Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Bu çalışmada, mozaik adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu için klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayabilecek gelişmiş bir protokol geliştirmeyi amaçlıyoruz. İstikrarlı üretici hücre hatları oluşturma çabalarına rağmen, memeli hücrelerinde geçici transfeksiyon, AAV üretimi için hala baskın iş akışıdır. Daha sonra AAV'ler, ultra yüksek hızlı yoğunluklu gradyan santrifüjleme veya viral partiküllerin biyokimyasal özelliklerine dayanan kromatografi teknikleri ile saflaştırılır.

AAV'leri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemler, sezyum klorür veya iyodiksanol yoğunluk gradyan ultrasantrifüjlemesi kullanır. Avantajlarına rağmen, bazı sınırlamaları vardır. Zaman alıcıdırlar, sınırlı ölçeklenebilirliğe sahiptirler ve genellikle bazı vektörlere düşük saflıkta sonuç verirler.

Şimdi, bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için, birkaç araştırmacı dikkatlerini kromatografi tekniklerine çevirdi. AAV2'nin heparin bağlama yeteneğine dayalı olarak mozaik rAAV'lerin üretilmesi için adım adım bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem, son derece saf ve biyolojik olarak aktif rAAV'leri altı gün içinde kullanıma hazır hale getirir ve kendisini klinik öncesi çalışmalar için rAAV'ler oluşturmak için yarı otomatik, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir strateji olarak sunar.

Mozaik rAAV'lerin üretimi için bu yöntemin uygulanabilirliğini gösterdikten sonra, üretim sistemi artık bir üretici hücre hattı kurarak daha iyi bir ölçeklenebilirlik ve maliyet etkinliği elde etmek için ince ayar yapılabilir. Ek olarak, ikinci bir parlatma saflaştırma adımı ekleyerek boş parçacıkları gidermeyi amaçlıyoruz.