ol>6. M-CSF olgunlaşması ve OC farklılaşması
<ol><li>200.000 hücre/cm2 konsantrasyonda tohum hücreleri, doku kültürü üzerine iyi muamele edilmiş plakalar ve %10 FBS ve 50 ng/mL hM-CSF ile desteklenmiş alfa-MEM ile muamele edilir.</li>
	<li>Fonksiyonel tahliller veya görüntüleme yapmak için, tohumlamadan 3 gün sonra M-CSF olgunlaşmış hücreleri, geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak önceden ısıtılmış PBS ile 37 °C'ye kadar yıkayarak ayırın. Hücreleri tamamen ayırmak için tekrarlanan yıkama adımları gerekebilir.</li>
	<li>Ayrılan hücreleri, geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Hücre peletini, %10 FBS, 50 ng/mL hM-CSF ve 80 ng/mL hRANKL ile desteklenmiş alfa-MEM'den oluşan OC farklılaşma ortamı ile yeniden süspanse edin ve çözün. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak hücreleri sayın ve M-CSF olgunlaşmış hücreleri, fonksiyonel tahliller veya görüntüleme için uygun bir kültür kabında 200,00-250,000 hücre/cm2 yoğunlukta yeniden tohumlayın (yani, kemik rezorpsiyon deneyleri, görüntüleme için lamel slaytları, vb.).</li>
	<li>OC farklılaşma ortamı ile 7-9 gün boyunca farklılaştırın. Her 2-3 günde bir taze OC diferansiyasyon ortamı ile tam bir kuyu ortamı değişimi gerçekleştirin. NOT: Çok çekirdekli OC'ler tipik olarak 5-7 gün sonra ortaya çıkar.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Bu protokol, iPSC'leri OC'lere ayırmak için güvenilir ve sağlam bir yöntem sunar. Bununla birlikte, farklılaşma süreci boyunca karşılaşılabilecek çeşitli tuzaklar vardır. Farklı doku kökenli hücrelerden üretilen insan iPSC hatları, bu protokol kullanılarak başarılı bir şekilde farklılaştırılmıştır33. iPSC'leri dondururken (bkz. protokol adımı "3. iPSC'lerin dondurulması"), geçiş noktasındaki bir kuyu tekrar bir kriyoviyal olarak donduruldu. Çözdürürken (bkz. protokol adımı "1. İnsan iPSC'lerinin ç...

Osteoklastlar (OK'ler) hematopoetik kaynaklı 1,2, kemik hastalığı araştırmaları 3,4, kanser araştırmaları 5,6, doku mühendisliği 7,8 ve endoprotez araştırmaları 9,10 gibi alanlarda araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan çok yönlü hücre tipleridir. Bununla birlikte, fonksiyonel OC'ler oluşturmak için mononükleer öncüllerin çok çekirdekli OC'lere füzyonu gerektiğinden, OC farklılaşması zor olabilir11. OK farklılaşması için NF-κB ligandının reseptör aktivatörü (RANKL) ve makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) gibi çeşitli biyolojik faktörler gereklidir. M-CSF'nin hücre proliferasyonu, hücre sağkalımı ve RANK ekspresyonu üzerinde olumlu bir etkisi olduğu bildirilmiştir 12,13,14. Öte yandan, RANKL, osteoklastogenezi indükleyen aşağı akış sinyal kaskadlarını aktive eden RANK'a bağlanır. Aktivasyona, NF-kB dimerlerini16,17 bağlayan bir bağlayıcı protein olan B hücreleri inhibitörü, alfa (IκB-α) kappa hafif polipeptit gen arttırıcının nükleer faktörünün bozulmasına yol açan TNF reseptörü ile ilişkili faktör 6 (TRAF6) aracılık eder. Bu nedenle, IκB-α bozunması, daha sonra çekirdeğe yer değiştiren ve transkripsiyon faktörleri c-Fos ve Aktive T-Hücreleri 1'in (NFATc1) Nükleer Faktörünün ekspresyonunu indükleyen NF-kB dimerlerini serbest bırakır. Bu da, çok sayıda OC farklılaşması ile ilgili proteinintranskripsiyonunu tetikler 15,18. DC-Stamp ve Atp6v0d2 gibi yukarı regüle proteinler, OC öncüllerinin hücre-hücre füzyonuna aracılık ederek sinsityum oluşumuna yol açar 19,20,21.
İnsan primer hücreleri ile ilgili olarak, CD34+ ve CD14+ PBMC'ler şu anda OC'lere farklılaşma için en yaygın kullanılan hücre tipleridir22. Bununla birlikte, bu yaklaşım, donörlerden23 toplanan hücrelerin CD34+ popülasyonundaki heterojenlik ve bunların sınırlı genişletilebilirliği ile sınırlıdır. İnsan iPSC'leri, OC'ler için alternatif bir kaynak sunar. Süresiz olarak 24 yayılabildikleri için, OC üretiminin genişletilebilirliğine ve ölçeklendirilmesine izin verirler. Bu, OC araştırmasını kolaylaştıran çok sayıda OC'nin farklılaşmasına izin verir.
iPSC'lerin OC'lere farklılaşması için çeşitli protokoller yayınlanmıştır 25,26,27. Tüm farklılaşma süreci bir iPSC yayılım bölümüne, bir mezodermal ve hematopoietik farklılaşma bölümüne ve OC farklılaşmasına ayrılabilir. iPSC'lerin farklılaşma sürecinden önce yayılması, farklılaşmadan önce OC üretiminin yükseltilmesine olanak tanır. Mezodermal ve hematopoetik farklılaşma ile ilgili çeşitli yaklaşımlar mevcuttur. Geleneksel olarak, hematopoetik hücreleri ayırt etmek için embriyoid cisim (EB) oluşumu kullanılmıştır, ancak tek tabaka tabanlı yaklaşımlar, EB indüksiyonu gerektirmeyen başka bir hematopoietik farklılaşma stratejisini temsil eder. Bununla birlikte, tek katmanlı tabanlı sistemler daha fazla optimizasyon gerektiriyor gibi görünmektedir, çünkü biz ve diğerleri, EB tabanlı yaklaşımların OC'lerin farklılaşması için daha sağlam olduğunu gördük.
Burada, EB tabanlı bir protokol kullanarak OC'lerin insan iPSC'lerinden farkını açıklıyoruz. Bu protokol Rössler ve ark.26'dan uyarlanmış ve farklılaşma işlemi sırasında sağlamlığı artırmak ve kriyoprezervasyona izin vermek için modifiye edilmiştir. İlk olarak, hematopoietik hücreleri 10 günlük farklılaşmadan sonra sadece bir kez topladık. Hematopoetik hücreler daha sonra farklılaşma işlemi sırasında daha fazla esneklik sağlamak için dondurularak saklandı. Ek olarak, OK farklılaşması için hematopoetik hücre tohumlama yoğunluğunu 1 x 105'ten 2 x 105 hücre/cm2'ye çıkardık. Daha yeni bir insan iPSC serumsuz ortam (hiPSC-SFM, Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıldı ve kuyucukların kaplanması% 0.1 jelatin yerine 200-300 μg / mL bazal membran ekstraktı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile gerçekleştirildi. Penisilin / streptomisin medyaya eklenmedi.
Rössler ve ark.26 tarafından yapılan protokol orijinal olarak bir iPSC'den hematopoietik farklılaşma için EB oluşumunu kullanan bir makrofaj farklılaşma protokolü28'e uyarlanmıştır. EB oluşumu araştırmacılar tarafından hematopoetik farklılaşma için uzun süredir kullanılmaktadır29,30, literatürde spontan agregasyon, yuvarlak tabanlı bir kuyu plakasında santrifüjleme, asılı damla kültürü, biyoreaktör kültürü, konik tüp kültürü, yavaş dönen lateral damar ve mikro kalıp jel kültürü gibi çeşitli EB indüksiyon yöntemleri tanımlanmıştır31. Bu protokol, aşağıda açıklandığı gibi, tek iPSC hücrelerini birbirine yaklaştırmak ve küre (EB) oluşumuna izin vermek için ayrışmış iPSC'lerin yuvarlak tabanlı bir kuyu plakasında santrifüjlenmesini kullanır.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - Anti-Katepsin K&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td></td></tr><tr><td>Antikor - APC konjuge Anti-İnsan CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - APC konjuge Fare IgG1, &kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - BV711-konjuge Anti-İnsan CD14</td><td>BD</td><td>563372</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - BV711-konjugatlar Fare IgG2b, & kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD</td><td>563125</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - Keçi Anti-Tavşan IgG H& L Alexa Fluor&reg; 647</td><td>Abcam</td><td>ab150079</td><td></td></tr><tr><td>Antikor - PE konjuge Anti-İnsan CD14</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3832P-025</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PE konjuge Anti-İnsan Integrin alfa M / CD11b</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB16991P-025</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PE-Cy7-konjuge Anti-İnsan CD34</td><td>BD</td><td>560710</td><td></td></tr><tr><td>Antikor - PE-Cy7-konjuge Fare IgG1 & kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PE / Siyanin5 konjuge Anti-İnsan CD11b</td><td>Biolegend</td><td>301308</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PE / Siyanin5 konjuge Fare IgG1, &kappa; Isotype Ctrl</td><td>Biolegend</td><td>400118</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PerCP-Cy5.5-konjuge Fare IgG1 & kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD</td><td>550795</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PerCpCy5.5-konjuge Anti-İnsan CD43</td><td>BD</td><td>563521</td><td></td></tr><tr><td>Kemik Rezorpsiyon Test Kiti</td><td>CosmoBioUSA</td><td>CSR-BRA-24KIT</td><td></td></tr><tr><td>Kontes 3 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>ThermoFisher</td><td>16812556</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Kök Hücre Nitelikli Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Özü</td><td>R& D Sistemler</td><td>3434-010-02</td><td>Bazal membran özü</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>R& D Sistemleri</td><td>5748/10</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (5 U/mL)</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 ile 15 mM</td><td>HEPES Kök Hücre</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Kemik Morfogenetik Protein 4 (hBMP4)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78211</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-3</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78146.1</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör (hM-CSF)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78150.1</td><td></td></tr><tr><td>Nükleer Faktör-&kappa'nın İnsan Çözünür Reseptör Aktivatörü; B Ligand (hsRANKL)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78214.1</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Kök Hücre Faktörü (hSCF)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78155.1</td><td></td></tr><tr><td>İnsan TruStain FcX (Fc Reseptör Bloke Etme Çözeltisi)</td><td>422301</td><td></td> <td>İnsan</td> Vasküler</tr><tr><td>Endotelyal Büyüme Faktörü-165 (hVEGF165)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78073</td><td></td></tr><tr><td>İnvitrojen Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, nükleositler, fenol kırmızısı içermez</td><td>ThermoFisher</td><td>41061029</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>05855</td><td>Serum içermeyen kriyoprezervasyon ortamı</td></tr><tr><td>mTeSR Plus orta</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>100-0276</td><td>İnsan iPSC-serum içermeyen ortam (hiPSC-SFM)</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96-Kuyulu, Nunclon Sphera ile Tedavi Edilmiş, U-Şekilli-Alt Mikroplaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>174925</td><td>Yuvarlak alt ultra düşük bağlantı 96 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>P1000 Geniş Delikli Uçlar</td><td>ThermoFisher</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>KAYA İnhibitörü Y-27632</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>Kök Hücre</td><td>09650</td><td>Hematopoetik hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzim (1X), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher yok</td><td>12563011</td><td>Tek hücreli ayrışma reaktifi</td></tr><tr><td>Ultraglutamin</td><td>Bioscience Lonza</td><td>BE17-605E/U1</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre Ortamı</td><td>Bioscience Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Hematopoietik bazal ortam</td></tr><tr><td>&mikro;-Slayt 8 Kuyulu Yüksek</td><td>Ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden osteoklastların farklılaşması ve karakterizasyonu

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Bu protokol, insan iPSC'lerinin yayılmasını ve geçişini ve bunların osteoklastlara farklılaşmasını detaylandırır. İlk olarak, iPSC'ler, embriyoid vücut indüksiyonunda daha fazla kullanım için tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılır. Mezodermal indüksiyonu takiben, embriyoid cisimler hematopoietik farklılaşmaya uğrar ve yüzen bir hematopoietik hücre popülasyonu üretir. Daha sonra, hasat edilen hematopoietik hücreler bir makrofaj kolonisi uyarıcı faktör olgunlaşma adımına ve son olarak osteoklast farklılaşmasına tabi tutulur. Osteoklast farklılaşmasından sonra, osteoklastlar, metil yeşil nükleer boyama ile birlikte TRAP için boyama ile karakterize edilir. Osteoklastlar çok çekirdekli, TRAP+ polikaryonlar olarak gözlenir. Kimlikleri Katepsin K boyama ile daha da desteklenebilir. Kemik ve mineral rezorpsiyon deneyleri, iyi niyetli osteoklastların kimliğini doğrulayan fonksiyonel karakterizasyona izin verir. Bu protokol, insan osteoklastlarını iPSC'lerden ayırt etmek için sağlam ve çok yönlü bir yöntem gösterir ve büyük miktarlarda fonksiyonel insan osteoklastı gerektiren uygulamalarda kolay benimsenmeye izin verir. Kemik araştırmaları, kanser araştırmaları, doku mühendisliği ve endoprotez araştırmaları alanlarında uygulamalar öngörülebilir.

Farklılaşma süreci boyunca hücre morfolojisinin izlenmesi Aşağıda açıklanan tüm sonuçlar, OC farklılaşması için MCND-TENS2 iPSC hattı kullanılarak oluşturulmuştur. Bu iPSC hattı daha önce çeşitli çalışmalardakullanılmıştır 32,33. Bununla birlikte, diğer iPSC hatları da bu farklılaşma protokolü ile başarıyla kullanılmıştır.
Düzenli görsel değerlendirme, OC'lere farklılaşma süreci boyunca iPSC'lerin farklı ve farklı m...

Bu protokol, insan osteoklastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ayırt edilmesini sunar ve osteoklastların ve osteoklast öncüllerinin karakterizasyonu için yöntemleri açıklar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Giriş.Osteoklastlar, kemik hastalığı araştırmaları, kanser araştırmaları, doku mühendisliği ve endoprotez araştırmaları gibi alanlarda araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan çok çekirdekli bir hücre tipidir. Bununla birlikte, osteoklast farklılaşması zor olabilir, çünkü öncüllerin füzyonu gereklidir. Ek olarak, insan osteoklastlarının IPSC'lerden ayırt edilmesi, doğru zamanda çeşitli biyolojik faktörlerin kullanılmasını gerektirir.İnsan birincil hücreleri söz konusu olduğunda. CD34+periferik kan mononükleer hücreleri, osteoklastlara farklılaşmada şu anda en yaygın kullanılan hücre tipidir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, CD34+ popülasyonu içindeki heterojenlik ve sınırlı genişletilebilirlikleri ile sınırlıdır.İnsan IPSC'leri osteoklastlar için alternatif bir kaynak sunar. Süresiz olarak çoğaltılabildikleri için, osteoklast üretiminin genişletilebilirliğine ve ölçeklendirilmesine izin verirler. Bu, osteoklast araştırmasını kolaylaştıran çok sayıda osteoklastın farklılaşmasına izin verir.Burada, doktora sonrası Alexander Blumke ve doktora öğrencimiz Jessica Simon, osteoklastların insan IPSC'lerinden farklılaşmasını gösteriyor. Bir P-10 veya P-20 pipet ucu veya bir hücre ka

differentiation-characterization-osteoclasts-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Notch sinyali, hücreler arasında doğrudan temasa dayanan bir hücresel iletişim şeklidir. Notch sinyalini in vitro olarak düzgün bir şekilde indüklemek için, Notch ligandları hücrelere hareketsiz bir durumda sunulmalıdır. Bu protokol, fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalinin in vitro stimülasyonu için yöntemleri açıklar.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Embriyodik vücut (EB) oluşumu, fibroblastik hücrelerin genişlemesi ve kondrojenik indüksiyonu içeren entegrasyonsuz bir yöntem kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla insan periferik kandan (PB) bir kondrojenik soy oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Burada, bir protokol indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretimi için Li-Fraumeni sendromu (LFS) hasta türetilmiş fibroblastlar, iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) yoluyla farklılaşma üzerinden dokusunu ve modelleme içinde vivo mevcut LFS hasta kaynaklı dokusunu kullanarak tumorigenesis.

Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Osteoklastlar vücuttaki anahtar kemik emici hücrelerdir. Bu protokol, osteoklastların insan periferik kan monositlerinden in vitro farklılaşması için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntem, homeostazda ve hastalıklarda osteoklast biyolojisini daha iyi anlamak için önemli bir araç olarak kullanılabilir.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Bu protokol, hiPSC'leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC'ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB'ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Mevcut pluripotent kök hücre (PSC)-fonksiyonel hücre farklılaşma sistemleri şu anda ciddi hattan hatta ve partiden partiye değişkenlik sorunları tarafından engellenmektedir. Burada, kardiyak farklılaşmayı ana örnek olarak kullanarak, görüntü tabanlı makine öğrenimine dayalı PSC farklılaşma sürecini akıllıca izlemek ve modüle etmek için bir protokol sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Farklılaşmasını İzlemek için Canlı Hücre Görüntü Tabanlı Makine Öğrenimi Stratejisi

Burada, kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması amacıyla saflaştırılmış kardiyomiyositlerin üretimini sağlayan, küçük molekül modülasyonlu kardiyak farklılaşma ve glikoz yoksunluğu aracılı kardiyomiyosit saflaştırmasını birleştiren insan kardiyomiyosit türevi için sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Keşfedin, insan iPS hücrelerinden osteoklast farklılaşması ve karakterizasyonu için güvenilir bir protokol. Bu yöntem, kemik hastalıkları ve doku mühendisliği araştırmalarında osteoklast biyolojisini anlamaya yardımcı olur.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet