Name: Hipoksiye Duyarlı Kimerik Antijen Reseptörü-T Hücrelerinin Üretimi ve Fonksiyonel Doğrulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Öğrenin, hipoksi duyarlı kimerik antijen reseptörü-T hücrelerinin üretim ve fonksiyonel doğrulama protokolünü. Lentivirüs tabanlı yöntemle tümör mikroçevresinde seçici sitotoksisite ve güvenlik profili artırılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada, HER2'yi (Gen Kimliği: 2064) hedefleyen hipoksiye duyarlı bir CAR olan HER2-BBz-ODD, normal muadili HER2-BBz ile karşılaştırıldı. İki CAR'ın şemaları Şekil 1A'da gösterilmiştir, bu da HER2-BBz-ODD'nin, ODD dizisinin CD3ξ'nin C-terminaline eklenmesiyle HER2-BBz'den türetildiğini göstermektedir. İki CAR'ı ifade eden lentiviral vektörlerin inşası ve 293T hücre transfeksiyonu ile karşılık gelen lentivirüsün üretilmesi daha önce tarif edilmiştir31.
1. Lentiviral enfeksiyon ile hipoksiye duyarlı CAR-T hücrelerinin üretilmesi
<ol><li>Dondurularak korunmuş insan periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) bir su banyosunda 37 ° C'de hızla çözün. Çözülmüş PBMC'leri, 400 IU IL-2, 5 ng / mL IL-7 ve 10 ng / mL IL-15 (insan T hücresi büyüme ortamı, daha sonra TGM olarak anılacaktır) ile takviye edilmiş 9 mL serumsuz lenfosit kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücre sayımı için bir alikot aldıktan sonra, tüpü 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Peletlenmiş PBMC'leri TGM ile 4 × 106 hücre/mL yoğunlukta yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 6 oyuklu bir plakaya aktarın.</li>
	<li>Anti-hCD3 / hCD28 kaplı immünoboncuklar hazırlayın.<ol><li>100 μL fare IgG manyetik boncuklarını 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve PBS'li manyetik bir stand kullanarak 2 kez yıkayın.</li>
		<li>Boncukları 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve 0.2 μg fare anti-İnsan CD3 antikoru ve 2 μg fare anti-İnsan CD28 antikoru ekleyin. Karışımı bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın ve gece boyunca 4 °C'de sallayın.</li>
		<li>Boncukları PBS'li manyetik bir stand kullanarak 2 kez yıkayın ve 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Anti-hCD3 / hCD28 kaplı immünoboncukları, 1.2. adımda, 1: 1'lik bir boncuk-hücre oranında plakaya ekleyin. Plakayı 37 °C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>48 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri bir pipetle hafifçe karıştırdıktan sonra hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 3 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin, ardından PBMC'lerden immünoboncukları çıkarmak için süpernatanı dikkatlice 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücre sayımı için bir alikot alın, ardından PBMC'leri 300 μL TGM içinde 5 ×10 5 hücre / kuyuda 48 oyuklu düz bir plakaya tohumlayın. İlgili oyuklara 200 μL lentiviral stok ekleyin ve 10 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar protamin sülfat ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 1,5 saat boyunca 32 ° C'de 1.000 × g'da santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak her bir kuyucuktan 300 μL süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. Ardından, bir pipet kullanarak 1 mL taze TGM ekleyin ve plakayı 37 °C'de %5CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Hücre yoğunluğunu her 2-3 günde bir 0.5-2 × 106 hücre / mL'ye ayarlamak için taze TGM ekleyin. Hücreleri önce 12 oyuklu bir plakaya ve ardından 6 oyuklu bir plakaya aktararak başlayın. Toplam sayı 4 mL'lik bir hacimde 6 × 106'ya ulaşana kadar hücreleri kültürlemeye devam edin. NOT: Paralel olarak, TGM'nin% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren RPMI1640 besiyeri ile değiştirilmesi dışında, yukarıda açıklanan prosedürlerin aynısını izleyerek Jurkat T hücrelerinin CAR transdüksiyonunu gerçekleştirin.</li>
</ol>2. Akış sitometrisi kullanılarak CAR-T hücrelerinde oksijene bağımlı CAR ekspresyonunun değerlendirilmesi
<ol><li>CAR ile dönüştürülmüş T hücrelerini adım 1.8'den 2 mL TGM'de 2.5 × 106 hücre / kuyu yoğunluğunda iki adet 12 oyuklu plakaya yerleştirin. Bir plakayı doğrudan 37 ° C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin (normoksik durum, hücrelerin kültürlenmesi için standart koşul% 21O2'ye sahiptir) ve diğer plakayı mobil bir CO2 / O2 / N2 inkübatör odasına yerleştirin O2 seviyesi %1'de önceden ayarlanmış (hipoksik durum) ve ardından odayı nemlendirilmiş bir yerde tutun, 37 °C'de %5 CO2</li><li></li><li><li></li><li><li><li><ol><li></li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li><li><li><li><li><li></ol><ol><li></li><li><li> </li><li><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;"></li></ol><ol><li> </li><li><li><li><li> </li><li><li><li><li><li></li></ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Seçici Tümörler için Hipoksiye Duyarlı CAR-T Hücrelerinin Fonksiyonel Validasyonu

<ol><li>Boardman, A. P., Salles, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+in+large+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma.</a> Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).</li>
<li>Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T%3A+What+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CAR-T: What is next.</a> Cancers. 15 (3), 663(2023).</li>
<li>Barsan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+utilisation+and+outcomes+across+refractory%2C+first+relapse+and+multiply+relapsed+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+A+retrospective+analysis+of+real-world+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22eClinicalMedicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns.</a> eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+delivery+of+dual+CAR+targets+of+CD19+and+BCMA+as+well+as+immunomodulators+to+enhance+therapeutic+efficacy+in+solid+tumors+combined+with+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy.</a> Front Oncol. 12, 1037934(2022).</li>
<li>Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speed+and+location+both+matter%3A+Antigen+stimulus+dynamics+controls+CAR-T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response.</a> Front Immunol. 12, 748768(2021).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+anti-solid+tumor+efficacy+of+CAR-T+cells+by+inhibiting+adenosine+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).</li>
<li>Derenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+strategies+to+enhance+CAR+T+cell+persistence+for+patients+with+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors.</a> Front Immunol. 10, 218(2019).</li>
<li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+techniques+for+enhancing+CAR+T+cell+therapy+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors.</a> Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).</li>
<li>Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+immunosuppression%3A+A+roadblock+to+CAR+T-cell+advancement+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors.</a> Cells. 11 (22), 3626(2022).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+tumor+immune+microenvironment+and+its+optimization+from+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy.</a> Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+tumor+physical+microenvironment+for+fueling+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).</li>
<li>Martinez, M., Moon, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+for+solid+tumors%3A+New+strategies+for+finding%2C+infiltrating%2C+and+surviving+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment.</a> Front Immunol. 10, 128(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunosuppressive+microenvironment+and+immunotherapy+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma.</a> Front Immunol. 13, 1003651(2022).</li>
<li>Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+cells+in+cancer%3A+Mechanisms+and+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR+T+cells+for+enhanced+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety.</a> APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).</li>
<li>Al-Haideri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+combination+therapy%3A+The+next+revolution+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment.</a> Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).</li>
<li>Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+chimeric+antigen+receptor+T-cell+efficacy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors.</a> Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+-+assessment+and+management+of+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities.</a> Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).</li>
<li>Mi, J., Ye, Q., Min, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+nanotechnology+development+to+overcome+current+roadblocks+in+CAR-T+therapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors.</a> Front Immunol. 13, 849759(2022).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+Current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+Safety+strategies+to+overcome+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity.</a> Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+Early+successes+in+blood+cancer+and+challenges+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors.</a> Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).</li>
<li>Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+to+overcome+current+challenges+in+multiple+myeloma+CAR+T-cell+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment.</a> Front Oncol. 10, 1362(2020).</li>
<li>Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+next-generation+car-t+cells+for+better+toxicity+management%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management.</a> Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).</li>
<li>Flugel, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+on-target%2C+off-tumour+toxicity+of+CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).</li>
<li>Rababah, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+therapy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors.</a> Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).</li>
<li>Masoud, G. N., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif-1alpha+pathway%3A+Role%2C+regulation+and+intervention+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy.</a> Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+hif-1+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting hif-1 for cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia--a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).</li>
<li>Juillerat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+sensitive+self-decision+making+engineered+CAR+T-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell.</a> Sci Rep. 7, 39833(2017).</li>
<li>Liao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+T+cells+with+hypoxia-inducible+chimeric+antigen+receptor+%28HiCAR%29+for+selective+tumor+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing.</a> Biomark Res. 8 (1), 56(2020).</li>
<li>Ivan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif%CE%B1+targeted+for+vhl-mediated+destruction+by+proline+hydroxylation%3A+Implications+for+o2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing.</a> Science. 292 (5516), 464-468 (2001).</li>
<li>Wang, G. L., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).</li>
<li>D'alonzo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+noninvasive+preclinical+tumor+hypoxia+imaging+methods%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review.</a> Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+car-t+cells+by+hypoxia-inducible+transcription+amplification+%28hita%29+system+significantly+enhances+systemic+safety+and+retains+antitumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy.</a> J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).</li>
<li>Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+hypoxia-mediated+escape+from+adaptive+immunity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells.</a> Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).</li>
<li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+metabolism%3A+Cancer%27s+achilles%27+heel%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel.</a> Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Santrifüj tüpü</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>Süpernatanlar ve hücreler cellection Protokolü Adım 2,3,4</td></tr><tr><td>%10 ExpressCast PAGE</td><td>NCM biotech</td><td>P2012</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>NCM biyoteknoloji</td><td>20220812</td><td>Hücre kültürü Protokolü Adım 4</td></tr><tr><td>10 mL pipet</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>Pipetleme Protokol Adım 1</td></tr><tr><td>10xTRIS-Glisin-SDS elektroforez tamponu</td><td>Epizyme</td><td>3673020</td><td>İmmünoblotlama Protokol Adım 3</td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj tüpü</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Süpernatanlar ve hücreler cellection Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>25 cm2 EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>Hücre kültürü Protokol Adım 3,4</td></tr><tr><td>4x Protein SDS SAYFASI Yükleme Tamponu</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>6 oyuklu düz tabanlı doku kültürü plakaları</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>T Hücre kültürü Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>96 oyuklu siyah düz tabanlı doku kültürü plakaları</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>Sitotoksisite testi Protokolü Adım 4</td></tr><tr><td>96 oyuklu ELISA plakaları</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>ELISA Protokolü Adım 5</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka çalkalayıcı</td><td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>Shake Protokolü Adım 4</td></tr><tr><td>96 oyuklu U-alt doku kültürü plakaları</td><td>Thermo Scientific</td><td>268200</td><td>Süpernatanlar cellection Protokolü Adım 4,5</td></tr><tr><td>anti-FLAG antikoru</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>Karbinol</td><td>Sinopharm</td><td>10010061</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>Karbondioksit inkübatörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>Hücre kültürü Protokolü Adım 1,2,3,4</td></tr><tr><td>Hücre sayma plakası</td><td>Hausser scientific</td><td>1492</td><td>Hücre sayımı Protokolü Adım 1,3,4</td></tr><tr><td>CELLection Pan Mouse IgG Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>11531D</td><td>Fare IgG manyetik boncuk Protokol Adım 1</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>Hücre kültürü Protokol Adım 1,3,4</td></tr><tr><td>Kemilüminesans jel görüntüleme sistemi</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>Kobalt klorür çözeltisi (0.5 M)</td><td>biyosıçrayıcı</td><td>BR4000203</td><td>Hipoksik durum Protokol Adım 2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103- CV</td><td>Hücre kültürü Protokolü Adım 4</td></tr><tr><td>Elektronik terazi</td><td>Sartorius</td><td>PRACTUM612-1CN</td><td>tartım Protokolü Adım 5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>Hücre kültürü Protokolü Adım 3,4</td></tr><tr><td>GAPDH Fare mAb</td><td>ABklonal</td><td>AC002</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>Jel elektroforez cihazı</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>GloMax Mikroplaka Okuyucular</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td>lusiferaz aktivite ölçümü Protokolü Adım 4</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H+L)</td><td>Yeasen</td><td>P1126151</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı mikrodondurma santrifüjü</td><td>eppendorf</td><td>5810&nbsp; R</td><td>Hücre kültürü Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>İnsan IFN-&gama; ELISA Set</td><td>BD</td><td>555142</td><td>ELISA Protokolü Adım 5 Öğeler: Rekombinant İnsan IFN-&gama; Liyofilize Standart, Tespit Antikoru, Biyotin, Anti-İnsan IFN-&gama; , Yakalama Antikoru Saflaştırılmış Anti-İnsan IFN-&gama;, Enzim Reaktifi Streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugatı (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>İnsan IL-2 ELISA Seti</td><td>BD</td><td>555190</td><td>ELISA Protokolü Adım 5 Öğeler: Rekombinant İnsan IL-2 Liyofilize Standart, Tespit Antikoru Biyotin Anti-İnsan IL-2, Yakalama Antikoru Saflaştırılmış Anti-İnsan IL-2, Enzim Reaktifi Streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugatı (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>P40933</td><td>T Hücre kültürü Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>IL-21</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CC45</td><td>T Hücre kültürü Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& D sistemleri</td><td>P13232</td><td>T Hücre kültürü Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Hücre kültürü Protokolü Adım 1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>CAR-Jurkat yapı Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>LSRFortessa</td><td>Akış sitometrisi Protokolü Adım 2</td></tr><tr><td>Lusiferaz Test Sistemi</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>lusiferaz raportör testi Protokolü Adım 4 Öğeler: Pasif lizis tamponu, ateşböceği lusiferaz substratı</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>HTX</td><td>ELISA Protokolü Adım 5</td></tr><tr><td>mobil CO2 / O2 / N2 Kuluçka Odası</td><td>Çin İnovasyon Instrument Co., ve Tic. Ltd. Şti</td><td>Smartor118</td><td>Hipoksik durum Protokolü Adım 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Fare Anti-Hexa Histidin etiketi</td><td>Sigma</td><td>SAB2702218</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>NcmBlot Hızlı Transfer Tamponu</td><td>NCM biyoteknoloji</td><td>WB4600</td><td>İmmünoblotlama</td></tr><tr><td>NcmECL Ultra</td><td>NCM biyoteknoloji</td><td>P10300</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3 Öğeler: NcmECL Ultra Luminol/Arttırıcı Reaktif (A), NcmECL Ultra Stabilize Peroksit Reaktifi (B)&nbsp;</td></tr><tr><td>NovoNectin kaplı 48 oyuklu düz plakalar</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CH38</td><td>CAR-T hücreleri yapısı Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>OPD (o-fenilendiamin dihidroklorür) tablet seti</td><td>Sigma</td><td>P9187</td><td>Substrat Reaktifi Protokolü Adım 5 Öğeler: OPD tablet (gümüş folyo), üre hidrojen peroksit tableti (altın folyo),</td></tr> <tr><td>PE konjuge anti-DYKDDDDK</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>Akış sitometrisi Protokolü Adım 2</td></tr><tr><td>Protamin sülfat</td><td>Sigma</td><td>P3369-1OG</td><td>Lentivirus enfeksiyonu Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>Protein Marker 10 Kda-250 KDa</td><td>Epizyme</td><td>WJ102</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>&nbsp; Saflaştırılmış NA/LE Fare Anti-İnsan CD3</td><td>BD</td><td>566685</td><td>T Hücreleri kültürü Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış NA/LE Fare Anti-İnsan CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td>T Hücreleri kültürü Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>PVDF membran</td><td>Kırlangıç</td><td>168627</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>Hücre kültürü Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>Yağsız süt tozu</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>İmmünoblotlama Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>SKOV3-Luc</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Sitotoksisite testi Protokolü Adım 4</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>NCM biyoteknoloji</td><td>C125C1</td><td>Hücre kültürü Protokolü Adım 4</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Immunoblotting Protokolü Adım 3</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>keelrein</td><td>NB014467</td><td>Isıtma Protokolü Adım 1</td></tr><tr><td>X-VIVO 15&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>Serumsuz lenfosit kültürü ortamı Protokolü Adım 1</td></tr></tbody></table>

hipoksiye duyarlı kimerik antijen reseptörü-t hücrelerinin Üretimi ve fonksiyonel doğrulaması

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

HIF-1α'nın ODD alanını CAR parçasına kaynaştırmak, hipoksiye duyarlı bir CAR oluşturmak için birincil stratejiyi temsil eder. Bu çalışmada analiz edilen ve HER2-BBz-ODD olarak adlandırılan hipoksiye duyarlı HER2 hedefleme CAR, ODD dizisinin geleneksel HER2-BBz'ye entegre edilmesiyle bu strateji kullanılarak oluşturulmuştur (Şekil 1A). Bu çalışmada, HER2-BBz-ODD CAR veya HER2-BBz CAR'ı eksprese etmek için lentiviral transdüksiyon kullandık ve daha sonra oksijen duyarlılıklarını iki hücre tipinde inceledik: insan PBMC'leri ve Jurkat T hücreleri.
İlk inceleme, hem CAR'dan dönüştürülmüş PBMC'den türetilmiş T hücrelerinde akış sitometrisi ile hem de CAR'dan dönüştürülmüş Jurkat T hücrelerinde western blotlama ile gerçekleştirilen normoksik koşullara karşı hipoksik koşullar altında CAR'ın ekspresyonudur. CAR ile transdüksiyonlu PBMC'den türetilmiş T hücrelerinin ortamında, HER2-BBz-ODD CAR'ın hem CAR-pozitif hücrelerin yüzdesi hem de medyan floresan yoğunluğu (MFI) açısından %1O2'nin altında !'in altında anlamlı derecede daha yüksek ekspresyona sahip olduğunu gözlemledik (Şekil 1B). CAR ile transdüksiyonlu Jurkat T hücrelerinin immünoblotlama analizi, HER2-BBz-ODD'nin hipoksiye bağlı indüksiyonunu da doğruladı.
Bu bağlamda, hipoksik durumun, kültür ortamına kimyasal bir hipoksi indükleyicisi olan CoCl2 eklenerek uygun bir şekilde taklit edilebileceğini belirtmek önemlidir. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, immünoblotlama sonuçlarımız, 50 veya 200 μM CoCl2'ye maruz kalmanın,% 1O2'ye maruz kalmanın etkisini özetlediğini ve HER2-BBz-ODD CAR'ın ekspresyonunu belirgin bir şekilde indüklediğini, ancak HER2-BBz CAR'ınkini indüklemediğini göstermiştir. Hipoksiye duyarlı CAR'ın fonksiyonel karakterizasyonu PBMC'den türetilen CAR-T hücreleri ile gerçekleştirildi. Çalışmada, hedef hücre hattı olarak ateşböceği lusiferaz taşıyan bir SKOV-3 hücre hattı kullanıldı. Bu kurulum, ko-kültürlenmiş CAR-T hücrelerinin aracılık ettiği sitotoksisiteyi değerlendirmek için bir vekil olarak hedef hücre ile ilişkili lusiferaz aktivitesini ölçmemize izin verdi.
Şekil 1D'de gösterildiği gibi, ölçümler, atmosferin normoksik veya hipoksik olmasına bakılmaksızın, HER2-BBz CAR-T hücrelerinin hedef hücreleri etkili bir şekilde öldürdüğünü göstermiştir. Buna karşılık, HER2-BBz-ODD CAR-T hücreleri, incelenen üç E: T oranının tümü için normoksik koşullar altında önemli ölçüde daha zayıf sitotoksisite göstermiştir. Bununla birlikte, hipoksik koşullara maruz kaldıklarında sitotoksisiteleri önemli ölçüde artmıştır. IL-2 ve IFN-γ'nin süpernatan seviyeleri, CAR-T hücrelerinin hedef hücrelerle 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesinden sonra ELISA ile ölçüldü. Her iki sitokin için, sitotoksisite verileriyle tutarlı olan HER2-BBz-ODD CAR-T hücreleri için !O2'ye kıyasla %1O2'nin altında daha yüksek sekresyon gözlenmiştir. Buna karşılık, HER2-BBz CAR-T hücreleri, ! O2'ye kıyasla %1O2'nin altında iki sitokinin daha düşük salgılandığınıgösterdi, bu da hipoksinin hücresel aktivite üzerinde olumsuz bir etkisini gösterir (Şekil 1E). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar HER2-BBz-ODD CAR'ın hipoksiye duyarlı doğasını ikna edici bir şekilde doğruladı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66697/66697fig01.jpg"> Şekil 1: Hipoksiye duyarlı CAR-T hücrelerinin yapımı ve karakterizasyonu. (A) Hipoksiye duyarlı bir CAR, HER2-BBz-ODD ve geleneksel muadili HER2-BBz'nin tasarımlarının şematik gösterimi. Her iki CAR da bir N-terminal CD8α sinyal peptidi, bir FLAG etiketi, bir insan HER2 hedefleme scFv, bir CD8 menteşe ve transmembran alanı ve 4-1BB'den bir kostimülatör alandan oluşan bir hücre içi kısım, bir CD3ξ sinyal alanı, bir IRES ve bir EGFP'den oluşur. HER2-BBz-ODD, bir ODD alanının CD3ξ sinyal alanının C-terminaline füzyonunda HER2-BBz'den farklıdır ve normoksik koşullar altında ubikitine bağımlı bozunmasını teşvik ederek hipoksik bağımlı ifadesine izin verir. (B,C) HER2-BBz-ODD CAR'IN oksijene bağlı ekspresyonunun değerlendirilmesi. (B) Akış sitometrisi kullanılarak 24, 48 veya 72 saat boyunca% 1 veya% 21 O2'nin altında kültürlendikten sonra insan PBMC'den türetilen CAR-T hücreleri ile bir değerlendirme yapıldı. (C) Diğer değerlendirme, hücre lizatlarının ! O2, 50 veya 200 μM CoCl2 veya %1 O2 altında kültürlendikten 24 saat sonra hasat edildiği ve HER2-BBz CAR ile dönüştürülmüş hücreler kontrol olarak dahil edilerek western blotlama kullanılarak CAR ekspresyonu için analiz edildiği CAR ile dönüştürülmüş Jurkat T hücreleri ile yapıldı. (D,E) Farklı oksijen koşulları altında CAR-T hücrelerinin in vitro sitotoksisitesi ve sitokin salgılanması. (D) CAR-T hücreleri, %1 veya !O2'nin altında belirtilen E:T oranlarında ateşböceği lusiferaz eksprese eden SKOV3 hücreleri ile birlikte kültürlendi. 24 saatlik birlikte kültürlemeden sonra, hedef hücre öldürme verimliliği, hücre ile ilişkili ateşböceği lusiferaz aktivitesindeki değişimin, transdüksiyon yapılmamış T hücrelerine göre ölçülmesiyle belirlendi. (E) Süpernatanlar, salgılanan IL-2 ve IFN-γ'nin tespiti için toplandı. Sonuçlar ortalama ± SEM (n = 3 sağlıklı donör) (****p &lt; 0.0001) olarak görüntülenir. Kısaltmalar: scFv = tek zincirli parça değişkeni; CAR = kimerik antijen reseptörü. C ve D panelleri Liao ve ark.31'den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66697/66697fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Hipoksiye Duyarlı Kimerik Antijen Reseptörü-T Hücrelerinin Üretimi ve Fonksiyonel Doğrulaması

Extensive studies have proven the promise of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy in treating hematological malignancies. However, treating ...

generation-functional-verification-hypoxia-sensitive-chimeric-antigen

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin ex vivo üretilmesi için kullanılan bir teknik gösterilmektedir. İnsan T hücreleri, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile kaplanmış manyetik boncuklar ve interlökin-2 (IL-2) ile takviye edilmiş bir ortam ile inkübe edilir ve bu da T hücresi aktivasyonuna ve çoğalmasına yol açar. Transgenik RNA'nın konakçı genomuna entegre olmasına ve transgeni eksprese etmesine izin veren transgenik lentiviral vektörler tanıtılır. Bu, transdüksiyona...

Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Üretmek için Ex Vivo Bir Teknik

Bu videoda, tümör antijenine özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin ex vivo üretimi için bir teknik gösterilmektedir. Transgenik RNA taşıyan retroviral vektörler, T hücresi sağkalımını ve proliferasyonunu teşvik etmek için interlökin-2 ile takviye edilmiş bir ortamda dalak hücreleri ile karıştırılır. Karışım daha sonra rekombinant insan fibronektin fragmanları ile kaplanmış bir plakaya aktarılır ve virüsün hücre ile füzyonunu kolaylaştırmak için santrifüjlenir, bu da RNA'nın...

Tümöre özgü kimerik antijen reseptör T hücreleri oluşturmak için bir ex vivo teknik

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Bu protokol, klinik olarak mevcut bir platformla kimerik antijen reseptörlerini in vivo olarak eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücrelerini invaziv olmayan bir şekilde izleme metodolojisini açıklamaktadır.

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

Bu protokol, İyi Üretim Uygulamaları (GMP) standartlarıyla uyumluluğu sağlayarak, ilgilenilen bir gen ile birincil insan T hücrelerinin dönüştürülmesi sürecini ana hatlarıyla belirtir.

Geni Değiştirilmiş T hücrelerinin Üretimi için GMP Uyumlu Bir Prosedür

Bu makale, klinik kullanım için kimerik antijen reseptörü T hücreleri için, özellikle viral transdüksiyon ve T hücrelerinin kültivasyonunu gerçekleştirebilen otomatik bir hücre işlemcisi kullanarak üretim sürecini detaylandırmaktadır. Erken aşama bir klinik araştırmanın süreç geliştirme ve uygulaması sırasında göz önünde bulundurulması gereken önerilerde bulunuyor ve tuzakları açıklıyoruz.

Otomatik Hücre İşlemcisinde Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi Üretimi

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Bu protokol, kanser immünoterapisi için entegre olmayan mRNA kullanarak geçici kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için ayrıntılı bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir ve CAR-T hücrelerini ve sitotoksik işlevlerini değerlendirmek için güvenilir yöntemler sağlar.

Kanser İmmünoterapisi için mRNA Kullanarak Geçici Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Oluşturmak İçin Viral Olmayan Bir Yaklaşım

Anöploidi sonunda karmaşık karyotypes içeren hücre döngüsü tutuklandı hücreleri üreten genom istikrarsızlık yol açar. Bu kağıt aneuploid hücreleri bölmek için ateşkes karmaşık karyotypes ile izole etmek için basit ve uygun bir yöntem sağlar.

Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Öğrenin, hipoksi duyarlı kimerik antijen reseptörü-T hücrelerinin üretim ve fonksiyonel doğrulama protokolünü. Lentivirüs tabanlı yöntemle tümör mikroçevresinde seçici sitotoksisite ve güvenlik profili artırılır.

Hipoksiye Duyarlı Kimerik Antijen Reseptörü-T Hücrelerinin Üretimi ve Fonksiyonel Doğrulaması

Daha fazla video keşfet