Name: Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Keşfedin, damsal geçirgenliği modelleri için çok malzemeli biyobaskı teknolojisiyle standart altı kuyulu plakalarda yüksek verimli damar kanalı üretimini. Bu yöntem, endotel hastalıkları için terapötik gelişimi hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Biyoyazıcı için G kodunun oluşturulması
<ol><li>Yazdırma yolunu oluşturmak ve görselleştirmek için çevrimiçi bir G kodu simülasyon aracını (ör. NCviewer) ziyaret edin.</li>
	<li>Tıkla Yeni dosya Yeni bir G kodu dosyası oluşturmak için arayüzdeki simge.</li>
	<li>Kurban kanalı ve silikon odası için G kodu komutlarını manuel olarak yazarak bir yazdırma yolu oluşturun. Geometriyi oluşturmak için referans olarak standart altı kuyulu bir plakanın boyutlarını kullanın. NOT: Burada kullanılan G kodu, Bilgisayarlı Sayısal Kontrol (CNC) kodunu temel alır. Her komutun işlevleri Ek Tablo S1'de verilmiştir. Altı kuyulu plaka formatı, ticari mikroplaka okuyucular ve mikroskopi kurulumları ile uyumluluğu ve endotel olgunlaşmasını desteklemek için yeterli hacimde ortamı barındırması ve böylece sık sık ortam değişikliği ihtiyacını en aza indirmesi nedeniyle seçilmiştir. Bu üretim protokolü, diğer standart kuyu plakaları ile kullanım için de uyarlanabilir.</li>
	<li>G kodu tamamlandıktan sonra, .nc uzantılı dosyayı indirmek için arayüzdeki Dosyayı Kaydet simgesine tıklayın. NOT: Yazdırma yollarını oluşturmak için mevcut başka herhangi bir G kodu oluşturma algoritması kullanılabilir. Vasküler kanalın geometrisi bu G kodunda manipüle edilebilir.</li>
</ol>2. Kurban ve silikon hazne mürekkeplerinin hazırlanması
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm materyaller için kaynaklar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
<ol><li>SE1700 ve polidimetilsiloksan (PDMS) olmak üzere iki tür silikon polimerini 10:2 oranında birleştirin. Her polimerin sertleştirici maddesini 10:1 oranında, polimeri sertleştirici maddeye ekleyin.</li>
	<li>Polimer karışımını 2.000 rpm'de iyice karıştırmak ve gazını almak için bir planet karıştırıcı kullanın.</li>
	<li>Bir spatula ile karışık silikon polimeri 10 mL'lik tek kullanımlık bir şırıngaya aktarın. Düzgün bir tutarlılık sağlamak ve baskı sırasında kabarcıkları önlemek için yüklü şırıngayı 400 × g'da 5 °C'de 3 dakika santrifüjleyin. NOT: Hazne mürekkebi, optimum baskı kalitesini sağlamak için kürleme maddelerinin eklenmesinden sonraki 2 saat içinde kullanılmalıdır. Baskıya hazırlanırken şırıngayı 5 °C'de saklayın. Bu işlem, mürekkebin yavaş kürlenmesine yardımcı olur, aksi takdirde baskı parametrelerini değiştirebilir.</li>
	<li>Damıtılmış suda @ (a/h) PF127 stok çözeltisi hazırlamak için Pluronic F-127'yi (PF127) tartın.</li>
	<li>Homojenlik elde etmek için PF127 çözeltisini planet mikserde 400 × g'da 3 dakika karıştırın. PF127'nin tamamen çözünmesi için homojenize karışımı 4 °C'de tutun.</li>
	<li>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) 1.000 birim / mL'lik bir trombin stok çözeltisi hazırlayın. NOT: Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için trombin stok solüsyonunu 100 μL'lik alikotlarda saklayın. Alikotlar -20 ° C'de 6 aydan fazla saklanmamalıdır.</li>
	<li>Yazdırmadan önce, trombini PF127 ile 1:10 seyreltmede PF127 için 6 (a/h) ve trombin için 100 birim/mL'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna karıştırarak kurban mürekkebi hazırlayın. 1 mL kurban mürekkebi hazırlamak için, 100 μL trombin stok çözeltisini 900 μL PF127 stok çözeltisi ile karıştırın. NOT: Kurban mürekkebini tek bir klişe basmak için hazırlarken, toplam 1 mL'lik bir hacim fazlasıyla yeterlidir.</li>
</ol>3. İmalat süreci
<ol><li>Üretim işlemine başlamadan önce, altı oyuklu bir plakayı 1 dakika boyunca 100 watt gücünde oksijen (O2) plazması ile işlemden geçirin.</li>
	<li>Hem kurban hem de silikon mürekkepleri hazırlamak için bölüm 2'de özetlenen prosedürü izleyin, mürekkeplerin kabarcık içermediğinden ve tutarlı baskı için homojen bir şekilde karıştırıldığından emin olun. Mürekkepleri biyoyazıcının yazıcı kafasına dikkatlice yerleştirin. Biyoyazıcının kafasının sıcaklığını kurban mürekkebi için 37 °C'ye ve silikon mürekkep için 5 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Silikon şırıngaya 22 G çift vidalı dişli konik bir nozul takın. Kurban mürekkebi için, istenen kanal çapına göre nozul boyutunu seçin. NOT: Burada, üç boyutta nozul gösterdik: 18 G, 20 G ve 22 G. Baskı basıncı ve yazıcı kafası hızı dahil olmak üzere optimum baskı parametreleri Tablo 1'de özetlenmiştir.</li>
	<li>İstenen G kodunu yükleyin ve biyoyazıcının yazılım arayüzündeki servo hazır fonksiyonuna 3 saniye boyunca basın. Kalıbı G kodunun başlangıç noktasındaki sahneye yerleştirin ve yazdırma işlemini başlatmak için başlat'a tıklayın. NOT: Tipik olarak, altı hazne içeren bir plakanın imalatı yaklaşık 1 saat ve 10 dakika gerektirir. G kodunun yüklenmesini ve yürütülmesini içeren Adım 3.4, kullanılan spesifik biyoyazıcıya bağlı olarak değişebilir. Kontaminasyonu önlemek için biyoyazıcıyı kullanırken steril koşulların korunduğundan emin olun.</li>
	<li>Plakanın üzerine bir kapak yerleştirin ve silikon odalarını sertleştirmek için plakayı 72 saat boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöre aktarın. NOT: Silikon kürleme inkübatörün içinde daha yavaş bir hızda gerçekleşebilse de, plaka kuru bir fırının içine yerleştirilmemelidir.</li>
</ol>4. Hidrojel hazırlama ve kanal gömme
<ol><li>20 mL 1x PBS içeren 50 mL'lik bir konik tüp hazırlayın. % 0.05 (a / h) LAP çözeltisi yapmak için 0.01 g lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) konik tüpe yerleştirin. Toz tamamen eriyene kadar girdaplayın. NOT: Işığa maruz kalmayı önlemek için konik boruyu folyoya sarın. LAP stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.</li>
	<li> GelMA ve %1 fibrinojen (GelFib olarak adlandırılır) nihai konsantrasyonunu elde etmek için 20 mL LAP çözeltisine 3 g jelatin metakrilat (GelMA) ve 0.2 g fibrinojen ekleyin. Karışımı 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun ve çözelti tamamen eriyene kadar periyodik olarak karıştırın.</li>
	<li>Bölüm 3'te belirtildiği gibi imalattan sonra, kurban desenini gömmek için her bir hidrojel odasına 300 μL önceden ısıtılmış GelFib ekleyin. GelMA'yı 120 s boyunca 85 mW/cm2 yoğunlukta 405 nm dalga boyunda ultraviyole (UV) ışıkla hızla çapraz bağlayın. Bu işlemi diğer tüm kuyucuklar için tekrarlayın. NOT: Fibrinojen, trombin içeren kurban paterni ile temas ettiğinde hızla çapraz bağlanır. GelMA'nın oda sıcaklığında istenmeyen jelleşmesini önlemek için hidrojel eklemenizi ve her kuyucuk için ayrı ayrı UV çapraz bağlama yapmanızı öneririz. Ek olarak, UV kürleme işlemi sırasında kontaminasyonu önlemek için steril koşullar korunmalıdır.</li>
	<li>Her oyukta vasküler kanalın her iki tarafına 1 mL DPBS ekleyin ve PF127'yi sıvılaştırmak için plakayı 15 dakika boyunca 4 ° C'de tutun.</li>
	<li>15 dakika sonra DPBS'yi emdirin ve PF4.5'nin tamamen yıkanması için adım 3 127x'i tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri kanallara sokmadan önce, hücre bağlanmasını arttırmak için kanallardan 30 dakika boyunca %1 Matrigel içeren DMEM F12'yi perfüze edin.</li>
</ol>5. HUVEC kültürü
<ol><li>Endotel hücre büyüme ortamını (EKGM) 37 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın.</li>
	<li>Bu arada, nitrojen tankından bir şişe dondurularak saklanmış HUVEC alın, şişenin kapağını nazikçe gevşetin ve ardından dişlerden nitrojeni serbest bırakmak için yeniden sıkın. Şişeyi 37 ° C'lik bir su banyosunda 2 dakika bekleterek hücreleri hemen çözün ve şişenin içinde az miktarda buz kalmasını sağlayın. Kontaminasyonu önlemek için şişeyi% 70 etanol ile durulayın. NOT: Nitrojen tankından hücreleri alırken koruyucu gözlük takın. Bu işlem sırasında şişenin kapağı su seviyesinin üzerinde tutulmalıdır.</li>
	<li>5 mL önceden ısıtılmış EKGM içeren 15 mL'lik bir konik tüp hazırlayın. Bir mikropipet ile, çözülmüş hücreleri flakondan konik tüpe dikkatlice aktarın. Geride hiçbir hücre kalmadığından emin olmak için, kriyoviyal için 1 mL taze önceden ısıtılmış ortam ekleyin, içini durulayın ve kalan hücreleri konik tüpe aktarın.</li>
	<li>Bir hücre peleti elde etmek için konik tüpü 200 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücreleri 10 mL taze ortamda yeniden süspanse edin, hücreleri bir T75 şişesine aktarın ve şişeyi 37 °C nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörüne yerleştirin. NOT: Bu adım, kriyoviyaldeki dondurma ortamında bulunan dimetil sülfoksitin santrifüjleme yoluyla uzaklaştırılması için önemlidir.</li>
	<li>Hücreler% 80-90 birleşmeye ulaşana kadar ortamı her gün yenileyin.</li>
</ol>6. Kanalların endotelizasyonu
<ol><li>EKGM, DPBS, tripsin nötralize edici solüsyon ve tripsin etilendiamintetraasetik asidi (TE) 37 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın.</li>
	<li>% 90 birleşmede, hücreleri 10 mL DPBS ile bir T75 şişesinde durulayın, şişeye 1 mL %0.25 TE ekleyin ve 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Şişenin kenarlarına hafifçe vurun ve TE'yi nötralize etmek için 5 mL tripsin nötralize edici çözelti ekleyin. Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri toplamak ve bunları konik tüpe eklemek için 5 mL taze EKGM kullanın.</li>
	<li>Hücre peletini toplamak için konik tüpü 250 × g'da 3 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL taze EKGM'de yeniden süspanse edin. Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve bir hücre peleti elde etmek için Adım 6.4'ü tekrarlayın. 90 μL taze EKGM'de 3 milyon hücreyi yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu kanala sokmadan önce, lümeni temizlemek için kanalı kısa bir süre vakumla emin. NOT: Bütünlüğüne zarar vermemek için kanalın uzun süre emilmesinden kaçının.</li>
	<li>Kanalı, kuyu başına 0,5 milyon hücre tohumlama yoğunluğunda bir hücre süspansiyonu ile yavaşça yükleyin. Kanalı doldurmak için bu süspansiyondan ~ 15 μL eklemek için bir mikropipet kullanın. NOT: Tohumlama yoğunluğu kanalın büyüklüğüne göre değişiklik gösterebilir. Bu yoğunluk, 20 G nozul ve yaklaşık 900 μm iç çap ile basılmış bir kanal için optimize edilmiştir.</li>
	<li>Plakayı 2 saat boyunca inkübatörün içine düz bir şekilde yerleştirin. Ardından, plakayı 180°'ye ters çevirin ve sonraki 2 saat boyunca düz bir konumda tutun.</li>
	<li>4 saat sonra, yapışmayan ve ölü hücreleri çıkarmak için kanalı DPBS ile yıkayın. Her oyuğa 2 mL taze EKGM ekleyin (kanalın her iki tarafına 1 mL). Plakayı, kanallar sallanma yönüne paralel olacak şekilde külbütör üzerine yerleştirerek 10° eğim açısında ve 5 rpm'de bir külbütör üzerinde dinamik kültürü başlatın. Büyüme ortamını her gün yenileyin. NOT: Dinamik kültür, rezervuarlar ve kanallar arasındaki ortam alışverişini artırır ve hücrelerin gece boyunca çoğalmasına yardımcı olur.</li>
</ol>7. Endotel olgunlaşma değerlendirmesi
<ol><li>EKGM ve DPBS'yi 37 °C su banyosunda 30 dakika ve Hücre Sayma Kiti-8 (CCK8) reaktifini oda sıcaklığında önceden ısıtın.</li>
	<li>Her kuyucuk için 100 μL CCK8 reaktifini 1 mL taze EKGM ile karıştırarak çalışan bir CCK8 çözeltisi yapın. Bir plaka / 6 kanalı için çalışırken, 6 μL CCK8 reaktifini 6 mL taze EKGM ile birleştirerek hazırlayın.</li>
	<li>Büyüme ortamını emerek çıkarın ve kanalları DPBS ile durulayın. Her oyuğa 1 mL CCK8 çalışma solüsyonu ekleyin ve plakanın inkübatörün içinde 30 dakika boyunca düz kalmasına izin verin. Daha sonra, dinamik kültürü adım 6.9'da açıklandığı gibi bir rocker'da başlatın ve bu işleme sonraki 3 saat boyunca devam edin.</li>
	<li>3 saat sonra, plakayı bir tarafa eğerek içeriği her bir kuyucuktan çıkarın ve bunları yeni bir altı kuyulu plakaya aktarın. Kanalları DPBS ile durulayın ve taze ortam ekleyin. NOT: Absorbans ölçümüne kadar plakayı alüminyum folyo ile örtün. Tek tip okumalar sağlamak için tüm kuyucuklarda tutarlı bir reaktif hacmini koruyun. Pipetleme sırasında, optik yoğunluk okumalarının doğruluğunu bozabilecek hava kabarcıkları oluşturmaktan dikkatli bir şekilde kaçının.</li>
	<li>Renklerin eşit şekilde karışmasını sağlamak için plakayı 15 saniye boyunca hafifçe salladıktan sonra, 450 nm'de emiciliği ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.</li>
	<li>Bu prosedürü önceden tanımlanmış zaman aralıklarında tekrarlayın. Her zaman noktası için ortalama optik yoğunluğu hesaplayın ve grafik yazılımında bir büyüme eğrisi çizin. Bu eğri, endotelin zaman içinde nispi olgunlaşmasını gösterir.</li>
</ol>8. Geçirgenlik deneyi
<ol><li>Ortamı ilgilendiğiniz bir kuyudan çıkarın. NOT: Geçirgenlik testi için, vasküler geçirgenliklerini değiştirebilecek diğer kanalların kurumasını önlemek için her bir kuyucuğun ayrı ayrı işlenmesi önerilir.</li>
	<li>70 kDa FITC dekstranı DPBS'de çözerek 6 mL 0.1 mg / mL FITC konjuge dekstran çözeltisi hazırlayın. NOT: 100 mg FITC dekstranı 5 mL DPBS içinde çözerek 20 mg / mL'lik bir FITC dekstran stok çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi nazikçe girdapladıktan sonra, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için 500 μL'yi 1.5 mL'lik tüplere alikotlayın. Bu alikotlar -20 °C'de en fazla 6 ay saklanabilir. Tahlili gerçekleştirmeden önce, stok çözeltisini 0.1 mg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin.</li>
	<li>Plakayı mikroskop tablasına sıkıca yerleştirin ve görüş alanı içinde yakınlarda bulunan jel ile birlikte ilgili bölgedeki kanal duvarının net bir şekilde görünmesini sağlamak için objektifin büyütmesini faz kontrast modunda ayarlayın. NOT: Etkili geçirgenlik değerlendirmesi için, görüş alanındaki ilgili bölgeyi çevreleyen jel alanını en üst düzeye çıkarmaya çalışın; Bu husus, dekstran taşımacılığının doğru bir şekilde izlenmesinin anahtarıdır.</li>
	<li>İstenilen alana odaklandıktan sonra, faz kontrastından floresan moduna geçin. Görüntü alma sekmesi altında, geniş alan kanalına FITC ekleyin ve arka plan floresan yoğunluğunu hesaplamak için dekstran çözeltisi eklemeden önce bir görüntü elde edin. Daha sonra, kanalın bir tarafına 1 mL FITC dekstran çalışma çözeltisi ekleyin ve çözeltinin hidrostatik basınç farkı tarafından yönlendirilen kuyunun diğer tarafına doğru akmasına izin verin.</li>
	<li>Görüntüleri önceden belirlenmiş zaman aralıklarında elde edin - yüksek geçirgenliğe sahip kanallar için daha sık ve daha düşük geçirgenliğe sahip olanlar için daha az sıklıkta.</li>
</ol>9. ImageJ'de floresan yoğunluğu ölçümü
<ol><li>ImageJ görüntü analiz yazılımında, aşağıda belirtildiği gibi ilk zaman noktasındaki yoğunluğu (It1), daha sonraki zaman noktasında gözlemlenen ortalama yoğunluğu (It2) ve arka plan gürültüsünden kaynaklanan yoğunluğu (Ib) ölçün. Geçirgenlik katsayısını (Pd) hesaplamak için denklemi (1) kullanın. T1 ve T2, görüntü alımının ilk ve sonraki zaman noktalarını ifade eder. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66676/66676eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)<ol><li>ImageJ'yi başlatın ve ilk zaman noktasında alınan görüntüyü açın.</li>
		<li>ImageJ'de ölçeği ayarlayın. Analize gidin | Ölçeği ayarlayın. Bilinen ölçeği ve ölçü birimini girin.</li>
		<li>Dikdörtgen aracını seçin ve floresan yoğunluğu ölçümünün gerekli olduğu jel alanı üzerine bir dikdörtgen çizin.</li>
		<li>Analize gidin | Ölçümler'i ayarlayın ve Ortalama gri değerinin işaretli olduğundan emin olun. NOT: Bu seçenek, seçilen alandaki ortalama yoğunluğu ölçer. Verilen analiz için gerektiği gibi diğer parametreler de seçilebilir.</li>
		<li>Alan seçili durumdayken Analiz | Ölçün veya sadece M'ye basın. Ortalama floresan yoğunluğunu ve seçilen diğer parametreleri gösteren bir sonuç penceresinin açılmasını bekleyin.</li>
		<li>Üç ölçüm yapın ve bir elektronik tablodaki ortalama floresan yoğunluğu değerini hesaplayın.</li>
		<li>Arka plan floresansını belirlemek için, sonraki zaman noktası t2'de yakalanan görüntüler ve daha sonraki zaman noktasında floresan yoğunluğunun hesaplanması için dekstran çözeltisinin eklenmesinden önce çekilen görüntüler için bu prosedürü tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Plaka Üzerinde Kaplar Kullanarak Hızlı Vasküler Ağ İmalatı için 3D Biyobaskı

<table><tbody><tr><td>10 mL Serolojik Pipet</td><td>SPL</td><td>SPL 91010</td><td></td></tr><tr><td>10 mL şırınga&nbsp;</td><td>Shinchang Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3D Biyoyazıcı&nbsp;</td><td>T & R Biofab</td><td>3DX-Yazıcı</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka&nbsp;</td><td>SPL</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik Güvenlik Kabinleri</td><td>CHC LAB</td><td>PCHC-777A2-04,&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brightfield Ters Mikroskoplar</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayma Kiti (CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayma Kiti (CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Şişesi 75T</td><td>SPL</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, LDEV içermez, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Hücre Kültürü Sınıfı</td><td>Sigma aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kiti</td><td>DOW</td><td>DC-184</td><td></td></tr><tr><td>DOWSIL SE 1700 Şeffaf W/C 1.1 KG Kiti&nbsp;</td><td>DOW</td><td>2924404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS - 1x</td><td>Welgene</td><td>LB001-01</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Ortamı MV 2 (Kullanıma hazır)</td><td>Promocell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikro pipet(1000,200,100,20,10)</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol %99,9</td> <td>Duksan</td><td>D5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır plazmasından fibrinojen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextran 70 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Floresan boncuklar (1.0 & m, yeşil)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1030-1ML</td><td></td></tr><tr><td>GelMA tozu (Jelatin metakrilat) 50 g</td><td>3D Malzemeler&nbsp;</td><td>20JT29</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, Geri Kazanım Hücre Kültürü Dondurma Ortamı, 50 mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVEC'ler (İnsan Umbillical Ven Endotel Hücreleri)</td> <td>Promocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Forma STERI-CYCLE i160 CO2 İnkübatör</td><td></td></tr><tr><td>İnvitrojen, Canlı / ölü canlılık / sitotoksisite Kiti (memeli hücreleri için)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Lityum Fenil (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfat tozu&nbsp;</td><td>Tokoyo Kimya Sanayi A.Ş.</td><td>85073-19-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, Sayım odası kapağı</td><td>Marienfeld Superior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, Hemositometre, hücre sayma odası</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0650030</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikrosantrifüj eppendorf</td><td>Santrifüj 5920 R</td><td></td></tr><tr><td>NCViewer.com</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azot tankı</td><td>WORTHINGTON ENDÜSTRILERI</td><td>LS750</td><td></td></tr><tr><td>Omnicure UV Lazer</td><td>EXCELITAS</td><td>SERİSİ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (100x)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA005-010</td><td></td></tr><tr><td>Planet Mikser</td><td>THINKY CORPORATION, Japonya</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Plazma işleme makinesi</td><td>FEMTO SCIENCE</td><td>CUTE-1MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>Önceden hazırlanmış tampon, (P2007-1) 10x PBS</td><td>Biosesang</td><td>PR4007-100-00</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif saklama dolabı</td><td>ZIO FILTER TECH</td><td>SC2-30F-1306D1-BC</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı Canlı hücre Görüntüleme Mikroskobu</td><td>Carl ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buzdolabı</td><td>SAMSUNG</td><td>RT50K6035SL</td><td></td></tr><tr><td>ROCKER 2D dijital</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>Kepçe-Spatula</td><td></td><td>ÖnbelleğiSL-SCO7001-EA</td><td></td></tr><tr><td>sigma tarafından, Tripsin-EDTA solition,% 0.25</td> <td>Sigma aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Thermo Fisher scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Namlu Ucu Kapağı</td><td>FISNAR</td><td>3051806</td><td></td></tr><tr><td>Uyarı Sinyali Sayacı</td><td>Kontrol Şirketi</td><td>&nbsp; C23-147-050</td><td></td></tr><tr><td>Konik Nozul (18 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-18G-U</td><td></td></tr><tr><td>Konik Nozul (22 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-22G-U</td><td></td></tr><tr><td>Konik nozul 20 G</td><td>Musashi</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>Sığır plazmasından trombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Zamanlayıcı, 4 kanallı</td><td>ETL</td><td>SL. Tim3005</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Çözelti% 0.4</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin Nötralize Edici Çözelti</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td></td></tr><tr><td>UG 24 mL UG merhem kavanozu</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-53</td><td></td></tr><tr><td>UG 58 mL UG merhem kavanozu</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-55</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>Ağırlık makinesi</td><td>Sartorius</td><td>bce2241-1skr</td><td></td></tr></tbody></table>

boyut ve desen esnekliği ile standart altı kuyulu plakalarda vasküler geçirgenliğin modellenmesi için yüksek verimli biyobaskı yöntemi

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

Boyut ve desen esnekliğine sahip VOP platformu, çok kafalı bir biyo-baskı sistemi ile üretildi. Hem içi boş hem de perfüzyon yapabilen kanallar, endotelizasyonu kolaylaştırmak için HUVEC'lerle tohumlandı ve daha sonra bir geçirgenlik testi ile değerlendirildi (Şekil 1A). Bu yöntemin çok ölçekli üretim kapasitesini göstermek için üç farklı konfigürasyon yazdırdık: düz, çatallı ve kıvrımlı (Şekil 1B). Basit bir üretim yaklaşımıyla, bir hidrojel matrisi içine gömülü altı içi boş, perfüze edilebilir vasküler kanal, standart altı oyuklu bir plaka içinde üretilebilir. Bu kanallar daha sonra HUVEC'ler ile endotelyalize edilebilir (Şekil 2A). Hücreler, vasküler kanalın luminal yüzeyini kaplamak için hızla bağlanır ve çoğalır (Şekil 2B). Hem alt hem de üst luminal yüzeylere yapışan hücreler, lümen içinde düzgün bir dağılım sergiler (Ek Şekil S1).
Plaka, silikon mürekkebin kürlenmesine izin vermek ve kurban deseninin kurumadan uzak kalmasını sağlamak için 3 gün boyunca nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirildi (Şekil 3A). Bu kanallardan geçen akışı değerlendirmek için, kanalların etkili bir şekilde perfüze edilebilir olduğunu gösteren yeşil mikro boncuklar tanıtıldı (Ek Video S1). Kanalların çapı 558 μm ± 1094 μm ± 45 μm arasında değiştirildi ve kurban desen baskısı sırasında nozul boyutu 22 G'den 18 G'ye değiştirildi. Ek olarak, kanalların geometrik konfigürasyonu, kıvrımlı ve çatallı desenlerin yazdırılmasını sağlamak için biyoyazıcının G kodunun (Ek Dosya 1) değiştirilmesiyle manipüle edildi (Şekil 3B).
UV ile çapraz bağlama süresi 120 s'ye optimize edilmiştir, bu da etkili hücre proliferasyonunu destekler (Ek Şekil S2). Bu çapraz bağlanma süresi, muhtemelen hidrojelin dengeli mekanik özellikleri ve gözenekliliği nedeniyle, daha iyi hücre bağlanmasını ve müteakip proliferasyonu kolaylaştıran, endotel hücre proliferasyonunu destekleyen fizyolojik olarak daha ilgili bir ortamla sonuçlandı. HUVEC'ler luminal yüzeyde etkili bir şekilde çoğaldı ve tohumlamadan sonraki 5. güne kadar parke taşı benzeri bir morfoloji gösterdi. Endotelin olgunlaşması 1, 3 ve 5. günlerde yapılan CCK8 testi ile değerlendirildi (Şekil 4A,B). Endotelin olgunlaşması, hücre tohumlamasından 5 gün sonra CD31 için immün boyama ile doğrulandı, bu da CD31'in sıkı bağlantılarda lokalizasyonunu gösterdi (Şekil 4D).
Endotelin bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için, olgunlaşmanın 5. gününde kanallardan 70 kDa'lık bir dekstran solüsyonu perfüze ettik. Karşılaştırma için endotelsiz (çıplak) bir kontrol kanalı seçildi. Endotelyalize kanal, zaman içinde perivasküler jel bölgesi içinde floresanda minimal değişiklikler sergiledi, bu nedenle endotelin bariyer fonksiyonunu etkili bir şekilde sürdürdüğünü düşündürdü. Bununla birlikte, çıplak kanallar perivasküler jel bölgesinde floresansta bir artış sergiledi, bu nedenle endotel yokluğuna bağlı olarak daha yüksek geçirgenliğe işaret etti (Şekil 4C ve Şekil 4E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig01.jpg"> Şekil 1: Basılı vasküler kanalların hazırlanması ve konfigürasyonları. (A) Basılı vasküler kanalların üretimi, endotelyalizasyonu ve geçirgenlik testinin şeması. (B) Bu yöntemde gösterilen üç konfigürasyonun şeması: düz, çatallı ve kıvrımlı. Kısaltma: VOP'lar = bir plaka üzerindeki kaplar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig02.jpg"> Şekil 2: Kurban deseni ve silikon odasının yanı sıra vasküler kanal endotelizasyonunun basılması için üretim zaman çizelgesi. (A) Çizim, kuyu plakasının tek bir kuyusunu temsil eder ve AA', enine kesit düzlemi boyunca görünümü ifade eder. (B) İmalat sürecinde yer alan adımların temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Kısaltmalar: GelFib =% 0.05 w/v lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat çözeltisi içinde% 15 jelatin metakrilat ve% 1 fibrinojen; HUVEC'ler = İnsan göbek damarı endotel hücreleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig03.jpg"> Şekil 3: Bir plaka üzerindeki kaplar. (A) Kurban deseni ve silikon odasının basılmasından sonra bir plaka üzerindeki kapların brüt görüntüsü. (B) Yeşil mikro boncuklarla perfüze edilmiş, çeşitli konfigürasyon ve boyutlarda vasküler kanalların çok ölçekli imalatının gösterilmesi. Ölçek çubukları = 200 μm (düz kanallar), 1.000 μm (kıvrımlı ve çatallı kanallar). Kısaltmalar: ID = iç çap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig04.jpg"> Şekil 4: Vasküler kanallar ve endotelyal olgunlaşması ve geçirgenliği. (A) Yeşil floresan proteini etiketli HUVEC'lerle tohumlamadan sonra 1, 3 ve 5. günlerde vasküler kanalların floresan mikroskobik görüntüleri, 5. günde HUVEC'lerin proliferasyonunu ve parke taşı morfolojisini gösterir. (B) Endotel olgunlaşması, hücre tohumlamasından sonraki 1, 3 ve 5. günlerde CCK-8 testi ile değerlendirildi. (C) Endotelyalize (endotel +) ve çıplak (endotel -) vasküler kanalların geçirgenlik testi. (D) CD31 boyamanın temsili görüntüleri, CD31'in 5. gündeki sıkı bağlantılarda lokalizasyonunu göstermektedir. (E) Difüzyonel geçirgenliğin ölçülmesi. Ölçek çubukları = 200 μm (A, C, D). Kısaltmalar: HUVEC'ler = İnsan göbek damarı endotel hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini; GFP HUVEC'ler = GFP etiketli HUVEC'ler; CCK-8 = hücre sayma kiti 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Baskı Mürekkebi</td>
			<td colspan="2">Yazdırma parametreleri</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Meme ölçer</td>
			<td>Sıcaklık (°C)</td>
			<td>Hava basıncı (kPa)</td>
			<td>Kafa hızı (mm / dak)</td>
		</tr><tr><td>Kurban mürekkebi</td>
			<td>18</td>
			<td>37</td>
			<td>40-48</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Silikon mürekkep</td>
			<td>22</td>
			<td>5</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Kurban ve silikon mürekkepler için baskı parametreleri.
Ek Dosya 1: Altı oyuklu bir plaka içinde kurban desenini ve silikon odasını 3D yazdırma komutlarını içeren G-Kodu komut dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_GCode%20File_Jove.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Hem alt hem de üst odak düzlemlerinde GFP-HUVEC ekini gösteren hücre tohumlamasından sonra alt ve üst luminal yüzeyin temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: UU' = üst odak düzlemi; LL' = alt odak düzlemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S1%20rev.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S2: UV (405 nm) ile farklı çapraz bağlanma süreleri altında GFP-HUVEC proliferasyonu. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: HUVEC'ler = İnsan göbek damarı endotel hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini; GFP HUVEC'ler = GFP etiketli HUVEC'ler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S2%20rev.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video S1: Düz, kıvrımlı ve çatallı kanallardan etkili perfüzyonu gösteren yeşil mikro boncuklu perfüzyon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/Channels%20Perfusion.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo S1: G kodu ve M kodu komutlarının işlevleri. NOT: G kodunda, X, Y ve Z, sırasıyla X ekseni, Y ekseni ve Z ekseni boyunca hareket koordinatlarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...

high-throughput-bioprinting-method-for-modeling-vascular-permeability

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz nerede bir ikincil hücre tipi bozukluklarına doku ve organoids oluşturmak için bu microfibrous yapının interstisyel uzaya daha fazla numaralı seribaşı bir microfibrous vasküler yatağın mühendislik bir mikrosıvısal bioprinting strateji temel alan genel bir protokol sağlar.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Bir membran geçirgenliği belirlenmesi için bir yöntem eklemek çok iyi plakaları için sistem ve silico parametre optimizasyonu simülasyon kullanarak Difüzyon katsayıları hesaplanması için sunulmaktadır.

Bir yöntem belirleme geçirgenliği ve Difüzyon bir zarda bir 3D doku modelindeki simülasyonu için ekleme sistemi çok iyi kaplamalar için

Bu yöntem, standart mikroakışkan bir platformda 40 perfüze 3D mikrokap olarak iPSC kaynaklı endotel hücrelerinin kültürünü açıklar. Bu platform, anastomoz ve anjiyojenik filizlerin ölçeklenebilir ve yüksek iş lenme tarzında stabilizasyonu da dahil olmak üzere, degrade odaklı anjiyojenik filizlenmenin 3Boyutlu olarak incelenmesini sağlar.

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Burada sunulan bir basit kullanımlı, çekirdek / kabuk, üç boyutlu biyobaskı kurulum içi boş iskeleler, vasküler ve diğer borulu yapıların doku mühendisliği için uygun tek adımlı imalatı için.

Boru yapıları doku mühendisliği için Çekirdek / kabuk Baskı İskeleler

Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.

3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı

Mühendislik dokuları, hayati besinleri ve gazları sağlamak ve metabolik atıkları gidermek için uygun vasküler ağlara büyük ölçüde güvenir. Bu çalışmada, endotel hücrelerinin ve destek hücrelerinin adım adım tohumlama protokolü, kontrollü bir 3D ortamda gelişen damar davranışını incelemek için yüksek verimli bir platformda son derece organize damar ağları oluşturur.

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

Tasarlanmış flepler, dahil edilmiş bir fonksiyonel vasküler ağ gerektirir. Bu protokolde, hiyerarşik vasküler ağ ve onun doğrudan mikrocerrahi anastomozlarını sıçan femoral arterine içeren 3D baskılı bir doku flebi üretme yöntemini sunuyoruz.

3D Baskı Teknolojileri Kullanılarak Mühendislik Vasküler Flaplarının İmalatı

Bu protokol, perfüzyonda kan damarlarının ex vivo kültürü için yeni geliştirilen, 3D baskılı bir biyoreaktörün kurulumunu ve çalıştırılmasını sunar. Sistem, diğer kullanıcılar tarafından kolayca benimsenebilecek, pratik, uygun fiyatlı ve temel biyoloji ve farmakolojik çalışmalar gibi farklı deneysel uygulamalara uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.

Ex Vivo (Canlı Canlı) 3D Baskılı Biyoreaktörde Büyük Kan Damarlarının Perfüzyon Kültürü

Bu makale, hücre dışı matris sertleşmesini ve fibroblast aktivasyonunu incelemek için fototize edilebilir hidrojellerin 3D biyo-baskısının nasıl yapılacağını açıklamaktadır.

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Bu protokol, açık kuyu formatını sıvı akış yetenekleriyle bütünleştiren yeniden yapılandırılabilir bir membran tabanlı hücre kültürü platformunu açıklar. Bu platform standart protokollerle uyumludur ve hem mühendislik hem de biyobilim laboratuvarlarının ihtiyaçlarını karşılayarak açık kuyu ve mikroakışkan kültür modları arasında tersine çevrilebilir geçişlere izin verir.

Statik Bariyer Doku Modellerinin Dinamik Mikrofizyolojik Sistemlere Dönüştürülmesi

Çözünür bazal membran ekstraktları, kanser araştırmalarında en yaygın kullanılan biyolojik matrislerdir, ancak karmaşık reolojik davranışları, ticari olarak mevcut biyo-baskı sistemleriyle biyo-baskılarını zorlaştırır. Bu çalışma, hem tek hem de çoklu katmanlarda iyi şekil doğruluğuna sahip saf matris yapıları üretmek için özelleştirilmiş bir biyo-baskı stratejisi sunmaktadır.

Translasyonel Araştırma için Çözünür Bazal Membran Ekstraktının Biyobaskısı için Hacimsel Ekstrüzyon Biyoyazıcısının Tasarımı ve Validasyonu

Keşfedin, damsal geçirgenliği modelleri için çok malzemeli biyobaskı teknolojisiyle standart altı kuyulu plakalarda yüksek verimli damar kanalı üretimini. Bu yöntem, endotel hastalıkları için terapötik gelişimi hızlandırır.

Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi (Video) | JoVE Journal

Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi

Daha fazla video keşfet