Name: İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Keşfedin, insan iPS hücrelerinden osteoklast farklılaşması ve karakterizasyonu için güvenilir bir protokol. Bu yöntem, kemik hastalıkları ve doku mühendisliği araştırmalarında osteoklast biyolojisini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, teknik yardım ve destekleri için Giachelli laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. W. M. Keck Mikroskopi Merkezi'ne ve Keck Merkezi yöneticisi Dr. Nathanial Peters'a konfokal mikroskopi ve geniş alan mikroskobu görüntülerinin elde edilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca teknik destek ve yardım için UW Akış Çekirdeği Tesisi ve Akış Çekirdeği Tesisi yöneticisi Aurelio Silvestroni'ye teşekkür ederiz. Son olarak, illüstrasyon ve grafik tasarım konusundaki desteği için Hannah Blümke'ye teşekkür ederiz.
Finansman, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R35 HL139602-01 aracılığıyla sağlandı. Ayrıca, WM Keck Center'daki enstrüman finansmanı için NIH S10 hibesi S10 OD016240'ı ve UW Flow Core Facility'deki enstrüman finansmanı için NIH hibesi 1S10OD024979-01A1'i de kabul ediyoruz.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosunda bulunabilir. Aksi belirtilmedikçe, tüm ortamlar kullanımdan önce 37 °C'ye önceden dengelenmiştir. Tüm santrifüj adımları 37 °C'de ve en yavaş hızlanma/yavaşlama modu kullanılarak gerçekleştirilir. Aksi belirtilmedikçe, süpernatan her zaman tek kullanımlık Pasteur cam pipetler kullanılarak çıkarılır.
1. İnsan iPSC'lerinin çözülmesi ve yayılması
<ol><li>iPSC'lerin çözülmesinden bir gün önce, 200-300 μg/mL konsantrasyonda 1 mL bazal membran ekstresi ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusunu kaplayın. Kuyu plakasını gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Ertesi gün, hücreleri çözün ve bir P1000 pipeti kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Damla damla, 15 mM HEPES ile 5-7 mL DMEM / F-12 ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri santrifüjden nazikçe çıkarın ve hücre peletini rahatsız etmediğinizden emin olun.</li>
	<li>Süpernatanı bir Pasteur cam pipetle dikkatlice çıkarın ve hücreleri geniş delikli P1000 kullanarak 1 mL hiPSC-serum içermeyen ortamda (10 μM Rho kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 içeren hiPSC-SFM) yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bazal membran ekstraktını önceki gün kaplanmış kuyudan aspire edin (adım 1.1) ve 10 μM Y-27632 ile 1 mL hiPSC-SFM'yi kuyuya aktarın. Kuyucuk başına 2 mL'lik bir nihai hacme ulaşmak için kuyuya yeniden askıya alınmış iPSC'ler ekleyin.</li>
	<li>37 °C ve %5CO2'de bir inkübatöre yerleştirmeden önce iPSC agregalarını eşit olarak dağıtmak için plakayı döndürün.</li>
	<li>hiPSC-SFM kullanarak (ROCK inhibitörü Y-27632 eklemeden) her gün tam ortam değişiklikleri gerçekleştirin. iPSC'ler genellikle 3-4 günlük yayılmadan sonra %70-80 birleşmeye ulaşır.</li>
</ol>2. iPSC'leri geçirme
<ol><li>iPSC'leri geçirmeden bir gün önce, 6 oyuklu bir plakanın kuyularını 200-300 μg / mL konsantrasyonda bir bazal membran özü ile kaplayın. Kuyu plakasını gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin. NOT: Hücrelerin yaklaşık% 70-80 birleşmeye ulaştığını onaylayın. iPSC'lerin aşırı birleşmediğinden (%80'den fazla birleşme) emin olun, çünkü bu kendiliğinden farklılaşmayı teşvik edecektir.</li>
	<li>10 μL veya 20 μL pipet uçları veya bir hücre kazıyıcı kullanarak stereomikroskop altında birçok ölü iPSC agregasına sahip farklılaşmış bölgeleri veya bölgeleri çıkararak iPSC'leri geçirmeye başlayın. Farklılaşmış bölgeler daha yoğun veya daha beyaz renkli görünecektir. NOT: Kazınmış hücre agregaları hala kısmen kuyu tabanına yapışabilir.</li>
	<li>Kuyu tabanına kısmen yapışmış olabilecek agregaları çıkarmak için kuyu tabanını geniş çaplı bir P1000 pipetle birkaç kez yıkayın.</li>
	<li>Ayrılmış iPSC agregalarını içeren iPSC'lerin işlendiği harcanan ortamı atın. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Daha sonra, oyuk başına 1 mL 5 U / mL Dispase ekleyin. iPSC kolonilerinin kenarları, oda sıcaklığında 3-5 dakikalık inkübasyondan sonra stereomikroskop altında gözlemlenebilen kuyu plakasından kalkacaktır.</li>
	<li>Hafifçe ayrılmış agregaların yerinden çıkmasını önlemek için Dispase'i dikkatlice çıkarın ve 15 mM HEPES ile 1 mL DMEM/F-12 ekleyin. Agregaları küçük boyutlarda dilimlemek için tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı kullanın. iPSC agrega boyutlarının tutarlılığı, bir kök hücre paslama aracı ile geliştirilebilir.</li>
	<li>Dilimlenmiş iPSC agregalarını kuyudaki besiyeri ile yıkayın ve agregalı besiyerini 5 mL'lik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu P1000 kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.</li>
	<li>İyiliği DMEM / F-12 ile durulayın ve ortamı iPSC agregaları ile 15 mL'lik tüpe aktarın.</li>
	<li>Dilimlenmiş iPSC agregalarını 200 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir Pasteur cam pipetle çıkarın ve 5 mL'lik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlara sahip P1000 kullanarak iPSC'leri yerinden çıkarmak ve yeniden süspanse etmek için 2 mL hiPSC-SFM ekleyin.</li>
	<li>Önceden kaplanmış kuyucuk plakasından/plakalarından kalan bazal membran ekstraktını aspire edin ve 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1 mL hiPSC-SFM ekleyin.</li>
	<li>iPSC'leri, geniş delikli uçlara sahip bir P1000 kullanarak nihai hacim kuyu başına 2 mL hiPSC-SFM olacak şekilde 6 oyuklu bir plakanın yeni kuyucuklarına aktarın. iPSC hattına bağlı olarak, bölme oranlarının optimize edilmesi gerekir. Burada 1:6 bölme oranı kullanılmıştır.</li>
	<li>Stereomikroskop altında yüzen agregalar ve agrega boyutu için kuyuyu kontrol edin. İdeal olarak, agrega boyutu 50-200 μm arasında olmalıdır.</li>
	<li>Agregalar aktarıldıktan sonra hücreleri plaka boyunca eşit olarak dağıtmak için kuyu plakasını döndürün ve 37 ° C'de% 5 CO2'de % 70-80 birleşmeye kadar inkübe edin.</li>
</ol>3. iPSC'lerin dondurulması
<ol><li>iPSC hücrelerini dondurmak için, hücreleri yukarıda açıklandığı gibi pasaj yapın (bkz. protokol adımı "2. iPSC'lerin geçişi"). Hücreler koloniler halinde dilimlendikten ve kuyu dibinden yıkandıktan sonra (adım 2.10), dilimlenmiş agregaları 3 dakika boyunca 200 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>15 mL'lik tüpe 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1 mL serumsuz kriyoprezervasyon ortamı ekleyin ve geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak dilimlenmiş agregaları yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri önceden etiketlenmiş kriyotüplere aktarın. Tüpleri kapatın ve tüpleri 4 °C'de önceden soğutulmuş bir kriyoprezervasyon kabına aktarın. Hücreleri -80 °C'de 24-48 saat saklayın.</li>
	<li>Cryovials'ı uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın. NOT: OC farklılaşma sürecinin şematik bir özeti Şekil 1'de gösterilmektedir.</li>
</ol>4. Embriyoid vücut indüksiyonu
<ol><li>EB indüksiyonu için yukarıda açıklandığı gibi yeterli iPSC'leri geliştirin ve genişletin. NOT: OC üretimi, embriyoid cisimlerin sayısı artırılarak yükseltilebilir ve bu da genel olarak daha yüksek hematopoietik hücre verimi üretir. %70-80 birleşik iPSC'lerden oluşan bir kuyu, 6 oyuklu bir plaka kuyusunun kuyusu başına yaklaşık 8,4 x 105 hücre verir. Bir embriyoid gövdesi oluşturmak için 12.500 tek hücreli iPSC'ye ihtiyaç vardır.</li>
	<li>Harcanan besiyerini iPSC kültürlerinden aspire edin ve iPSC kolonilerini D-PBS ile durulayın.</li>
	<li>6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0,5 mL önceden ısıtılmış oda sıcaklığında tek hücreli ayrışma reaktifi ekleyin ve tüm kuyu yüzeyini kaplamak için kültür kabını döndürün. Kültür kabını 37 °C'de 5-8 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Damarı inkübatörden çıkarın, tek hücreli ayrışma reaktifini aspire edin ve 50 ng/mL insan kemiği morfogenetik proteini 4 (hBMP4), 50 ng/mL insan vasküler endotelyal büyüme faktörü-165 (hVEGF), 20 ng/mL insan kök hücre faktörü (hSCF) içeren hiPSC-serum serbest besiyerinden oluşan kuyucuklara 1 mL Aşama 1 farklılaşma ortamı ekleyin, ve 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Kuyuyu Aşama 1 ortamı ile durulayarak hücreleri nazikçe ayırın. Havuz, iPSC'leri 15 mL'lik konik bir tüpe ayrıştırır.</li>
	<li>Kuyucuklara 1 mL Aşama 1 farklılaşma ortamı ekleyin ve kalan hücreleri yıkayın veya kolayca yıkanmayan koloniler için bir hücre kazıyıcı kullanın.</li>
	<li>Tüm hücreleri tüpe aktardıktan sonra, bir hücre peleti oluşturmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. 5 mL'lik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak toplam 2 mL önceden dengelenmiş Aşama 1 farklılaşma ortamında hücreleri aspire edin ve yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak hücreleri sayın. Ortamı, Aşama 1 farklılaşma ortamının 100 μL'sinde yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu plakada oyuk başına 12.500 hücreye tek hücreli süspansiyonu içeren 15 mL tüpe ekleyin. NOT: Mikroskop altında, hücreler kuyu boyunca dağılmış hücrelerle tek hücreli bir süspansiyon olarak görünecektir.</li>
	<li>96 oyuklu plakaları 100 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreler mikroskop altında bakıldığında sferoidlere benzemeye başlamalıdır. Plakayı 24 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Aşama 1 farklılaşma ortamı ile Gün 1 ve Gün 2'de ortamın yarısını değiştirin. Verimliliği artırmak için, çok kanallı bir pipet kullanarak 50 μL harcanan Aşama 1 farklılaştırma ortamını bir Petri kabına atın.</li>
	<li>Ortamı 96 oyuklu plakadan attıktan sonra, stereomikroskop altında yanlışlıkla çıkarılmış olabilecek EB'leri kontrol edin. Yanlışlıkla çıkarılan EB'leri, geniş delikli uçlara sahip bir P1000 pipet kullanarak 96 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 μL taze Aşama 1 farklılaştırma ortamı ekleyin.</li>
</ol>5. Hematopoetik farklılaşma
<ol><li>Hematopoietik farklılaşmaya başlamadan bir gün önce, 200-300 μg / mL konsantrasyonda 1 mL bazal membran ekstresi ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusunu kaplayın. Kuyu plakasını gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin. NOT: Her kuyu, bu protokolün daha sonraki bir noktasında 8 EB alacaktır. Hazırlanan EB'lerin sayısına bağlı olarak, kuyuları uygun şekilde kaplayın.</li>
	<li>Fazla bazal membran ekstraktını aspire edin ve 6 oyuklu plakanın kuyularını, 2 mM Ultraglutamin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 25 ng / mL insan interlökin 3 (hIL-3) ve 100 ng / mL insan makrofaj koloni uyarıcı faktörün (hM-CSF) eklendiği bir hematopoietik bazal ortamdan oluşan 3 mL Aşama 2 farklılaşma ortamı ile önceden doldurun.</li>
	<li>Geniş delikli uçlara sahip bir P1000 kullanarak, 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 8 EB aktarın. Transferden sonra, gözle veya stereomikroskop altında her kuyucukta 8 EB olduğunu onaylayın. NOT: 1 gün sonra, yüzen EB'ler kuyu dibine yapışacaktır. Takip eden 5-7 gün içinde, hematopoetik hücrelerden oluşan yüzen bir hücre popülasyonu görünür hale gelmelidir. Hematopoetik farklılaşma süresi 7 günden başlayarak değişebilir. 10 gün boyunca farklılaşma, büyük CD45+, CD14+ ve CD11b+ alt popülasyonlarından oluşan hematopoietik bir popülasyon gösterdi.</li>
	<li>Aşama 2 farklılaşma ortamı ile 5 günlük tedaviden sonra, harcanan ortamı çıkararak ve 50 mL'lik konik bir tüpe dağıtarak bir ortam değişikliği gerçekleştirin. Mümkün olduğunca az yüzen hücreyi çıkarmaya çalışmak ve kayma gerilimini mümkün olduğunca düşük tutmak için yavaşça pipetleyin. Stereomikroskop altında pipetleme, hücrelerin yanlışlıkla çıkarılmasını önlemeye yardımcı olabilir.</li>
	<li>Hemen kuyucuklara 1 mL taze Aşama 2 farklılaşma ortamı ekleyin. Farklılaşma sürecinde bu noktada zaten mevcut olabilecek yüzen hematopoietik hücreleri kurtarmak için, dağıtılan ortamı atmayın. Bunun yerine, tüpü harcanan ortam ile 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>Tüpe taze Aşama 2 farklılaşma ortamı ekleyin ve harcanan ortamla aktarılmış olabilecek hücreleri ayırmak için yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Daha önce 1 mL Aşama 2 farklılaşma ortamı ile doldurulmuş olan her bir oyuğa geri kazanılan hücrelerle birlikte 2 mL taze Aşama 2 farklılaşma ortamı ekleyin.</li>
	<li>Hematopoetik farklılaşmanın 10. gününde, çok sayıda yüzen hematopoietik hücrenin varlığını kontrol edin. 50 mL'lik bir tüpte toplayarak hasat edin. % 10 DMSO,% 50 FBS ve% 40 besiyerinde dondurulabilirler veya hücreleri OC'lere ayırmak için hemen kullanılabilirler.</li>
</ol>6. M-CSF olgunlaşması ve OC farklılaşması
<ol><li>200.000 hücre/cm2 konsantrasyonda tohum hücreleri, doku kültürü üzerine iyi muamele edilmiş plakalar ve %10 FBS ve 50 ng/mL hM-CSF ile desteklenmiş alfa-MEM ile muamele edilir.</li>
	<li>Fonksiyonel tahliller veya görüntüleme yapmak için, tohumlamadan 3 gün sonra M-CSF olgunlaşmış hücreleri, geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak önceden ısıtılmış PBS ile 37 °C'ye kadar yıkayarak ayırın. Hücreleri tamamen ayırmak için tekrarlanan yıkama adımları gerekebilir.</li>
	<li>Ayrılan hücreleri, geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Hücre peletini, %10 FBS, 50 ng/mL hM-CSF ve 80 ng/mL hRANKL ile desteklenmiş alfa-MEM'den oluşan OC farklılaşma ortamı ile yeniden süspanse edin ve çözün. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak hücreleri sayın ve M-CSF olgunlaşmış hücreleri, fonksiyonel tahliller veya görüntüleme için uygun bir kültür kabında 200,00-250,000 hücre/cm2 yoğunlukta yeniden tohumlayın (yani, kemik rezorpsiyon deneyleri, görüntüleme için lamel slaytları, vb.).</li>
	<li>OC farklılaşma ortamı ile 7-9 gün boyunca farklılaştırın. Her 2-3 günde bir taze OC diferansiyasyon ortamı ile tam bir kuyu ortamı değişimi gerçekleştirin. NOT: Çok çekirdekli OC'ler tipik olarak 5-7 gün sonra ortaya çıkar.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Bu protokol, iPSC'leri OC'lere ayırmak için güvenilir ve sağlam bir yöntem sunar. Bununla birlikte, farklılaşma süreci boyunca karşılaşılabilecek çeşitli tuzaklar vardır. Farklı doku kökenli hücrelerden üretilen insan iPSC hatları, bu protokol kullanılarak başarılı bir şekilde farklılaştırılmıştır33. iPSC'leri dondururken (bkz. protokol adımı "3. iPSC'lerin dondurulması"), geçiş noktasındaki bir kuyu tekrar bir kriyoviyal olarak donduruldu. Çözdürürken (bkz. protokol adımı "1. İnsan iPSC'lerinin çözülmesi ve yayılması"), bir kriyoviyal, 6 oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna çözüldü. Farklı iPSC hatları biraz farklı davranacak ve çoğalma oranları değişecektir. Bölme oranının buna göre ayarlanması gerekecektir.
EB indüksiyonu için iPSC'leri geçirirken veya iPSC'leri tek hücreli bir süspansiyona ayırırken, mezodermal ve hematopoietik farklılaşmanın etkinliğini ve verimliliğini artırmak için kendiliğinden farklılaşmış kolonileri veya ölü hücre agregatlarını çıkarmak önemlidir. Bu, bir hücre kazıyıcı, bir P10 veya P20 pipetinden pipet uçları veya bir Pasteur pipetinden35 yapılmış bir kazıma aleti kullanılarak bir stereomikroskop altında yapılabilir.
Yukarıda bahsedildiği gibi, bu protokol, iPSC kolonilerinin EB indüksiyonu için tek hücreli bir süspansiyona ayrılmasını içerirken, diğer protokollerde iPSC'ler, EB indüksiyonu için santrifüjlenecek agregalar olarak bırakılır36. EB boyutu, hücre sayısı, şekli ve morfolojisinin hepsinin farklılaşmayı etkilediği bildirilmiştir 37,38,39. Bu nedenle, tek hücreli bir süspansiyona ayrışmanın, santrifüjlemeden sonra boyut ve şekil olarak daha iyi EB'den EB'ye homojenliğe ve dolayısıyla hematopoietik hücre üretiminin daha tutarlı sonuçlarına izin verdiğini varsayıyoruz31.
EB indüksiyonu için başka yöntemler de tanımlanmıştır. Hücre sağkalımını iyileştirmek için ROCK inhibitörü ile birlikte tek hücreli bir süspansiyon kullanan bu tür yöntemlerin, EB boyutunu ve farklılaşma sonucunu kontrol etmede avantajlı olduğu bildirilmiştir31.
Bu protokolde açıklanan yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plaka EB indüksiyon yöntemi, EB'lerin büyük ölçekli üretimi için uygundur ve OC üretiminin ölçeklendirilmesine izin verir. Farklılaşma sürecini kolaylaştırma potansiyeline sahip bir embriyoid vücut indüksiyon basamağı olmadan hematopoietik farklılaşma için daha yeni yöntemler yakın zamanda tanımlanmıştır32. Bununla birlikte, OC farklılaşması için bu protokoller henüz oluşturulmamıştır33.
Yukarıda belirtilen protokolde, hematopoetik farklılaşmanın 5. günündeki orta değişikliği tarif ediyoruz. Az sayıda yüzen hücre, farklılaşmanın 4-5. günlerinde ortaya çıkabilir. Yüzen hücrelerin atılmasını önlemek için, ortam bir tüpte toplanmalı ve atılmadan önce santrifüjlenmelidir. Tüpün dibindeki hücre peleti daha sonra taze ortamla birlikte yerinden çıkarılmalı ve 6 oyuklu bir plakanın kuyularına geri aktarılmalıdır. Bununla birlikte, OC farklılaşmasında erken yüzen hücre popülasyonunun öneminin hala belirlenmesi gerekmektedir.
Hematopoetik hücrelerin üretimi akış sitometrisi kullanılarak değerlendirilebilir. Osteoklast farklılaşması için CD45+, CD14+ ve CD11b+ hücrelerinin yüksek verimleri arzu edilir33. Hasat edilen yüzen hematopoietik hücrelerin dondurularak saklanmasının, genellikle sınırlı geri kazanım oranları ve düşük hücre canlılığı ile zor olduğu bildirilmiştir40,41. Hematopoietik hücreleri, serumsuz hematopoietik hücre genişleme ortamının %50'sinden oluşan bir kriyoprezervasyon ortamında dondurarak (bkz. Malzeme Tablosu), %40 FBS ve %10 DMSO'dan oluşan bir kriyoprezervasyon ortamında, çözülme sonrası yaklaşık %90.3 ± 2.62 SD (n = 7) hücre canlılığına sahip hücreleri geri kazanabildik.
Osteoklastogenez, mineral ve kemik rezorpsiyonu yapabilen çok çekirdekli osteoklastlar oluşturmak için çoklu mononükleasyonlu OC öncüllerinin füzyonunu gerektirir. Murin OC-öncü hücre hatları, OC oluşumunu indüklemek için sadece RANKL ilavesine ihtiyaç duyarken,42, insan öncülleri, hücre sağkalımı ve proliferasyonu için ek M-CSF gerektirir43. OSCAR yakın zamanda OC farklılaşmasında rol oynayan ek bir reseptör olarak keşfedilmiştir, ancak şimdiye kadar sadece tip I kollajen bir ligand olarak tanımlanmıştır. OSCAR'ın iPSC'den türetilmiş OC'lerle araştırılması hala sınırlı olsa da, bir murin hücre hattındaki suprafizyolojik in vitro RANKL ve M-CSF konsantrasyonları, OSCAR aktivasyonu gerekliliğini atlıyor gibi görünmektedir44, OSCAR'ın in vivo aktivasyonu, osteoklastogenez için gerekli bir uyarıcı sinyal gibi görünmektedir45. Dikkate alınması gereken ek bir faktör, kuyu plakası yüzeyidir. Kimyasal46 ve fiziksel47 yüzey özelliklerinin osteoklast farklılaşmasını etkilediği bilinmektedir ve başarılı farklılaşmayı teşvik edebilir veya engelleyebilir. CD47 ve DC-STAMP gibi farklı füzyonla ilişkili faktörler osteoklast füzyonunun farklı aşamalarında hareket ettiğinden, öncü popülasyon içindeki belirli bir heterojenlik de OC'lerin başarılı füzyonu için kritik görünmektedir48.
Sonuç olarak, bu protokol, OC araştırmalarını kolaylaştırmak ve hızlandırmak için insan OC'sinin iPSC'lerden ayırt edilmesini sağlar.

Osteoklastlar (OK'ler) hematopoetik kaynaklı 1,2, kemik hastalığı araştırmaları 3,4, kanser araştırmaları 5,6, doku mühendisliği 7,8 ve endoprotez araştırmaları 9,10 gibi alanlarda araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan çok yönlü hücre tipleridir. Bununla birlikte, fonksiyonel OC'ler oluşturmak için mononükleer öncüllerin çok çekirdekli OC'lere füzyonu gerektiğinden, OC farklılaşması zor olabilir11. OK farklılaşması için NF-κB ligandının reseptör aktivatörü (RANKL) ve makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) gibi çeşitli biyolojik faktörler gereklidir. M-CSF'nin hücre proliferasyonu, hücre sağkalımı ve RANK ekspresyonu üzerinde olumlu bir etkisi olduğu bildirilmiştir 12,13,14. Öte yandan, RANKL, osteoklastogenezi indükleyen aşağı akış sinyal kaskadlarını aktive eden RANK'a bağlanır. Aktivasyona, NF-kB dimerlerini16,17 bağlayan bir bağlayıcı protein olan B hücreleri inhibitörü, alfa (IκB-α) kappa hafif polipeptit gen arttırıcının nükleer faktörünün bozulmasına yol açan TNF reseptörü ile ilişkili faktör 6 (TRAF6) aracılık eder. Bu nedenle, IκB-α bozunması, daha sonra çekirdeğe yer değiştiren ve transkripsiyon faktörleri c-Fos ve Aktive T-Hücreleri 1'in (NFATc1) Nükleer Faktörünün ekspresyonunu indükleyen NF-kB dimerlerini serbest bırakır. Bu da, çok sayıda OC farklılaşması ile ilgili proteinintranskripsiyonunu tetikler 15,18. DC-Stamp ve Atp6v0d2 gibi yukarı regüle proteinler, OC öncüllerinin hücre-hücre füzyonuna aracılık ederek sinsityum oluşumuna yol açar 19,20,21.
İnsan primer hücreleri ile ilgili olarak, CD34+ ve CD14+ PBMC'ler şu anda OC'lere farklılaşma için en yaygın kullanılan hücre tipleridir22. Bununla birlikte, bu yaklaşım, donörlerden23 toplanan hücrelerin CD34+ popülasyonundaki heterojenlik ve bunların sınırlı genişletilebilirliği ile sınırlıdır. İnsan iPSC'leri, OC'ler için alternatif bir kaynak sunar. Süresiz olarak 24 yayılabildikleri için, OC üretiminin genişletilebilirliğine ve ölçeklendirilmesine izin verirler. Bu, OC araştırmasını kolaylaştıran çok sayıda OC'nin farklılaşmasına izin verir.
iPSC'lerin OC'lere farklılaşması için çeşitli protokoller yayınlanmıştır 25,26,27. Tüm farklılaşma süreci bir iPSC yayılım bölümüne, bir mezodermal ve hematopoietik farklılaşma bölümüne ve OC farklılaşmasına ayrılabilir. iPSC'lerin farklılaşma sürecinden önce yayılması, farklılaşmadan önce OC üretiminin yükseltilmesine olanak tanır. Mezodermal ve hematopoetik farklılaşma ile ilgili çeşitli yaklaşımlar mevcuttur. Geleneksel olarak, hematopoetik hücreleri ayırt etmek için embriyoid cisim (EB) oluşumu kullanılmıştır, ancak tek tabaka tabanlı yaklaşımlar, EB indüksiyonu gerektirmeyen başka bir hematopoietik farklılaşma stratejisini temsil eder. Bununla birlikte, tek katmanlı tabanlı sistemler daha fazla optimizasyon gerektiriyor gibi görünmektedir, çünkü biz ve diğerleri, EB tabanlı yaklaşımların OC'lerin farklılaşması için daha sağlam olduğunu gördük.
Burada, EB tabanlı bir protokol kullanarak OC'lerin insan iPSC'lerinden farkını açıklıyoruz. Bu protokol Rössler ve ark.26'dan uyarlanmış ve farklılaşma işlemi sırasında sağlamlığı artırmak ve kriyoprezervasyona izin vermek için modifiye edilmiştir. İlk olarak, hematopoietik hücreleri 10 günlük farklılaşmadan sonra sadece bir kez topladık. Hematopoetik hücreler daha sonra farklılaşma işlemi sırasında daha fazla esneklik sağlamak için dondurularak saklandı. Ek olarak, OK farklılaşması için hematopoetik hücre tohumlama yoğunluğunu 1 x 105'ten 2 x 105 hücre/cm2'ye çıkardık. Daha yeni bir insan iPSC serumsuz ortam (hiPSC-SFM, Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıldı ve kuyucukların kaplanması% 0.1 jelatin yerine 200-300 μg / mL bazal membran ekstraktı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile gerçekleştirildi. Penisilin / streptomisin medyaya eklenmedi.
Rössler ve ark.26 tarafından yapılan protokol orijinal olarak bir iPSC'den hematopoietik farklılaşma için EB oluşumunu kullanan bir makrofaj farklılaşma protokolü28'e uyarlanmıştır. EB oluşumu araştırmacılar tarafından hematopoetik farklılaşma için uzun süredir kullanılmaktadır29,30, literatürde spontan agregasyon, yuvarlak tabanlı bir kuyu plakasında santrifüjleme, asılı damla kültürü, biyoreaktör kültürü, konik tüp kültürü, yavaş dönen lateral damar ve mikro kalıp jel kültürü gibi çeşitli EB indüksiyon yöntemleri tanımlanmıştır31. Bu protokol, aşağıda açıklandığı gibi, tek iPSC hücrelerini birbirine yaklaştırmak ve küre (EB) oluşumuna izin vermek için ayrışmış iPSC'lerin yuvarlak tabanlı bir kuyu plakasında santrifüjlenmesini kullanır.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - Anti-Katepsin K&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td></td></tr><tr><td>Antikor - APC konjuge Anti-İnsan CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - APC konjuge Fare IgG1, &kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - BV711-konjuge Anti-İnsan CD14</td><td>BD</td><td>563372</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - BV711-konjugatlar Fare IgG2b, & kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD</td><td>563125</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - Keçi Anti-Tavşan IgG H& L Alexa Fluor&reg; 647</td><td>Abcam</td><td>ab150079</td><td></td></tr><tr><td>Antikor - PE konjuge Anti-İnsan CD14</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3832P-025</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PE konjuge Anti-İnsan Integrin alfa M / CD11b</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB16991P-025</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PE-Cy7-konjuge Anti-İnsan CD34</td><td>BD</td><td>560710</td><td></td></tr><tr><td>Antikor - PE-Cy7-konjuge Fare IgG1 & kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PE / Siyanin5 konjuge Anti-İnsan CD11b</td><td>Biolegend</td><td>301308</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PE / Siyanin5 konjuge Fare IgG1, &kappa; Isotype Ctrl</td><td>Biolegend</td><td>400118</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PerCP-Cy5.5-konjuge Fare IgG1 & kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD</td><td>550795</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru - PerCpCy5.5-konjuge Anti-İnsan CD43</td><td>BD</td><td>563521</td><td></td></tr><tr><td>Kemik Rezorpsiyon Test Kiti</td><td>CosmoBioUSA</td><td>CSR-BRA-24KIT</td><td></td></tr><tr><td>Kontes 3 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>ThermoFisher</td><td>16812556</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Kök Hücre Nitelikli Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Özü</td><td>R& D Sistemler</td><td>3434-010-02</td><td>Bazal membran özü</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>R& D Sistemleri</td><td>5748/10</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (5 U/mL)</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 ile 15 mM</td><td>HEPES Kök Hücre</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Kemik Morfogenetik Protein 4 (hBMP4)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78211</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-3</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78146.1</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör (hM-CSF)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78150.1</td><td></td></tr><tr><td>Nükleer Faktör-&kappa'nın İnsan Çözünür Reseptör Aktivatörü; B Ligand (hsRANKL)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78214.1</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Kök Hücre Faktörü (hSCF)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78155.1</td><td></td></tr><tr><td>İnsan TruStain FcX (Fc Reseptör Bloke Etme Çözeltisi)</td><td>422301</td><td></td> <td>İnsan</td> Vasküler</tr><tr><td>Endotelyal Büyüme Faktörü-165 (hVEGF165)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>78073</td><td></td></tr><tr><td>İnvitrojen Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, nükleositler, fenol kırmızısı içermez</td><td>ThermoFisher</td><td>41061029</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>05855</td><td>Serum içermeyen kriyoprezervasyon ortamı</td></tr><tr><td>mTeSR Plus orta</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>100-0276</td><td>İnsan iPSC-serum içermeyen ortam (hiPSC-SFM)</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96-Kuyulu, Nunclon Sphera ile Tedavi Edilmiş, U-Şekilli-Alt Mikroplaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>174925</td><td>Yuvarlak alt ultra düşük bağlantı 96 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>P1000 Geniş Delikli Uçlar</td><td>ThermoFisher</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>KAYA İnhibitörü Y-27632</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>Kök Hücre</td><td>09650</td><td>Hematopoetik hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzim (1X), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher yok</td><td>12563011</td><td>Tek hücreli ayrışma reaktifi</td></tr><tr><td>Ultraglutamin</td><td>Bioscience Lonza</td><td>BE17-605E/U1</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre Ortamı</td><td>Bioscience Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Hematopoietik bazal ortam</td></tr><tr><td>&mikro;-Slayt 8 Kuyulu Yüksek</td><td>Ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden osteoklastların farklılaşması ve karakterizasyonu

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Bu protokol, insan iPSC'lerinin yayılmasını ve geçişini ve bunların osteoklastlara farklılaşmasını detaylandırır. İlk olarak, iPSC'ler, embriyoid vücut indüksiyonunda daha fazla kullanım için tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılır. Mezodermal indüksiyonu takiben, embriyoid cisimler hematopoietik farklılaşmaya uğrar ve yüzen bir hematopoietik hücre popülasyonu üretir. Daha sonra, hasat edilen hematopoietik hücreler bir makrofaj kolonisi uyarıcı faktör olgunlaşma adımına ve son olarak osteoklast farklılaşmasına tabi tutulur. Osteoklast farklılaşmasından sonra, osteoklastlar, metil yeşil nükleer boyama ile birlikte TRAP için boyama ile karakterize edilir. Osteoklastlar çok çekirdekli, TRAP+ polikaryonlar olarak gözlenir. Kimlikleri Katepsin K boyama ile daha da desteklenebilir. Kemik ve mineral rezorpsiyon deneyleri, iyi niyetli osteoklastların kimliğini doğrulayan fonksiyonel karakterizasyona izin verir. Bu protokol, insan osteoklastlarını iPSC'lerden ayırt etmek için sağlam ve çok yönlü bir yöntem gösterir ve büyük miktarlarda fonksiyonel insan osteoklastı gerektiren uygulamalarda kolay benimsenmeye izin verir. Kemik araştırmaları, kanser araştırmaları, doku mühendisliği ve endoprotez araştırmaları alanlarında uygulamalar öngörülebilir.

Farklılaşma süreci boyunca hücre morfolojisinin izlenmesi Aşağıda açıklanan tüm sonuçlar, OC farklılaşması için MCND-TENS2 iPSC hattı kullanılarak oluşturulmuştur. Bu iPSC hattı daha önce çeşitli çalışmalardakullanılmıştır 32,33. Bununla birlikte, diğer iPSC hatları da bu farklılaşma protokolü ile başarıyla kullanılmıştır.
Düzenli görsel değerlendirme, OC'lere farklılaşma süreci boyunca iPSC'lerin farklı ve farklı morfolojik özelliklerini ortaya koymaktadır (Şekil 2). iPSC kolonileri (Şekil 2A), santrifüjlemeden önce yuvarlak alt kuyu plakası boyunca ayrı hücreler olarak görünen tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırıldı (Şekil 2B). Santrifüjlemeyi takiben (protokolde adım 4.9), hücreler yuvarlak tabanlı ultra düşük bağlantı kuyusu plakasının merkezinde toplanacak ve daha sonra küreler oluşturacaktır (embriyoid cisimler, EB'ler, Şekil 2C). EB'ler mezodermal farklılaşma süreci boyunca iki ila üç kat artacak (Şekil 2D) ve 4 günlük farklılaşma süresinin sonunda gözle kolayca görülebilir hale gelecektir (Şekil 2E). EB'lerin, hematopoietik farklılaşma için 6 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına transferini takiben kuyu plakası tabanına yapıştığı ve kaynaştığı görülebilir (protokoldeki adım 5.3, Şekil 2F). 7-8 gün sonra, kültür ortamında büyük miktarlarda yüzen hematopoietik hücreler görünür hale gelir (Şekil 2G). Hematopoietik hücrelerin toplanması ve yeniden kaplanmasından sonra, bir M-CSF olgunlaşma aşaması takip eder ve OC farklılaşması başlatılır (protokolde adım 6.4). 5-6 gün içinde, büyük bir saydam hücre gövdesine sahip çok çekirdekli hücreler önce görünür hale gelir (Şekil 2H). Bu aşamada çok sayıda mononükleer hücre hala görülebilir. 2-3 gün daha OC farklılaşmasından sonra, OC'ler daha fazla çekirdeğe sahip büyük polikaryonlar oluşturmak için bitişik hücrelerle daha da kaynaşacaktır (Şekil 2I).
EB kaynaklı hematopoietik popülasyonun değerlendirilmesi Hematopoetik diferansiyasyon değişken bir süre boyunca gerçekleştirilebilir. Literatürde 7 günden başlayıp 9 haftaya kadar olan süreler tanımlanmıştır. Bu protokolde 10 gün süreyle hematopoetik diferansiyasyon yapılır. 10 günlük hematopoietik farklılaşmanın düşük sayıda erken CD34+ (%0.53, Şekil 3A) ve daha fazla sayıda orta dönem CD43+ (H.5, Şekil 3B) hematopoietik progenitör verdiğini bulduk. Daha da önemlisi, 10 günlük bir tedavi süresinden sonra yeterli miktarda CD45+ <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig04large.jpg" target="_blank"></a>

Bu protokol, insan osteoklastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ayırt edilmesini sunar ve osteoklastların ve osteoklast öncüllerinin karakterizasyonu için yöntemleri açıklar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Giriş.Osteoklastlar, kemik hastalığı araştırmaları, kanser araştırmaları, doku mühendisliği ve endoprotez araştırmaları gibi alanlarda araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan çok çekirdekli bir hücre tipidir. Bununla birlikte, osteoklast farklılaşması zor olabilir, çünkü öncüllerin füzyonu gereklidir. Ek olarak, insan osteoklastlarının IPSC'lerden ayırt edilmesi, doğru zamanda çeşitli biyolojik faktörlerin kullanılmasını gerektirir.İnsan birincil hücreleri söz konusu olduğunda. CD34+periferik kan mononükleer hücreleri, osteoklastlara farklılaşmada şu anda en yaygın kullanılan hücre tipidir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, CD34+ popülasyonu içindeki heterojenlik ve sınırlı genişletilebilirlikleri ile sınırlıdır.İnsan IPSC'leri osteoklastlar için alternatif bir kaynak sunar. Süresiz olarak çoğaltılabildikleri için, osteoklast üretiminin genişletilebilirliğine ve ölçeklendirilmesine izin verirler. Bu, osteoklast araştırmasını kolaylaştıran çok sayıda osteoklastın farklılaşmasına izin verir.Burada, doktora sonrası Alexander Blumke ve doktora öğrencimiz Jessica Simon, osteoklastların insan IPSC'lerinden farklılaşmasını gösteriyor. Bir P-10 veya P-20 pipet ucu veya bir hücre kazıyıcı kullanarak stereomikroskop altında birçok ölü IPSC agregası olan farklılaşmış bölgeleri veya bölgeleri çıkararak IPSC'leri geçirmeye başlayın. Farklılaşmış bölgeler daha yoğun ve daha beyaz renkte görünecektir.Ayrılmış hücreleri eski ortamla yıkayın, ardından kalan ayrılmış hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, kuyuya kuyu başına mililitre dispas başına bir mililitre beş birim ekleyin. Çanak yerden kalkan kolonilerin kenarları üç ila beş dakika sonra stereomikroskop altında gözlemlenebilir.Dispaseyi dikkatlice çıkarın ve 15 milimolar HEPES ile bir mililitre DMEM / F-12 ekleyin. Agregaları küçük boyutta kesmek için bir kök hücre pasaj aracı veya tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı kullanın. Ortamı agregalarla birlikte beş mililitrelik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu bir P-1000 kullanarak 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.İyiliği DMEM / F-12 ile durulayın ve ortamı 15 mililitrelik tüpe aktarın. Dilimlenmiş IPSC agregalarını 200 G'de üç dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir Pasteur cam pipetle çıkarın ve beş mililitrelik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu P-1000 kullanarak IPSC'leri yerinden çıkarmak ve yeniden süspanse etmek için iki mililitre insan IPSC serumsuz ortam ekleyin.Önceden kaplanmış kuyucuk plakalarından kalan bazal membran ekstraktını aspire edin ve altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna bir mililitre insan IPSC serumsuz ortam ekleyin. IPSC'leri altı oyuklu bir plakanın yeni kuyularına aktarın, böylece nihai hacim, geniş delikli uçlara sahip bir P-1000 kullanarak kuyu başına iki mililitre insan IPSC serumsuz ortam olur. IPSC hattına bağlı olarak, bölme oranlarının optimize edilmesi gerekir.Burada 1:6 bölme oranı kullanılmıştır. Agregalar aktarıldıktan sonra hücreleri plaka boyunca eşit olarak dağıtmak için kuyu plakasını döndürün. Embriyoid vücut indüksiyonu.Eski ortamı IPSC kültürlerinden aspire edin ve kuyucukları DPBS ile durulayın. Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna oda sıcaklığına yarım mililitre önceden ısıtılmış ekleyin ve tüm kuyu yüzeyini kaplamak için kültür kabını döndürün. Kültür kabını 37 ° C'de beş ila sekiz dakika inkübe edin.Kabı inkübatörden çıkarın, çözeltiyi aspire edin ve mililitre insan kemiği morfojenik protein 4 başına 50 nanogram, mililitre insan vasküler endotelyal büyüme faktörü 165 başına 50 nanogram, mililitre insan kök hücre faktörü başına 20 nanogram ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü Y-27632'den oluşan kuyucuklara birinci aşama ortamı ekleyin. Kuyuyu birinci aşama ortamıyla durulayarak hücreleri nazikçe ayırın. Hücreleri konik bir tüpe çekin.Kuyulara yeni aşama bir ortam ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak kalan hücreleri ayırın. Tüm hücreleri tüpe aktardıktan sonra, hücreleri peletlemek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Hücreleri toplam iki mililitre önceden dengelenmiş birinci aşama ortamında aspire edin ve yeniden süspanse edin.Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak hücreleri sayın Tohum 12, 500 mikrolitre birinci aşama ortamında yuvarlak tabanlı ultra düşük ekli 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 100 hücre. Mikroskop altında, hücreler çözelti boyunca dağınık olarak görünecektir. 96 oyuklu plakaları 100 G'de üç dakika santrifüjleyin Santrifüjlemeden sonra, hücreler mikroskop altında bakıldığında sferoidlere benzemeye başlamalıdır.Plakayı 37 derece C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Birinci aşama medya ile birinci gün ve ikinci gün ortamın yarısını değiştirin. Eski ortamı bir Petri kabına atmak için çok kanallı bir pipet kullanın.Medyayı 96 oyuklu plakadan attıktan sonra, yanlışlıkla çıkarılmış olabilecek EB'leri kontrol edin. Petri kabında yanlışlıkla çıkarılan EB'leri bir P-1000 pipet Hematopoietik farklılaşması kullanarak geri aktarın. İki milimolar ultraglutamin, 55-mikromolar beta-merkaptoetanol, mililitre başına 25 nanogram, insan interlökin-3 ve mililitre başına 100 nanogram insan makrofaj kolonisi uyarıcı faktörün eklendiği üç mililitre ikinci aşama ortamı ile altı oyuklu bir plakanın kuyularını önceden doldurun.Bir P-1000 ve geniş delikli uç kullanarak, altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna sekiz EB aktarın. Aktardıktan sonra, stereo mikroskop altında her kuyucukta sekiz EB olup olmadığını gözle kontrol edin. Beş ila yedi gün sonra, hematopoetik hücrelerden oluşan yüzen bir hücre popülasyonu görünür hale gelmelidir.Hematopoetik farklılaşma süresi yedi günden başlayarak değişebilir. 10 gün boyunca farklılaşma, büyük CD45 + CD14 + ve CD11b + alt popülasyonlarından oluşan hematopoietik bir popülasyon gösterdi. İkinci aşama besiyeri ile beş günlük tedaviden sonra, eski besiyerini dikkatlice çıkararak ve 50 mililitrelik konik bir tüpe dağıtarak orta bir değişiklik yapın.Hemen kuyucuklara bir mililitre yeni aşama iki ortam ekleyin. Halihazırda mevcut olabilecek yüzen hematopoietik hücreleri kurtarmak için, tüpü eski ortamla 300 G'de beş dakika boyunca döndürün. Tüpe yeni aşama ikinci ortam ekleyin ve eski ortamla aktarılmış olabilecek hücreleri ayırmak için yeniden süspanse edin.Daha önce bir mililitre ikinci aşama ortamı ile doldurulmuş olan her bir oyuğa kaydedilmiş hücrelerle iki mililitre yeni aşama iki ortam ekleyin. Hematopoietik farklılaşmanın 10. gününde, yüzen hematopoietik hücreler 50 mililitrelik konik bir tüpe toplanarak toplanır ve% 10 DMSO,% 50 FBS ve% 40 ortam kullanılarak dondurulabilir veya hücreleri osteoklastlara daha da farklılaştırmak için hemen kullanılabilir. M-CSF maturasyonu ve osteoklast farklılaşması.Santimetre kare başına 200.000 hücrede tohum hücreleri ve üç gün boyunca% 10 FBS ve mililitre M-CSF başına 50 nanogram ile desteklenmiş alfa MEM ile muamele edin. Fonksiyonel tahliller veya görüntüleme yapmak için, MCSF ile olgunlaşmış hücreleri, geniş delikli uçlu bir P-1000 ile yıkayarak ayırın. Eski besiyeri olan ayrılmış hücreleri bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 300 G'de döndürün.Hücre peletini %10 FBS, mililitre M-CSF başına 50 nanogram ve mililitre RANK ligand başına 80 nanogram ile desteklenmiş taze alfa MEM ile yeniden süspanse edin ve çözün. Hücreleri santimetre kare başına 200.000 hücrede yeniden tohumlayın ve yedi ila dokuz gün boyunca farklılaştırın. Çok çekirdekli osteoklastlar tipik olarak beş ila yedinci gün civarında ortaya çıkar.Temsili sonuçlar. Üretilen hematopoietik hücre popülasyonunun bileşimi, akış sitometrisi kullanılarak analiz edilebilir. Burada hematopoetik hücreler büyük bir CD45+öncü hücre popülasyonu gösterirler.Monosit belirteçleri CD14 ve CD11b'yi eksprese eden hücre popülasyonları, izotip kontrollerine kıyasla genellikle tüm popülasyonun üçte birini oluşturur. Terminal olarak diferansiye IPSC'den türetilen osteoklast, mikroskop altında TRAP pozitif çok çekirdekli hücreler olarak görülebilir. Konfokal mikroskopi, katepsin K için hücre boyamayı gösterir.Kemik veya mineral absorpsiyon deneyleri gibi fonksiyonel deneyler, osteoklast aktivitesinin daha fazla ölçülmesine izin verir.Burada, görüntülemeden önce olgun osteoklast% 10 ağartıcı ile çıkarıldıktan sonra rezorpsiyon çukurları görülebilirken, RANK ligand eklenmeden tedavi edilen M-CSF ile olgunlaşmış osteoklast öncüleri rezorpsiyon çukurları göstermez. Son. Bu protokol, insan osteoklastlarının sağlam ve güvenilir bir şekilde ayırt edilmesini sağlar ve kemik hastalıkları veya aşırı kalsifikasyon içeren hastalıklar için kullanıma hazır bir çözüm sağlayabilir. Kontrollü ve osteoprotegerinden bağımsız osteoklast aktivasyonu için kimyasal bir dimerizasyon indükleyicisi ile birlikte aktive edilebilen bir hücre içi sinyal alanı kullanan RANK hücrelerimize daha fazla mühendislik yapmak için osteoklastları kullanıyoruz.

differentiation-characterization-osteoclasts-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Notch sinyali, hücreler arasında doğrudan temasa dayanan bir hücresel iletişim şeklidir. Notch sinyalini in vitro olarak düzgün bir şekilde indüklemek için, Notch ligandları hücrelere hareketsiz bir durumda sunulmalıdır. Bu protokol, fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalinin in vitro stimülasyonu için yöntemleri açıklar.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Embriyodik vücut (EB) oluşumu, fibroblastik hücrelerin genişlemesi ve kondrojenik indüksiyonu içeren entegrasyonsuz bir yöntem kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla insan periferik kandan (PB) bir kondrojenik soy oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Burada, bir protokol indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretimi için Li-Fraumeni sendromu (LFS) hasta türetilmiş fibroblastlar, iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) yoluyla farklılaşma üzerinden dokusunu ve modelleme içinde vivo mevcut LFS hasta kaynaklı dokusunu kullanarak tumorigenesis.

Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Osteoklastlar vücuttaki anahtar kemik emici hücrelerdir. Bu protokol, osteoklastların insan periferik kan monositlerinden in vitro farklılaşması için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntem, homeostazda ve hastalıklarda osteoklast biyolojisini daha iyi anlamak için önemli bir araç olarak kullanılabilir.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Bu protokol, hiPSC'leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC'ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB'ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Burada, kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması amacıyla saflaştırılmış kardiyomiyositlerin üretimini sağlayan, küçük molekül modülasyonlu kardiyak farklılaşma ve glikoz yoksunluğu aracılı kardiyomiyosit saflaştırmasını birleştiren insan kardiyomiyosit türevi için sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Keşfedin, insan iPS hücrelerinden osteoklast farklılaşması ve karakterizasyonu için güvenilir bir protokol. Bu yöntem, kemik hastalıkları ve doku mühendisliği araştırmalarında osteoklast biyolojisini anlamaya yardımcı olur.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet